Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatisk separation och insamling av cancerrelaterade ämnen från kliniska prover
Chapters
Summary January 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta dokument beskriver tillämpningen av automatiserad utrustning för att enkelt och effektivt separera och samla ämnen, såsom cellfritt DNA och cirkulerande tumörceller, från helblod.
Transcript
Vårt protokoll är användarvänligt. Med hjälp av denna teknik kan vem som helst enkelt isolera komponent från blodet. Föroreningar kan minimeras och material kan separeras exakt.
Med automatisering och upprättandet av detta protokoll kan forskare enkelt få cancerrelaterade ämnen med hög renhet, vilket är till hjälp för olika nedströmsstudier. I synnerhet förväntas det ge viktiga fördelar för slutanvändarens forskning. Demonstrerar deras procedur kommer att vara Jay Jeong, seniorforskare och biträdande chef vid Cancer Genomics Research Institute.
För att börja, ladda LBx 1-patronen genom att välja patrontyp på instrumentets pekskärmspanel. Tryck på pilknappen för att ändra antalet prover. Öppna sedan instrumentluckan och sätt i alla patroner som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren.
För totalt fyra patroner, placera provdockans patron i patronhållarens tomma utrymme. Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Stäng dörren och tryck på körknappen på pekplattans skärm.
Instrumentet stänger ventilerna på patronerna vilket tar cirka 30 sekunder. Följ meddelandet för att öppna dörren. Ta bort stödhjulet och ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren.
Pipettera högst 10 ml av ett helblodsprov med användning av en serologisk pipett. För in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens provinlopp och injicera långsamt hela blodprovet. När du har satt in patronerna i instrumentet stänger du instrumentets dörr och trycker på OK-knappen.
Plasma- och buffyrockar separeras automatiskt från helblod, vilket tar cirka 30 minuter. När plasma- och buffy-kappan har separerats visas ett meddelande på skärmen tillsammans med ett larmljud. Stoppa larmet genom att öppna dörren eller trycka på stoppknappen.
Öppna dörren. Ta bort patronen och placera den på bordet. Återvinn tre milliliter plasma från plasmautloppet med en en-milliliter pipettspets.
Återställ sedan tre milliliter av buffy-pälsen från buffy-pälsutloppet med en en-milliliters pipettspets. Ladda sedan LBx 2-patronen genom att välja patronnamnet på instrumentets pekskärmspanel. Tryck på pilknappen för att ändra antalet prover och följ samma procedur som visas för LBx 1-patronen för att sätta in patronen i patronhållaren.
När du har satt i patronen och stängt dörren trycker du på körknappen på pekplattans skärm. Följ proceduren som visades tidigare för att ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren och placera den på bordet. Pipettera densitetsgradientlösningen med användning av en serologisk pipett.
Sätt in pipettspetsen djupt in i patronens inlopp och injicera lösningen långsamt. Pipettera sedan hela blodprovet och injicera det långsamt i provinloppet. När du har satt i och säkrat patronen stänger du dörren och trycker på OK-knappen.
När plasma och PBMC automatiskt separeras från helblod visas ett meddelande åtföljt av ett larmljud. Öppna dörren och ta bort patronen. Återvinn tre milliliter plasma från plasmautloppet med hjälp av en en-milliliters pipettspets och återvinn sedan tre milliliter PBMC från PBMC-utloppet.
På samma sätt, för FAST-auto-patronen, efter att ha tagit bort den ventilslutna patronen från patronhållaren, injicera sex milliliter PBS-lösningen i patronens PBS-inlopp. Pipettera sedan tre milliliter helblod eller buffy coat erhållet från LBx 1, eller PBMC-prov erhållet från LBx 2, och injicera långsamt provet i provinloppet till cylinderampullen. När du har satt i patronen och säkrat den stänger du dörren och trycker på OK-knappen.
När den automatiska anrikningen av CTC är klar, stoppa larmet. Ta bort patronen och sätt in bakplattborttagaren, eller BPR, i de fyra hålen på patronens framsida. Tryck på den mörkblå vingen med tummarna på båda händerna och tryck sedan på den ljusblå kroppen tills den klickar.
Ta försiktigt bort patronkroppen genom att lyfta den. Mycket försiktigt, plocka upp filtermembranet vid kanten med en pincett och placera membranet i ett 1,5 ml rör för nukleinsyraberedning eller på ett glidglas för färgningen. Om det behövs, återställ det filtrerade blodet till blodutloppet med hjälp av en milliliter pipettspets.
De extraherade cfDNA:erna utvärderades med hjälp av Bioanalyzer, och CFDNA-skärmband användes tillsammans med en elektronisk stege. Den gröna linjen användes för att rikta in stegen och provet. Triangelmärkena indikerar DNA-bandet.
De flesta CFDNA har en längd på 166 baspar och vissa finns i heltalsmultiplar av längd. Vanligtvis mäter koncentrationen av CFDNA upp till storleken på 50 till 700 baspar. Även om det finns en skillnad i mängden erhållen från varje enskilt prov, såsom 8,47 nanogram per milliliter och 5,2 nanogram per milliliter, var resultaten av CFDNA-extraktion bra för både koncentration och storleksfördelning i alla fall.
Dessa resultat indikerar att LBx 1-metoden exakt separerar plasmainnehållande cfDNA. I FAST-AUTO avlägsnades membranet och färgades med fluorescerande antikroppar för att detektera CTC och vita blodkroppar. Det färgade membranet, placerat på glasskivor, observerades under ett fluorescensmikroskop.
Efter membranfärgning visar celler DAPI eller kärnpositiva signaler i blått, medan EpCAM och CK- eller CTC-positiva markeras med grönt och CD45- eller WBC-positiva markeras med rött. Det är inte svårt att ta bort membranet. Det är dock nödvändigt att vara försiktig med förlust och förorening av CTC.
Helblod, PBMC och buffy coat är alla tillgängliga. Istället behöver du bara ställa in hela volymen. Andra vätskor kan också användas, även om testning kommer att krävas.
Denna teknik kan användas direkt på sjukhus och ämnet kan erhållas snabbt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
