Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Biology
 

Summary

Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.

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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029, doi:10.3791/1029 (2008).

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Abstract

De uma única célula suspensões são um pré-requisito para experimentos na separação de células, a análise de células e cultura de células. Para evitar dissociações manual tedioso e doloroso o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O Dissociator gentleMACS pode perfeitamente dissociar baço mouse, combinando economia de tempo e padronização com segurança do usuário. Este vídeo descreve como dissociar baços mouse usando o Dissociator gentleMACS, um dispositivo de bancada automatizado que pode atrapalhar mecanicamente tecidos utilizando tubos especiais para produzir suspensões de células viáveis. Após a dissociação, baços são filtradas, centrifugadas e ressuspendidas para outras aplicações.

Protocol

Introdução ao Equipamento

  1. Tecido é cuidadosamente dissociada, utilizando tubos de violeta C em uma única célula viável suspensões.
  2. O PBS / BSA-tampão de EDTA é utilizado para dissociar as células. O buffer é preparada por adição de 1 parte de solução de BSA estoque para 20 partes de autoMACS lavagem solução contendo EDTA.
  3. O MACS pré-separação Filtros são usados ​​para que as amostras de tecido dissociado estão livres de todos os aglomerados de células, promovendo a separação MACS sucesso e posterior análise.

Dissociar as células do baço

  1. Baços todo são disscociated em uma única célula suspensões de esplenócitos usando o Dissociator gentleMACS.
  2. Para iniciar o procedimento, coloque o tubo C com um volume de tampão de acordo com a massa do baço. Um baço saudável de um jovem adulto camundongo BALB / c fêmeas pesa cerca de 80-120 mg. Cada 1 a 2 baços dessa massa necessitam de 3 mL de tampão. Baços de animais mais velhos ou animais com infecções são muitas vezes maiores e devem ser pesados ​​em buffer. Os volumes de buffer deve ser adaptado em conformidade. Não exceder o volume total do buffer de 10 mL.
  3. Adicione o baço dissecados para o tubo C contendo 3 ml de tampão.
  4. Certifique-se de que a tampa do tubo C é apertado e conecte o tubo C ao dissociator com a tampa para baixo.
  5. Ligue o dissociator. Por 1-2 baços, selecione m_spleen_01 programa. O programa terá 56 segundo para ser concluído. Se o número de baços é maior, usar o programa m_spleen_04; este programa pode ser usado para até 720 mg de tecido esplênico.
  6. Após a conclusão do programa, o tecido do baço nativa é dissociada em uma suspensão esplenócitos.
  7. Girar a suspensão de células inteiras em 300xg em temperatura ambiente por cerca de 30 seg. Isso irá garantir que o rotor eo estator são libertados de todas as células que são coletados na parte inferior do tubo C.
  8. Retirar a amostra através do septo, selada abertura da tampa do tubo C usando uma pipeta 1000 microlitro.

Etapa de filtração

  1. Para começar a etapa de filtração, aplicar o tecido dissociado para o Filtro de pré-separação ou um filtro de células com 30 mM tamanho dos poros. O filtro deve caber um tubo de 15 mL por 1-2 baços ou um tubo de 50 mL por mais de 2 baços.
  2. Deixe a suspensão de células passar. Em seguida, lave o filtro através da aplicação de 5 mL de tampão.
  3. Agora, centrifugar o tubo com a suspensão de células em 300xg, em temperatura ambiente por 10 minutos para coletar todos os esplenócitos em um baço pellet celular.
  4. Agora, que temos uma pelota de esplenócitos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade adequada de buffer.

Dissociação baço usando o Dissociator gentleMACS renderá uma elevada percentagem de esplenócitos viável, o que é demonstrado por citometria de fluxo usando o Analisador MACSQuant. Células mortas estão manchadas pelo iodeto de propídio. No exemplo fornecido, o atacante lado gráfico de pontos de dispersão mostra o esplenócitos preparado.

Discussion

Para evitar dissociações manuais entediantes e muitas vezes doloroso, o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O tecido procedimento de dissociação é suave para as células e suspensões colheitas de células com uma taxa alta viabilidade. O Dissociator gentleMACS em combinação com C Tubes é projetado para a preparação de uma única célula suspensões de vários tecidos. O instrumento é equipado com uma série de programas pré-definidos para dissociar baço mouse, fígado, pulmão, ou tecido neural. A gama de programas e protocolos será continuamente ampliado para incluir outros tecidos.

Disclosures

Todos os protocolos e fichas de dados estão disponíveis em

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes Miltenyi Biotec 130-091-596 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec 130-092-197
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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Comments

2 Comments

  1. great

    Reply
    Posted by: somesh p.
    March 1, 2009 - 12:23 PM
  2. Hi, is this instrument only for spleen or can be used for some other tissues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 29, 2010 - 2:59 AM

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