マウス腎移植の手順

Biology

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Summary

マウスの腎移植は、成功のための慎重な術後ケアと治療を必要とする技術的に困難な手順です。

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Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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Abstract

マウスの腎同所移植は技術的に困難な手順です。マウスの最初の腎移植は(2)30年以上前にラッセルらによって行われる(1)以降Zhangら数年で洗練されたが、世界でも少数の人々は、この手順をマスターしている。私たちのラボでは、正常に> 90%の生存率は1200同所腎臓移植を実施した。成功のキーポイントは、再灌流障害の厳格な制御、出血や血栓症、手続き中および移植後の両方を含んで、および吻合のための11から0縫合糸の代わりに、10から0を使用してください。

受信者の術後のケアと治療は成功と評価を移植することが極めて重要である。すべての腎移植レシピエントは、継続的に飲料水の後の移植とsulfatrimすぐにペニシリンの注射剤の形で抗生物質を受け取る。全体的な動物の健康は、毎日、全血中クレアチニンの分析は移植片機能を評価するためのポータブルI - STATのマシンで日常的に行われて評価されます。

Protocol

ドナー臓器の収穫(2):

  1. 65mg/kgペントバルビタールIPを使用してドナーを麻酔、麻酔は、イソフルラン(2-3%)によって維持されています。
  2. ドナーの腹部を入力し、右側に横方向に腸を動かして、左腎臓を露出させる胸骨から恥骨まで正中切開を加えます。
  3. 8から0絹縫合糸で副腎及び精巣の血管を結紮し、分割して左の腎臓を分離します。
  4. 腎動脈と静脈との接合上記の大動脈を動員する。
  5. 上記と下記の下大静脈(IVC)腎動脈と静脈との接合を動員する。
  6. 出血を最小限に抑えるために8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈下大動脈をライゲーションする。
  7. 腎門部から膀胱へ左尿管を細かく分析。
  8. 膀胱のドームで尾の方に撤回を使用して尿管膀胱移行部を公開します。
  9. 膀胱から膀胱吻合を介して尿再建のために使用される左尿管膀胱移行部を含む膀胱の物品小さい、楕円形のパッチ。右尿管は膀胱に含まれていません。
  10. 8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈の下にIVCをライゲーションする。
  11. 腎動脈と静脈、上記の大動脈を連結し​​、徐々に0.2〜0.4ミリリットル寒さにその場で移植片を灌流、大動脈大動脈を経由して乳酸リンゲル液ソリューションは、ヘパリン化。
  12. 8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈の上にIVCをライゲーションする。
  13. IVCとの接合部で腎静脈を横に切断する。
  14. 腎動脈下約2mm、斜めに大動脈を割ります。
  15. 腎臓と一括して膀胱のパッチに添付された尿管とその血管供給を取り外します。氷の上で乳酸リンゲル液ソリューションで保管してください。
  16. 麻酔下に頚椎脱臼によりドナーマウスを安楽死させる。

受信者移植(2):

  1. 65 mg / kgのペントバルビタールIPで受信者の麻酔とイソフルランによる麻酔(2-3%)を維持する。
  2. 正中切開を行う、ぬれたガーゼで腸を覆い、慎重に左側にそれを引っ込める。
  3. 右尿管、腎動脈と静脈を結紮し、右の腎臓を削除します。
  4. 慎重に腰枝を結紮した後、2つの4 mmのmicrovasularクランプと大動脈大動脈と下大静脈を分離し、クロスクランプ。
  5. 大動脈の全層を介して10から0ナイロン縫合糸を配置し、シングルカット(血管の直径の約5分の1)で楕円aortaotomyを作るために引っ込める。
  6. 30ゲージの針でIVCを刺すことによって縦静脈切開術を行うとmicroscissorsを使用して適切に拡張する。
  7. 腔内の血液や血栓をクリアするためにヘパリン生理食塩水で大動脈と下大静脈の両方を灌漑。
  8. 氷からドナーの腎臓を削除し、マウスの右脇腹に内腹部に置きます。ドナーの腎臓は、冷生理食塩水に浸したガーゼのパッドと湿った保たれます。
  9. 場所二人はドナーの大動脈カフと受信者のaortaotomyの近位および遠位頂点に縫合糸にてご利用いただけます。
  10. 大動脈の外側に2〜3連続的な10から0ナイロン縫合糸を使用して、ドナーの大動脈のカフと受信者のaortaotomyの前壁の間に端側吻合を行う。
  11. 受信者の左脇腹に上のドナーの腎臓の移植を回します。ドナーの大動脈のカフと受信者のaortaotomyの後壁の間に前の手順を繰り返します。
  12. IVCの内側に、4〜5連続10から0ナイロン縫合糸を用いて、ドナー腎静脈と受信者IVCの後壁との間のエンドツー側吻合を行います。し、IVCとドナー腎静脈の前壁はIVC外4〜5連続縫合で閉鎖されています。
  13. 静脈と動脈の両方の吻合は20分以内に完了する必要があります。
  14. 吻合時の冷たい生理食塩水で数回移植片を洗浄します。
  15. レシピエントの膀胱のドームを割る、と焼灼で止血する。
  16. ドーム上に小さなカットを行います。
  17. 受信者の膀胱のドームでドナー小さな膀胱パッチをanastomizeに10から0までナイロンの二つ滞在の縫合糸を置きます。吻合部の各側は、8〜10連続針で縫合する。
  18. 連続4から0滅菌、合成吸収性vicryl縫合糸で2層に腹部を閉じます。
  19. 断続的な注入IVによる手術中のレシピエントマウスに0.4ミリリットル温かい生理食塩水を与える。

受信者の術後のケア

  1. 腹部を閉じた後、ペニシリン(500U/10g)の単回筋肉内注射は、(2)に投与される。
  2. さらに、受信者は、0日目と痛みのための1日目手術後に筋肉注射で0.05 mg / kgのブプレノルフィンを受け取ります。実験がTEになるまで手術後、移植のレシピエントはsulfatrim(100mg/kg)を含む水を受けるrminated。
  3. 第一24の場合は術後のマウスはインキュベーターを制御する温度に保持されています。
  4. マウスには、通常の操作の1時間以内に麻酔から回復し、通常の餌と水を自由に摂取されている。
  5. 皮膚の縫合糸は、2週間、手術後に削除されます。

受信者の腎摘出

  1. 65 mg / kgのペントバルビタールIPを持つ受信者4〜7日後に腎臓の移植を麻酔、麻酔は、イソフルラン(2-3%)によって維持されています。
  2. 正中切開を介して腹部を開きます。
  3. 生理食塩水に浸したガーゼで腸を覆い、慎重に右側にそれを引っ込める。
  4. 左尿管、腎静脈と動脈を結紮した後に左腎を削除します。
  5. 連続4から0合成吸収性vicryl縫合糸で2層に腹部を閉じます。

全血中クレアチニンの測定

  1. 0.2未満のccの隔週採血までの週間は、イソフルラン麻酔下麻酔または眼窩なく、どちらのsubmandibularly実行されます。
  2. 定量的な全血中クレアチニン濃度はI - Statのポータブルクリニカルアナライザー(Heska(株)、フォートコリンズ、CO)を用いて決定されます。
  3. 従来の単位(mg / dlとは)88.4で、従来の単位を乗じてマイクロモル/ LのSI単位に変換されます。

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Discussion

我々は、> 90%の技術的な成功率とマウスで腎移植の約1200ケースを実行している。心臓移​​植に比べて、腎臓の移植の成功率は通常低いです。しかし、私たちの研究室では、腎臓移植の高い成功率(> 90%)を維持している。成功のキーポイントは、ドナーの腎臓と受信者の両方に再灌流傷害を軽減し、手順や手術後に全体に出血や血栓症を最小限に抑えるためです。次の要素が最も重要になることがあります:(a)の可能な限り慎重、穏やかな運転による手術中に受信者に出血を減らすこと、(b)ドナーの腎臓の準備と受信者の移植時に暖かい虚血とのクロスクランプ時間を最小限に抑えることと、(c)壊死、不十分な血液供給と膀胱漏れ後の操作を防ぐための小さなドナー膀胱のパッチを使用して、ネイティブ腎臓の(d)は遅延の腎摘出術4日まで〜7日後に移植移植された腎臓は手術後の機能を回復できるように、(E )血栓症の発生率を減らすために大動脈の外側に吻合する(ドナーの大動脈袖口と前壁との間およびドナーの大動脈のカフと受信者の大動脈の後壁の間に)実行する、(f)少なく​​とも用のためのレシピエントマウスは、保温手術後24時間は、(g)の潜在的な感染症を防ぐために手術後にレシピエントマウスへの抗生物質を与える。

このプロトコルでは、我々は生存率に影響を与えることなく、11から0縫合糸の代わりに10〜0を使用してください。 11から0縫合糸が理想と多くの移植の実験室で使用ですが、我々は10から0縫合糸は、上記の要因が十分に制御されている限り、腎臓の移植で使用するために十分であることを感じる。

移植腎機能におけるその低下は血清クレアチニンの測定によって監視できるように残りのネイティブ腎臓の除去が不可欠です。すべての腎移植レシピエントは、4および7日後に腎臓の移植の間に左ネイティブ腎臓の腎摘除術を受ける。受信者が特徴的に病気に苦しむか、または両方の手続きが同時に行われている時に生存していないため腎摘出は腎臓の移植の時に行われていません。手続きの間に4〜7日間の遅れは、ネイティブの腎臓が削除される前に腎臓の移植は虚血と再灌流障害から回復することが可能。移植腎機能は、全体的な動物の健康および血中クレアチニン濃度の日々の検査によって評価される。参考のために、非移植、通常のマウスは約20マイクロモル/ Lのクレアチニンレベルを持っています腎同種移植片の拒絶はレシピエントマウスは、病気の兆候を示し、クレアチニンレベルが100マイクロモル/ Lの時の移植片が病理組織学的分析のために伐採されている時近くに上昇しているときに疑われる。

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Disclosures

動物実験は、オハイオ州立大学IACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

Acknowledgments

これらの研究は、GAHにNIH R01 AI36532によって資金によって部分的にサポートされていました。我々は博士ティボーナーダシディが提供する移植病理学の傑出したサポート、およびこの研究の努力を開始するには故チャールズG. Oroszが提供する非常に貴重な指針と先見の明に感謝します。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).

Comments

18 Comments

  1. We are a studygroup from the Netherlands, performing murine experiments to determine the effect of a new therapy on the ischemia/reperfusion injury on kidneys. We have experience with mice models, but we have to compose our surgical instrument set. Is it possible to give the manufacturer and catalog number of the 4-mm microvasular clamps?
    Thanks in advance.

    Kinds regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2009 - 9:48 AM
  2. Here is 4-mm micro vessel clamps information:

    Vendor: Biomedical Research Instruments.

    Catalog number: 14-1000.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2009 - 5:22 PM
  3. Good job and congrats on your procedure. May I know what type needle holder are you using? The curve is pretty god.

    thanks,
    Abb

    Reply
    Posted by: Reza N.
    September 19, 2009 - 12:56 AM
  4. Here is needle holder information:
    Vendor: Biomedical Research Instruments.
    Catalog number:²0-1050

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2009 - 9:45 AM
  5. Hello, I have a question about the binocular magnification that you use in this procedure.
    Thanks in advance and good luck with your experiments.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2010 - 10:09 AM
  6. We use the eyepiece 1².5x.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 3, 2010 - 5:50 PM
  7. hallo,
    Is it possible to give the manufacturer and catalog number of the tweezers that you used and the catalog number of thesewing thread
    thank you very much and goodluck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 8:35 AM
  8. Here is tweezers information:
    Pattern #5 Vendor: ROBOXZ, Catalog number: RS-5045,
    Pattern #7 Vendor: ROBOXZ, Catalog number: RS-5047,
    10-0 Suture information:
    Vendor: Covidien,
    Catalognumber: N²51²

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 23, 2010 - 2:40 PM
  9. We just start kidney transplant for genetic question. We have many problem coming. May I can visit your lab. to see you to transplant one time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2011 - 10:48 AM
  10. Hi again Ben,

    Sorry sent that last reply before its time. Jiao-Jing's e-mail address is jiao-jing.wang@northwestern.edu.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2011 - 12:06 PM
  11. Hi Ben,

    Unfortunately, we no longer do mouse renal transplants in our lab. The person who did the transplants (Jiao-Jing Wang) is now at Northwestern University. I do not know whether you can observe here there, but you should contact her and ask. She has over 10 years of experience in mouse renal transplantion and is very skilled at this technique. Her e-mail address is jiao-ling.wang@northwestern.edu.

    is currently at

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2011 - 12:02 PM
  12. Hi,

    Very nice video. Helps to better understand when learning this difficult technique.

    I have few questions please....

    1. What models have you used in these transplants?
    ². Did you use immunosuppression for allogenic transplants? If so, what drugs and how long?
    3. What is your survival rate?
    4. What were the common complications?

    Thank you,
    Kumar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 1:53 PM
  13. Hi Kumar,

    We have used this mainly for DBA/² renal allografts into C57BL/6 recipients. In these experiments, the recipients are primed with a DBA/² skin allograft, as DBA/² renal allografts into naive C57BL/6 recipients are spontaneously accepted. With sensitization, renal allografts in this model survive about 10 days, a time which can be extended indefinitely with a 3 day course of CD4 depletion. In contrast, depletion of CD8 cells has no effect on renal allograft survival. Another model in which we have extensive experience is the BALB/c into C57BL/6 model in which renal allografts are spontaneously rejected (MST ~100 days). Again, CD4 depletion promotes indefinite survival of renal allografts whereas CD8 depletion has no effect. Our mortality rate is less than 10% but you should expect it to approach 50% in the beginning. Our microsurgeon, Jiao-Jing Wang, has extensive experience with this technique, so is way ahead of the learning curve. A common problem even in the hands of Ms. Wang is hydronephrosis but the cause of most mortality is not diagnosed.

    Best,
    Gregg

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 2:31 PM
  14. Hi Gregg,

    Many thanks. Your information helps a lot.

    Your model of BALB/c to C57BL/6 seems to tolerate the kidney for more than three months without immunosuppression. That seems to be a good model. I am looking for a model which will stay alive for atleast 1 month without immunosuppression as it will be another factor which we wish to avoid in our study at present.


    I have done many transplants in rats and am starting it in mouse now.

    I read in an abstract that some strains accept all grafts with good acceptance but the article did not say which ones. So for now, I am planning to use C57BL/6 as both donor and recipients. We also have FVB and C3H but I did not come across any transplants between them.

    In rats, I had 40% hydronephrosis when I used to insert the ureter directly into the bladder but after switching to bladder patch technique as in the video, it is less than 5%.

    Thank you once again.
    Kumar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 4:21 PM
  15. use interrupt suture on ureter to bladder

    Reply
    Posted by: zhonglin w.
    January 11, 2015 - 1:34 PM
  16. I am Gengwen from University of Wisconsin Madison. I started doing mice renal Tx 3 months ago and have done 40 operations. But unfortunately, I still didn't get a survivor. Recently, I can get the transplanted kidney perfused well and very little bleeding during the operation. But the animal still can not survive even ²4 hours. The  clamping time is about 30 minutes. The weight of mice is ²5-30 grams. The species is B6 or FVB.
     I saw your video on the Internet and I know you have over 10 year experience over this operation. So I wish you can help me analyze this problem and give me some advice.

     Thank you,

     Gengwen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 1:43 PM
  17. Dear
    we are beginning the work of experimental renal transplantation in rats, I wonder what the most suitable material to start and what is your experience in the treatment of infections

    Reply
    Posted by: Claudia C.
    August 4, 2014 - 12:06 PM
  18. You may inject penicillin after surgery or put antibiotics into water bottles for daily drink

    Reply
    Posted by: Jiao-Jing W.
    August 8, 2014 - 10:12 AM

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