Developmental Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR/Cas9-опосредованный высокоэффективный нацеливание генов в эмбриональных стволовых клетках для разработки моделей мышей, манипулируемых генами
Chapters
Summary August 24th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем протокол для разработки генетически модифицированных моделей мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток, особенно для больших ДНК(KI). Этот протокол настроен с использованием редактирования генома CRISPR / Cas9, что приводит к значительному повышению эффективности KI по сравнению с обычным гомологичным методом линеаризации ДНК, опосредованным рекомбинацией.
Transcript
Производство генетически модифицированных мышей и анализ их фенотипа позволяет нам понять конкретные функции генов в деталях, in vivo. Многочисленные важные результаты были обнаружены с использованием генно-модифицированных моделей животных. Метод, который мы описываем здесь, позволяет длинной ДНК имплантировать стволовые клетки с приемлемой эффективностью без выбора лекарств.
Этот метод полезен не только для фундаментальных наук о жизни, но результаты также будут реализованы в прикладных науках, таких как медицинская наука и наука о животных. Демонстрировать процедуру будут д-р Тихиро Эмори, доцент, и д-р Манабу Одзава, адъюнкт-профессор из моей лаборатории. После приготовления эмбрионального фибробласта мыши приготовьте чашку для культивирования клеток, покрытую желатином, как описано в рукописи, и инкубируйте ее в течение двух часов во влажном инкубаторе.
Удалите желатиновый раствор, дважды вымойте посуду PBS и храните ее при комнатной температуре до использования. Разморозьте митотически инактивированный замороженный запас MEF с помощью водяной бани, закаленной при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты. За день до посева ESC поместите MEF на 60-миллиметровую посуду, покрытую желатином.
Разморозьте замороженную трубку ESC, как показано ранее, и поместите один раз от 10 до пятого ESC на 60-миллиметровую тарелку, содержащую предварительно засеянный MEF. Затем добавьте четыре миллилитра питательной среды ESC и инкубируйте блюдо до тех пор, пока ESC не достигнет 50-70% конфюлюзии. После промывки культивируемого ESC четырьмя миллилитрами PBS переварите их 800 микролитрами 0,25%-трипсина раствора ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.
Как только трипсин инактивируется одним миллилитром ESCM, добавьте один миллилитр свежего ESCM к ячейкам, перенесите среду в трубку и гранулируйте ячейки центрифугированием при 280 G в течение пяти минут. После повторного использования клеток в одном миллилитре свежего ESCM подсчитайте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием трипан-синего цвета. После однократного переноса 10 на пятый ЭСК в новую 1,5-миллилитровую трубку и трижды промывки их PBS центрифугированием, повторно суспендируйте гранулу ESC в 12 микролитрах смеси ДНК Cas9 RNP и хорошо перемешайте путем мягкого пипетирования, чтобы избежать пузырьков.
Затем подавайте взвешенный ESC для электропорации. Затем культивируйте электропорированные ЭСК в 60-миллиметровой чашке, содержащей четыре миллилитра ECSM, с митотически инактивированным MEF и продолжайте ежедневно менять среду. Через три-пять дней после электропорации промыть ЭСК четырьмя миллилитрами PBS, затем переварить их с 800 микролитрами 0,25% трипсина ЭДТА и культивированием во влажном инкубаторе.
После этого добавьте два миллилитра ESCM, чтобы остановить переваривание трипсина. После того, как клеточная смесь гранулирована, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежего ESCM и подсчитайте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием трипана синим цветом. Пропускайте ЭСК в один раз по 10 в третью ячейку на 60-миллиметровую тарелку, содержащую ESCM и питатель MEF.
Убедитесь, что среда меняется до тех пор, пока колония не поднимется. Через пять-семь дней после первого прохождения, после того, как ESCM аспирируется из чашки для культуры ESC, добавьте четыре миллилитра PBS. Используя 20-микролитровую пипетку, подберите одиночные колонии ESC с пятью микролитрами PBS под стереомикроскопом.
Поместите отдельные колонии в лунку круглодонной 96-луночной пластины, содержащей 15 микролитров 0,25% раствора трипсина ЭДТА. После инкубации 96-луночной пластины прекратите переваривание трипсина путем добавления 80 микролитров ESCM и диссоциации колоний ESC в отдельные клетки путем пипетирования. Для генотипирования ПЦР перенесите 40 микролитров суспензии ЭКУ на пластину с желатиновым покрытием, без подачи, 96 скважин, содержащую 50 микролитров ESCM на скважину.
Чтобы получить замороженный запас ЭКУ, переложите оставшиеся 60 микролитров суспензии ЭКУ в колодец из 24 скважин с желатиновым покрытием, содержащий 500 микролитров ESCM и питатель MEF. Запасайте отдельные клоны ЭКУ, культивируемые в 24-луночной пластине, пока они не достигнут 60-80% слияния, и восстанавливайте отдельные клоны ЭКУ путем трипсинизации, как было продемонстрировано ранее. После получения ячейки гранулы методом центрифугирования повторно суспендируют в 500 микролитрах клеточной морозильной среды, чтобы заморозить клетки при минус 80 градусах Цельсия.
Для генотипирования ПЦР культивируйте клоны ЭКУ, как было продемонстрировано ранее, и удаляйте ESCM из каждой скважины путем аспирации перед промывкой ее 100 микролитрами PBS дважды. После аспирации PBS добавляют 100 микролитров лизисного буфера, содержащего протеиназу K, и хорошо перемешивают. Теперь перенесите лизат ESC в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите его в тепловой камере при температуре 65 градусов Цельсия в течение не менее одного часа.
Как только геномная ДНК растворится в 20 микролитрах воды без ДНКазы, определите чистоту и концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. После выполнения геномной ПЦР с использованием локус-специфических наборов праймеров для усиления целевой области, проверьте последовательность и выберите клоны ESC с желаемыми последовательностями выбивания. После спаривания обработанных гормоном самок с самцами ICR и сбора яйцевода поместите собранные яйцеводы в капли FHM и восстановите двухклеточные или четырехклеточные эмбрионы стадии, промыв яйцевод FHM с помощью промывочной иглы, вставленной в инфундибулум.
Вымойте собранные эмбрионы, переместив их в несколько свежих капель FHM с помощью пипетки для рта. Культивируйте эмбрионы в 50 микролитрах капель KSOM на 35-миллиметровой чашке для культивирования клеток, покрытой минеральным маслом, как было показано ранее, в течение одного дня до достижения восьмиклеточной или моруловой стадии. Подготовьте стеклянные пипетки для удержания эмбрионов и инъекции ESC с помощью съемника и микроклепки.
После интеграции удерживающей пипетки, содержащей FHM, в капиллярный держатель, подключенный к микроинжектору, установите его на левой стороне микроманипулятора. Подключите инъекционную пипетку к другому микроинжектору и установите ее с правой стороны. Выровняйте две пипетки прямо в поле зрения микроскопа.
Сделайте пятимикролитровые капли 12%-го поливинилпирролидона и пятимикролитровые капли FHM на одну и ту же крышку 60-миллиметровой посуды, бок о бок. Залейте капли минеральным маслом. Перенесите эмбрионы в пять микролитров капли FHM и добавьте от одного до пяти микролитров суспензии ESC к капле FHM, содержащей эмбрион.
После того, как инъекционная пипетка промыта поливинилпирролидоном, переместите инъекционную пипетку к капле, содержащей эмбрионы и ЭСК. Выберите три отдельных дублета ESC, которые только что закончили свое деление клеток в инъекционной пипетке. Используя удерживающую пипетку, удерживайте восьмиклеточный или эмбрион стадии морулы, который завершил уплотнение путем аспирации, и сделайте отверстие в пеллюцидной зоне пьезоэлектрическим импульсом.
Изгоните шестиклеточный ЭКУ внутрь пеллюцидной зоны и вытащите пипетку из эмбрионов. Промыть эмбрионы, введенные ESC, несколькими каплями KSOM осторожно с помощью пипетки для рта и инкубировать их в новой 50-микролитровой капле KSOM, покрытой минеральным маслом, как показано ранее, пока эмбрионы не разовьются до стадии бластоцисты. Получен ампликон ПЦР размера, специфичного для мишени, и 9 из 22 клонов показали специфическую полосу.
Эти результаты эффективны и воспроизводимы для выбивания генов без какого-либо выбора лекарств. Подбор оптимального размера колоний ЭКУ весьма важен для этой процедуры. Избегайте выбора колоний, которые слишком большие или слишком маленькие.
CRISPR Cas9-опосредованное прямое редактирование генома с использованием зиготы будет применимо для создания простых мышей с нокаутом генов. Этот CRISPR Cas9-опосредованный протокол нацеливания гена ESC облегчает производство различных генетически модифицированных мышей для будущего анализа в области наук о жизни.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
