Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatisk separasjon og innsamling av kreftrelaterte stoffer fra kliniske prøver
Chapters
Summary January 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette papiret beskriver anvendelsen av automatisert utstyr for enkelt og effektivt å skille og samle stoffer, for eksempel cellefritt DNA og sirkulerende tumorceller, fra fullblod.
Transcript
Protokollen vår er brukervennlig. Ved hjelp av denne teknikken kan hvem som helst enkelt isolere komponent fra blodet. Forurensning kan minimeres og materialer kan separeres nøyaktig.
Med automatisering og etablering av denne protokollen kan forskere enkelt få tak i kreftrelaterte stoffer med høy renhet, noe som er nyttig for ulike nedstrømsstudier. Spesielt forventes det å gi viktige fordeler for sluttbrukerundersøkelser. Demonstrere sin prosedyre vil være Jay Jeong, seniorforsker og assisterende leder ved Cancer Genomics Research Institute.
For å begynne, legg i LBx 1-kassetten ved å velge kassetttype på instrumentets berøringsskjermpanel. Trykk på pilknappen for å endre antall prøver. Deretter åpner du instrumentdøren og setter inn alle patronene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen.
For totalt fire kassetter, plasser dummypatronen i det tomme rommet på kassettholderen. Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den. Lukk døren, og trykk på kjøreknappen på berøringsskjermen.
Instrumentet lukker ventilene på patronene, noe som tar omtrent 30 sekunder. Følg meldingen for å åpne døren. Fjern støttehjulet og fjern den ventillukkede kassetten fra kassettholderen.
Pipette maksimalt 10 milliliter av en fullblodprøve ved hjelp av en serologisk pipette. Sett pipettespissen dypt inn i prøveinnløpet på sylinderampullen, og injiser sakte fullblodprøven. Etter at du har satt patronene inn i instrumentet, lukker du døren til instrumentet og trykker på OK-knappen.
Plasma og buffy strøk skilles automatisk fra fullblod, noe som tar omtrent 30 minutter. Når plasma- og buffy-pelsen er skilt, vises en melding på skjermen ledsaget av en alarmlyd. Stopp alarmen ved å åpne døren eller trykke på stoppknappen.
Åpne døren. Fjern kassetten og legg den på bordet. Gjenopprett tre milliliter plasma fra plasmautløpet ved hjelp av en milliliter pipettespiss.
Deretter gjenvinner du tre milliliter av buffycoaten fra buffycoatutløpet ved hjelp av en pipettespiss på én milliliter. Deretter legger du i LBx 2-kassetten ved å velge navnet på kassetten på instrumentets berøringsskjermpanel. Trykk på pilknappen for å endre antall prøver, og følg samme fremgangsmåte som vist for at LBx 1-kassetten skal sette inn kassetten i kassettholderen.
Etter at du har satt inn kassetten og lukket døren, trykker du på run-knappen på berøringsskjermen. Følg fremgangsmåten som er vist tidligere for å fjerne den ventillukkede sylinderampullen fra sylinderampulleholderen og plassere den på bordet. Pipetter tetthetsgradientløsningen ved hjelp av en serologisk pipette.
Sett pipettespissen dypt inn i sylinderampullens innløp og injiser oppløsningen langsomt. Deretter pipetter fullblodprøven og injiser den sakte inn i prøveinnløpet. Etter at du har satt inn og sikret kassetten, lukker du døren og trykker på OK-knappen.
Når plasma og PBMC automatisk skilles fra fullblod, vises en melding ledsaget av en alarmlyd. Åpne døren og fjern kassetten. Gjenopprett tre milliliter plasma fra plasmautløpet ved hjelp av en milliliter pipettespiss, og gjenopprett deretter tre milliliter av PBMC fra PBMC-utløpet.
På samme måte, for FAST-auto-patronen, etter å ha fjernet den ventillukkede patronen fra kassettholderen, injiserer du seks milliliter av PBS-løsningen i PBS-innløpet til kassetten. Deretter pipetter tre milliliter fullblod eller buffy frakk oppnådd fra LBx 1, eller PBMC prøve oppnådd fra LBx 2, og sakte injisere prøven inn i prøveinnløpet til patronen. Etter å ha satt inn patronen og sikret den, lukk døren og trykk på OK-knappen.
Når den automatiske anrikningen av CTC-er er fullført, stopper du alarmen. Fjern kassetten og sett bakplatefjerneren, eller BPR, inn i de fire hullene på forsiden av kassetten. Trykk på den mørkeblå vingen med tommelen på begge hender, og trykk deretter på den lyseblå kroppen til den klikker.
Fjern patronkroppen forsiktig ved å løfte den. Veldig forsiktig, plukk opp filtermembranen ved kanten ved hjelp av en pinsett, og legg membranen i et 1, 5 milliliter rør for nukleinsyrepreparasjon, eller på et lysbildeglass for fargingen. Om nødvendig, gjenopprett det filtrerte blodet til bloduttaket ved hjelp av en milliliter pipettespiss.
De ekstraherte cfDNA-ene ble evaluert ved hjelp av Bioanalyzer, og cfDNA-skjermbånd ble brukt sammen med en elektronisk stige. Den grønne linjen ble brukt til å justere stigen og prøven. Trekantmerkene indikerer DNA-båndet.
De fleste cfDNA har en lengde på 166 basepar, og noen finnes i heltallsmultipler av lengde. Vanligvis måler konsentrasjonen av cfDNA opp til størrelsen på 50 til 700 basepar. Selv om det er en forskjell i mengden oppnådd fra hver enkelt prøve, for eksempel 8, 47 nanogram per milliliter og 5, 2 nanogram per milliliter, var resultatene av cfDNA-ekstraksjon gode for både konsentrasjon og størrelsesfordeling i alle tilfeller.
Disse resultatene indikerer at LBx 1-metoden nøyaktig separerer plasma som inneholder cfDNA. I FAST-auto ble membranen fjernet og farget med fluorescerende antistoffer for å påvise CTC og hvite blodlegemer. Den fargede membranen, plassert på glassglass, ble observert under et fluorescensmikroskop.
Etter membranfarging viser celler DAPI- eller kjerne-positive signaler i blått, mens EpCAM og CK eller CTCs-positive er uthevet i grønt, og CD45- eller WBC-positive er uthevet i rødt. Det er ikke vanskelig å fjerne membranen. Det er imidlertid nødvendig å være forsiktig med tap og forurensning av CTC.
Fullblod, PBMC og buffy frakk er alle tilgjengelige. I stedet trenger du bare å stille inn hele volumet. Andre væsker kan også brukes, selv om testing vil være nødvendig.
Denne teknikken kan betjenes direkte på sykehus, og stoffet kan oppnås raskt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
