Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Biology
 

Summary

Dieses Video beschreibt eine einfache, zeitsparende Technik für die automatisierte Gewebedissoziation mit dem gentleMACS Dissociator zu Single-Zellsuspensionen von Maus-Splenozyten vorzubereiten.

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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029, doi:10.3791/1029 (2008).

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Abstract

Einzel-Zell-Suspensionen sind eine Voraussetzung für Experimente in Zellseparation, Zellanalyse und Zellkultur. Zur Vermeidung von langwierigen und oft schmerzhaft manuelle Dissoziationen der gentleMACS Dissociator ermöglicht es, Gewebe sehr effizient distanzieren unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen. Die gentleMACS Dissociator optimal distanzieren Mäusemilz, kombiniert zeitsparende und Normung Benutzer-Sicherheit. Dieses Video beschreibt, wie Sie mit der Maus Milz mit dem gentleMACS Dissociator, eine automatisierte Bank-Top-Gerät, das mechanisch stören können Gewebe mit speziellen Röhren, um lebensfähige Zellsuspensionen produzieren zu distanzieren. Nach Dissoziation, sind Milz gefiltert, zentrifugiert und resuspendiert für weitere Anwendungen.

Protocol

Einführung in die Geräte

  1. Das Gewebe wird sanft dissoziiert, mit violetten C Tubes zu tragfähigen Einzel-Zell-Suspensionen.
  2. Die PBS / BSA EDTA-Puffer wird verwendet, um die Zellen zu distanzieren. Der Puffer wird durch Zugabe von 1 Teil BSA Stammlösung auf 20 Teile autoMACS Spüllösung EDTA vorbereitet.
  3. Das MACS Pre-Separation Filter sind so, dass die dissoziierten Gewebeproben frei von allen Zellklumpen verwendet werden, die Förderung der erfolgreichen MACS Trennung und anschließender Analyse.

Dissoziation der Milzzellen

  1. Whole Milz werden in Einzel-Zellsuspensionen von Splenozyten mit dem gentleMACS Dissociator disscociated.
  2. Zu Beginn des Verfahrens, laden Sie die C Tube mit einem Volumen von Puffer nach der Masse der Milz. Eine gesunde Milz eines jungen erwachsenen weiblichen BALB / c Maus wiegt etwa 80-120 mg. Jeder von 1 bis 2 Milzen dieser Masse benötigen 3 ml Puffer. Milz von älteren Tieren oder Tieren mit Infektionen sind oft größer und muss in Puffer abgewogen werden. Der Puffer Volumina müssen entsprechend skaliert werden. Nicht mehr als insgesamt Puffer Volumen von 10 mL.
  3. Fügen Sie die Milz seziert, um die C Tube enthält 3 ml Puffer.
  4. Stellen Sie sicher, dass die C Tubenkappe dicht ist und bringen Sie die C Rohr zur dissociator der Sockel nach unten.
  5. Schalten Sie den dissociator. Für 1-2 Milz, wählen Sie Programm m_spleen_01. Das Programm dauert 56 Sekunden dauern. Wenn die Anzahl der Milz ist größer, benutzerfreundliches Programm m_spleen_04; dieses Programm kann verwendet werden für bis zu 720 mg Milzgewebe.
  6. Nach Abschluss des Programms der einheimischen Milzgewebe wird in eine Splenozyten Federung dissoziiert.
  7. Spin, den ganzen Zellsuspension bei 300xg bei Raumtemperatur für etwa 30 Sekunden. Dadurch wird sichergestellt, dass der Rotor und Stator aller Zellen, die an der Unterseite der C Rohr gesammelt werden, werden freigegeben.
  8. Entfernen Sie die Probe durch das Septum verschlossenen Öffnung in der C Tubenkappe mit einem 1000 Mikroliter Pipette.

Filtrationsschritt

  1. Zu Beginn der Filtration, gelten die dissoziierten Gewebe um die Pre-Separation Filter oder eine Zelle Sieb mit 30 um Porengröße. Das Sieb sollte ein 15-ml-Tube für 1-2 Milz oder ein 50-ml-Tube fit für mehr als 2 Milz.
  2. Lassen Sie die Zellsuspension durch. Dann waschen Sie den Filter, indem 5 ml Puffer.
  3. Nun Zentrifuge das Rohr mit der Zellsuspension bei 300xg, bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um alle Splenozyten in der Milz Zellpellet zu sammeln.
  4. Nun, dass wir ein Pellet aus dissoziierten Milzzellen haben, müssen wir saugen den Überstand und Zellpellet in einer entsprechenden Menge an Puffer.

Spleen Dissoziation mit dem gentleMACS Dissociator wird ein hoher Anteil von lebensfähigen Splenozyten, die mittels Durchflusszytometrie mit dem MACSQuant Analyzer demonstriert wird. Tote Zellen werden durch Propidiumiodid gefärbt. In dem Beispiel vorgesehen, zeigt die Vorderseite streuen Dot-Plot die vorbereitete Splenozyten.

Discussion

Zur Vermeidung von langwierigen und oft schmerzhaft manuelle Dissoziationen, ermöglicht die gentleMACS Dissociator man Gewebe sehr effizient distanzieren unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen. Die Gewebedissoziation Verfahren ist schonend zu den Zellen und liefert Zellsuspensionen mit einer hohen Überlebensrate. Die gentleMACS Dissociator in Kombination mit C Tubes ist für die Herstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus verschiedenen Geweben entwickelt. Das Gerät ist mit einer Reihe von voreingestellten Programmen zur Maus-Milz, Leber, Lunge oder Nervengewebe distanzieren ausgestattet. Die Palette der Programme und Protokolle wird laufend erweitert werden, um zusätzliche Gewebe umfassen.

Disclosures

Alle Protokolle und Datenblätter finden Sie unter

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes Miltenyi Biotec 130-091-596 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec 130-092-197
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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Comments

2 Comments

  1. great

    Reply
    Posted by: somesh p.
    March 1, 2009 - 12:23 PM
  2. Hi, is this instrument only for spleen or can be used for some other tissues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 29, 2010 - 2:59 AM

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