Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

This content is Free Access.

JoVE Journal Cancer Research

Engineering onkogene heterozygote gain-of-function mutasjoner i humane hematopoietiske stamceller og stamceller

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Journal (Cancer Research)

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Journal (Cancer Research)

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Click here for the English version

Engineering onkogene heterozygote gain-of-function mutasjoner i humane hematopoietiske stamceller og stamceller

Article DOI: 10.3791/64558-v

March 10th, 2023 •

Tommaso Sconocchia¹, Johannes Foßelteder¹, Thomas Köhnke², Ravindra Majeti², Andreas Reinisch^1,3

¹Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, ²Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, ³Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 10th, 2023

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Nye strategier for å trofast modellere somatiske mutasjoner i hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) er nødvendige for å bedre studere hematopoietisk stamcellebiologi og hematologiske maligniteter. Her beskrives en protokoll for å modellere heterozygote gain-of-function-mutasjoner i HSPC-er ved å kombinere bruken av CRISPR/Cas9 og dobbel rAAV-donortransduksjon.

Transcript

Denne metoden tillater presis modellering av tilbakevendende leukemogene gain-of-function mutasjoner i primære humane hematopoietiske stamceller og stamceller og derved undersøker rollen i leukemisk transformasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at den CRISPR-Cas9-baserte mutasjonsteknikken kombineres med introduksjonen av en fluorescerende reporter. Dette tillater unik identifisering, anrikning og sporing av rene heterozygously muterte cellepopulasjoner.

Demonstrere prosedyren vil være Tommaso Sconocchia, en postdoktor fra laboratoriet mitt. For å begynne, design enkeltguiden RNA ved hjelp av det elektroniske Benchling-designverktøyet ved å velge pluss-opprettingsalternativet. Klikk deretter på DNA-sekvens"etterfulgt av importer DNA-sekvenser"og importer fra databaser"alternativ.

Skriv deretter inn ønsket gen og velg menneske som art. Klikk på søkealternativet og velg riktig transkripsjonsimport. Velg regionen av interesse for å introdusere dobbeltstrengsbruddet.

Velg deretter CRISPR"-alternativet på høyre side av skjermen, etterfulgt av design- og analyseguider. Deretter velger du enkelt guide "mens du holder guidelengden til 20 basepar og PAM-sekvens for redigering med SP-Cas9. Velg en guide med høy poengsum på målet og en høy off-target score og bestill enkelt guide RNA som et kjemisk modifisert syntetisk enkeltguide RNA fra en kommersiell leverandør.

For å designe HDR-malen, importer genomsekvensen og kodesekvensen til programvare for molekylær kloning. Fra den genomiske sekvensfilen designer du venstre homologiarm ved å velge, ideelt sett, 400 basepar på den fem primære enden av dobbeltstrengsbruddene og lime inn denne sekvensen i en ny fil. Fra den genomiske sekvensfilen designer du spleiseakseptorsekvensen ved å velge de siste 150 baseparene til det målrettede intronet og lime det inn etter venstre homologiarm.

Fra kodesekvensfilen velger du cDNA av interesse. Codon optimaliserer cDNA og setter det inn etter spleiseakseptorsekvensen. Etter cDNA av interesse, sett inn et tre prime polyadenyleringssignal etter en promotorsekvens for det fluorescerende proteinet.

Sett deretter inn sekvensen for det fluorescerende proteinet og et sekund, men forskjellig polyadenyleringssignal. Fra genomisk sekvensfil designer du høyre homologiarm ved å velge ideelt 400 basepar på de tre primære enden av dobbeltstrengsbruddene og sette inn sekvensen etter den andre polyadenyleringen. Deretter lager du en kopi av hele malen og endrer cDNA av interesse slik at den inneholder sekvensen av ønsket mutasjon.

Bytt det fluorescerende proteinet med et annet fluorescerende protein. Konstruer og klon HDR-malene til AAV-uttrykksvektoren. For rekombinant AAV6 forberedelse, forberede 10 150 millimeter retter hver inneholder 11 millioner HECK293T i 20 milliliter DMEM supplert med 10% FBS, 1% penicillin streptomycin, og 25 millimolar HEPES.

Legg deretter oppvasken i inkubatoren ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid, i 24 timer. Etter forsiktig å kaste bort det gamle mediet, erstatt det med 20 milliliter antibiotikafri DMEM supplert med 10% FBS, 25 millimolar HEPES og ett millimolært natriumbutyrat. Deretter forbereder du to 15 milliliter rør merket rør en og to.

For å røre en, legg til fem milliliter redusert serummedium, 60 mikrogram rekombinant AAV6-mutert HDR-plasmid og 220 mikrogram PDGM6-hjelperplasmid. For å røre to, tilsett fem milliliter redusert serummedium og 1120 mikroliter av en milligram per milliliter polyetylenaminløsning. Etter å ha tilsatt innholdet i rør to til rør en, hvirvel i 30 sekunder, og inkuber deretter i 15 minutter ved romtemperatur.

Tilsett forsiktig dråpevis 1,1 milliliter av løsningen til hver tallerken og fordel ved å virvle forsiktig. Plasser oppvasken i inkubatoren ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid, i 48 timer. Tilsett deretter 250 mikroliter 0,5 molar EDTA til hver tallerken og legg dem i inkubatoren i 10 minutter.

Høst cellene ved å vaske dem av fatet og overfør til et 500 milliliter sentrifugerør. Sentrifuge ved 2000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. Løsne pelleten ved å vortexing og trekke ut viruset ved hjelp av et AAV-rensesett.

Etter aliquoting det rensede viruset, lagre det ved minus 80 grader Celsius. Etter tining av CD34-positive hematopoietiske stamceller og stamceller, overfør cellene til 10 milliliter forvarmet RPMI supplert med 1% penicillin streptomycin. Sentrifuge ved 350 G ved romtemperatur i 10 minutter.

Suspendere cellene i hematopoietisk stamme og stamcelleretensjonsmedium til en konsentrasjon på 250.000 celler per milliliter og inkubere ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 72 timer. Deretter høster cellene i et 15 milliliter rør. Tell og sjekk cellens levedyktighet ved å trypan blå ekskludering.

For å forberede ribocucleoproteinkomplekset, tilsett 15 mikrogram Cas9 og åtte mikrogram enkeltguide-RNA i et 1, 5 milliliter rør og inkuber ved 25 grader Celsius i 10 minutter i en oppvarmingsblokk. Mens ribonukleoproteinkomplekset inkuberer, sentrifugerer cellene ved 350 G i fem minutter og kaster bort supernatanten. Etter å ha suspendert cellene i 100 mikroliter nukleofeksjonsløsning, bland cellene med ribonukleoproteinkomplekset og overfør dem til kyvetten.

Etter å ha banket forsiktig på kyvetten for å fjerne eventuelle gjenværende luftbobler, sett kyvetten inn i holderen til transfeksjonssystemet og elektroporate cellene. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 400 mikroliter forvarmet hematopoietisk stamme og forfedre celleretensjonsmedium uten penicillin streptomycin og overfør cellene med en fin overføringspipette til en kulturplate som inneholder forvarmet hematopoietisk stamme og stamcelleretensjonsmedium uten penicillin streptomycin. Overfør deretter platen til inkubatoren.

Tine hetteglassene med de frosne rekombinante AAV-ene på is og transduser cellene ved å pipettere den optimale mengden av hver rekombinante AAV6 til cellesuspensjonen. Etter å ha blandet cellesuspensjonen forsiktig med pipetten, inkuber de transduserte cellene i seks til åtte timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter seks til åtte timer, samle cellene i et rør og sentrifuger dem ved 350 G ved romtemperatur i fem minutter.

Kast supernatanten og erstatt den med fersk forvarmet hematopoietisk stamme og stamcelleretensjonsmedium supplert med penicillin streptomycin og overfør cellene til en cellekulturplate. Inkuber cellene i 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. For å flyte sortere de konstruerte cellene som bærer den heterozygote gain-of-function-mutasjonen, høste cellene i et 15 milliliter rør og sentrifuge ved 350 G ved romtemperatur i fem minutter som vist tidligere.

Fjern supernatanten og suspender cellene i en milliliter DPBS som inneholder 0,1% PSA og sentrifuge igjen ved 350 G ved romtemperatur i fem minutter. Etter å ha kastet supernatanten, suspender cellene i et passende volum DPBS pluss 0,1% BSA, avhengig av cellenummeret som vist tidligere. Overfør cellene til et sterilt faksrør utstyrt med en hette og legg til syv AAD eller annet levedyktighetsfargestoff til cellesuspensjonen for utelukkelse av levende / døde celler.

Sorter levende celler som er dobbelt positive for fluorescerende reporterproteiner i et samlingsrør som inneholder 200 mikroliter hematopoietisk stamme og stamcelleretensjonsmedium. Etter sentrifugering av de sorterte cellene ved 350 G ved romtemperatur i fem minutter som vist tidligere, til en konsentrasjon på 250.000 celler per milliliter for videre utvidelse i kultur eller bruk cellene direkte for funksjonelle analyser. To dager etter transveksjon med ribonukleoproteinkomplekset og transduksjon med de rekombinante AAV6-virusene ble cellene analysert ved flowcytometri.

Fire hovedpopulasjoner ble oppdaget, inkludert celler uten HDR-basert genomredigering som verken uttrykker GFP eller BFP-cellene positive bare for GFP med bare villtypekonstruksjonen integrert, celler som bare er positive for BFP med bare den muterte konstruksjonen integrert, og GFP og BFP doble positive celler med både villtype og muterte sekvenser integrert. For å validere den vellykkede knock-in av heterozygote calreticulin mutasjoner inn / ut PCR ble utført på genomisk DNA ekstrahert fra celler inkubert med AAV bare og fra celler inkubert med ribonukleoprotein og AAV med knocked-in calreticulin vill type og calreticulin sletting sekvens. Celler ble sortert basert på samtidig ekspresjon av begge fluorescensreportere før DNA-ekstraksjon.

Etter gelelektroforese ble individuelle bånd skåret ut av gelen og DNA ble ekstrahert for påfølgende Sanger-sekvensering. Sekvenseringsresultatene bekreftet den vellykkede sømløse integrasjonen av villtypen og muterte sekvenser i de heterozygote kalretikulinmuterte hematopoietiske stammene og stamcellene. Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren, er å nøye velge det best presterende enkeltguide-RNA, da dette vil bestemme den totale HDR-effektiviteten og derfor hyppigheten av vellykket knock-in av heterozygote mutasjoner.

Etter denne prosedyren kan de genetisk utviklede cellene brukes til funksjonelle in vitro- og in vivo-eksperimenter som kolonidannende enhetsanalyser, differensieringsanalyser og transplantasjon til immunsviktende mus.

X

Simple Hit Counter