लाइव Visualizing ड्रोसोफिला फ्लोरोसेंट रंजक के साथ जंक्शन Glial neuromuscular

Biology

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Summary

हम एक उपन्यास अंदर बाहर रहते मक्खी लार्वा confocal माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग के ऊतक की तैयारी में Glia-neuromuscular synapses के संरचनात्मक सुविधाओं का वर्णन किया. हम लेबल एचआरपी फ्लोरोसेंट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रहते न्यूरॉन टर्मिनलों, और भी फ्लोरोसेंट Dextrans साथ perisynaptic अंतरिक्ष visualized.

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Brink, D., Gilbert, M., Auld, V. Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (27), e1154, doi:10.3791/1154 (2009).

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Abstract

हमारी परियोजना के विकास लार्वा मक्खी neuromuscular synapse में GFP लेबल glial संरचनाओं की पहचान की. रहते glial तंत्रिका पेशी synapses के विकास को देखो, हम एक लार्वा ऊतक तैयारी है कि जीना बरकरार लार्वा की सुविधाओं था विकसित की है, लेकिन यह भी अच्छा ऑप्टिकल गुण था. इस नई तैयारी भी perfusates के synapse तक पहुँच के लिए अनुमति दी. हम मक्खी लार्वा का इस्तेमाल किया, उन्हें कृत्रिम hemolymph में डूबे, और उन्हें द्रुतशीतन द्वारा अपने सामान्य लयबद्ध शरीर संकुचन आराम. अगला हम dissected प्रत्येक जानवर के पीछे क्षेत्रों और एक कुंद कीट पिन के साथ मुँह भागों शरीर गुहा के माध्यम से पिछड़े धक्का दे दिया. यह अंदर बाहर एक जुर्राब मोड़ की तरह लार्वा शरीर दीवार, everted. हम अल्ट्रा ठीक विच्छेदन कैंची के साथ विच्छेदन पूरा किया और इस प्रकार आंत शरीर दीवार की मांसपेशियों के पक्ष उजागर. NMJ पर glial संरचनाओं झिल्ली glial विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत लक्षित GFP व्यक्त किया. बाद synaptic झिल्ली, मांसपेशियों में SSR (Subsynaptic Reticula) synaptically लक्षित dsRed व्यक्त किया. हम तीव्रता मोटर न्यूरॉन टर्मिनलों, synapse के तीसरे भाग लेबल की जरूरत है. हम ऐसा करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी एचआरपी लागू, उत्सर्जक दूर लाल flurophore संयुग्मित. मोटर न्यूरॉन टर्मिनलों और SSR के बीच perisynaptic अंतरिक्ष में डाई प्रसार गुण के लिए परीक्षण करने के लिए, हम दूर लाल उत्सर्जन flurophore और एकत्र की छवियों को संयुग्मित बड़े Dextran अणुओं की एक समाधान लागू होता है.

Protocol

भाग 1: ऊतक तैयार

  1. हमारा लक्ष्य मक्खी लार्वा जहां तंत्रिका तंत्र बरकरार है के एक ऊतक तैयारी है, लेकिन शरीर दीवार मांसपेशी की आंतरिक सतह एक कृत्रिम hemolymph को उजागर किया है, और अच्छा प्रकाशिकी के लिए एक खुर्दबीन कवर पर्ची के करीब तैनात किया जा सकता है. दूसरे शब्दों में, लार्वा तैयारी के बाहर एक अंदर.

    चूंकि पारंपरिक ऊतक की तैयारी के काटने, लगाए और शरीर दीवार मांसपेशी खींच, और कभी कभी तंत्रिका तंत्र का हिस्सा हटाने शामिल है, हम एक अलग दृष्टिकोण की जरूरत है.

    हम जानवरों को अंदर बाहर करना चाहता था क्योंकि हम संरचनात्मक सुविधाओं और synapse में समय पर संरचनात्मक परिवर्तनों पर एक अच्छे लग रहे प्राप्त करना चाहता था, और हम तंत्रिका तंत्र बरकरार रखना चाहता था. हम भी ऊतक खींच से बचने चाहता था, और खिंचाव रिसेप्टर्स, जो मांसपेशियों को चिकोटी और हमारे छवियों को बर्बाद करना होगा सक्रिय.

  2. शुरुआत के लिए, जानवरों चरण. तीसरे लार्वा दूध पिलाने की और तीसरे लार्वा भटक बड़े और करने के लिए आसान काटना तो हम W3 लार्वा पर प्रदर्शन करेंगे. यह जानवर है Tubby phenotype है, और व्यापक है, तो यह Evert आसान है.

    हम केवल लार्वा इस्तेमाल किया है कि हम सक्रिय रूप से W3 लार्वा सहित रेंगने देखा,.
  3. डबल आसुत H2O की एक पेट्री डिश में एक बहुत नरम पेंट ब्रश के साथ एक मन की मौज के सतह को साफ करें. साफ़ लार्वा बेहतर प्रकाशिकी है और सफाई बैक्टीरिया को कम कर देता है.
  4. 3 मिलीलीटर बर्फ ठंड के बारे में HL-6 के एक छोटे से पेट्री डिश, और कृत्रिम hemolymph जानवर स्थानांतरण. बर्फ पर पकवान रखो जब तक पशु चलती रुक जाता है, और आराम (5 मिनट के बारे में).
  5. एक हाथ और दूसरे में वसंत कैंची में बहुत अच्छी टिप संदंश पकड़ो. मैं अपने प्रमुख हाथ के साथ कैंची का उपयोग करें. शरीर दीवार के पार दबाव equlibrate कैंची के साथ शरीर की दीवार में एक छोटा सा छेद बनाओ.
  6. जानवर धीरे डिश के तल पर नीचे संदंश के साथ और पकड़ो बंद पीछे दो खंडों में कटौती. दूर विसरा काटना और वसा शरीर की संभावना शरीर गुहा के बाहर कदम होगा. इस ऊतक दूर भी कट.
  7. ठीक संदंश के साथ पकवान नीचे के खिलाफ लार्वा पकड़ो. में एक कीट # 0 पिन पकड़ो एक कुंद टिप के साथ () और यह लार्वा के मुँह भागों के खिलाफ धक्का. शरीर गुहा के माध्यम से मुँह भागों पुश तरह आप अंदर से बाहर एक जुर्राब मोड़ रहे हैं.
  8. ऊतक अंदर बाहर आंकड़ा तरह दिखेगा: नीचे. अल्ट्रा ठीक विदारक उपकरण के साथ, शरीर की दीवार से दूर वसा शरीर और trachioles टुकड़े करना. कोशिश करो वास्तव में मुश्किल trachioles को खींच नहीं है, या तंत्रिका तंत्र डिस्कनेक्ट. Trachioles तेजस्वी शरीर दीवार मांसपेशी में छेद चीर देगा.

    के रूप में अधिक वसा शरीर के रूप में आप कर सकते हैं निकालें. इन दोनों संरचनाओं के अपने ऊतक के ऑप्टिकल गुणवत्ता को बाधित. आप इस तैयारी करने से पहले कॉफी छोड़ करना चाहते हो सकता है.

  9. जब आप समाप्त कर रहे हैं मांसपेशी पारदर्शी अपारदर्शी सफेद या नहीं किया जाएगा. यदि आप HL-6 में ग्लूटामेट बिना ऊतक तैयार करने का डाल, कमरे Temp पर, यह संभावना rhythmically अनुबंध क्योंकि CNS में मोटर पैटर्न जनरेटर काम कर रहे हैं.

    जाहिर अनुबंध, या अनियमित अनुबंधित शरीर दीवार मांसपेशियों के साथ preps का उपयोग करने से बचें.

    शरीर दीवार के बाहर बरकरार अंदर आसानी से पृष्ठीय और उदर midlines साथ आधे में गुना जाता है, तो प्रस्तुत करने का एक छोड़ दिया है या सही "HEMI जानवर" कल्पना करने देता है.
  10. या तो वार्नर चैम्बर के रूप में एक छोटी मात्रा वाणिज्यिक कक्ष, या एक पाटने कवर पर्ची व्यवस्था के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड में 1.9 ऊतक माउंट. बढ़ते ऊतक पर सुझाव के लिए 3 भाग देखें.

भाग 2: Neuronal Bouton लेबल fluorescently लेबल एचआरपी के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ.

  1. HL-6 में एक पेट्री डिश पर एक बूंद में fluorescently लेबल प्राथमिक एचआरपी के खिलाफ विरोधी शरीर का 50 माइक्रो लीटर रखो. डाई स्नान में शरीर के अंदर बाहर की दीवार प्रस्तुत करने विसर्जित कर दिया. आप के बारे में 5 मिनट के बाद न्यूरॉन टर्मिनल लेबलिंग देख सकता है, लेकिन 10-20 मिनट के लिए एक पूर्ण और चमकदार लेबल के लिए सेते हैं.
  2. HL-6 में कमरे के तापमान पर 10-30 सेकंड के लिए डाई बंद कुल्ला. गैर बाध्य डाई जल्दी rinses, तो कुल्ला चक्र आक्रामक होने की जरूरत नहीं है.
  3. डाई एकाग्रता और ऊष्मायन समय के रूप में की जरूरत बदलती हैं.

भाग 3: dextran flurophore संयुग्म के साथ Perisynaptic अंतरिक्ष लेबलिंग

  1. पतला fluorescently संयुग्मित dextran डाई HL-6 में पतला. एक एकाग्रता है कि हमारे प्रयोजनों के लिए अच्छी तरह से काम किया था:
  2. यदि आप अपने बाह्य अंतरिक्ष में डाई उपयोग के समय के बारे में चिंतित नहीं हैं, एक "पाटने coverslip" (भाग 4 देखें) पर एक डाई के 20 माइक्रो लीटर ड्रॉप डाल दिया और डाई स्नान में प्रस्तुत करने का जमा.

भाग 4: दृश्य (confocal माइक्रोस्कोपी के साथ) के लिए ऊतक बढ़ते.

यदि आप करने के लिए अपने प्रस्तुत करने का (कम टिप्पणियों) perfuse नहीं की जरूरत है या आप के लिए स्नान HL-6 छोटे की मात्रा रखना चाहते हैं, डबल पाटने स्लाइड विधि का उपयोग करें

यदि आप अपने प्रस्तुत करने का perfuse चाहते हैं, एक छिड़काव कक्ष का उपयोग करने की कोशिश करें. हम एक मो इस्तेमालवार्नर उपकरण से dified चैंबर.

दोनों का पालन के लिए विवरण.

एक डबल पाटने स्लाइड पर बढ़ते प्रस्तुत करने का.

  1. एक बहुत साफ खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग करें. Superglue दो वर्ग, स्लाइड पर 18mm (# 1.5) coverslips. Coverslips के किनारों के बीच एक 2 मिमी अंतराल छोड़ दें.
  2. गोंद पूरी तरह से सूखी चलो, या यह चारों ओर अपने प्रस्तुत करने का जलीय मीडिया पर एक अजीब फिल्म के रूप में होगा.
  3. Coverslips के किनारों के बीच लार्वा बाहर अंदर स्थिति. आप एक विकर्ण पर प्रस्तुत करने की स्थिति अगर लार्वा बड़ी है और अपनी छवि अधिग्रहण प्रणाली एक सीमित पिक्सेल सरणी है की आवश्यकता हो सकती है.
  4. एक 1.5 coverslip, 18mm (बहुत साफ) के साथ ऊतक कवर. "ऊपर" coverslip स्लाइड ऊतक flanking फिसल जाता न्यूनतम वेसिलीन के साथ चिपका का पालन करें.
  5. 1.3379 के एक शीर्ष coverslip पर अपवर्तक सूचकांक (यदि आप HL-6 का उपयोग करें) के साथ कारगिल कस्टम उद्देश्य तेल की एक बूंद रखो और इस विधानसभा फ्लिप करने पर.
  6. अपने माइक्रोस्कोप, उद्देश्य की ओर तेल की ओर ऊतक विधानसभा की स्थिति, और अपने उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित.
    एक संशोधित छिड़काव कक्ष में ऊतक बढ़ते.
  7. गोंद एक 1.5 आर सी 20 कक्ष में एक मंजिल फार्म coverslip. आर सी 20-निर्देशों के अनुसार के रूप में स्थिति कक्ष में ऊतक. Nytex जाल का एक टुकड़ा के बजाय एक coverslip के कक्ष के लिए एक ही छत के के फार्म का प्रयोग करें.

भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:

  1. अंदर - बाहर ऊतक तैयारी विच्छेदन अनुक्रम:
    चित्रा 1
    W3 लार्वा, धोया ("Tubby" phenotype) (5.1.1). W3 लार्वा, पीछे 2 dissected खंडों. आप वसा शरीर के पार शरीर दीवार दबाव (तीर) द्वारा शरीर गुहा के बाहर धकेल दिया देख सकते हैं. विच्छेदन पहले शरीर दीवार 1 मिनट (5.1.2) में एक छोटा सा छेद करके आंत "विस्फोट" कम से कम करने की कोशिश करो. आंत के साथ प्रस्तुत करने का बाहर के अंदर प्रस्तुत करने का (5.1.3) मोड़ से पहले dissected. प्रस्तुत करने का, प्रस्तुत करने का (5.1.4) के लुमेन अंदर पिन (तीर) के साथ ज्यादातर everted. मांसपेशियों बाहर पर है और अब छल्ली अंदर पर कुछ वसा शरीर और संलग्न (5.1.5) trachioles के साथ है. लगभग सभी वसा शरीर और dissected trachioles (5.1.6) के साथ एक पूरी तरह से dissected ऊतक तैयारी.
    चित्रा 2
  2. लार्वा NMJ विरोधी एचआरपी का उपयोग लेबलिंग जीते. एक glial एक्सटेंशन बाहर प्रस्तुत करने का () के अंदर के साथ एक प्रतिनिधि W3 लार्वा synapse तंत्रिका पेशी. मोटर न्यूरॉन bouton टर्मिनलों (मैजंटा) एचआरपी, जो Cy5 संयुग्मित है के खिलाफ एक प्राथमिक विरोधी शरीर के साथ लेबल रहे हैं. glial प्रक्रियाओं GFP (हरी) के साथ लेबल रहे हैं.
    चित्रा 3
  3. Perisynaptic अंतरिक्ष fluorescently Alexa dextran 680 के साथ प्रस्तुत करने के बाहर एक के अंदर में visualized. glial प्रक्रिया (हरा) GFP लक्षित झिल्ली के साथ लेबल है. मांसपेशियों की सतह पर SSR के बाद synaptic (नीला) dsRed के साथ लेबल है. एलेक्सा dextran रूपों (लाल) कोशिकी क्षेत्रों में केंद्रित है. dextran डाई perisynaptic रिक्त स्थान में डोनट आकार पूल रूपों. dextran लेबलिंग और dsRed लेबल SSR ग्रेस्केल में दिखाई जाती हैं. नोट एकाधिक डोनट आकार डाई perisynaptic रिक्त स्थान (तीर) पर प्रकाश डाला पूल.

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Discussion

यह प्रक्रिया रहते लेबल प्रोटीन और सेल प्रक्रियाओं की लंबी अवधि के इमेजिंग परमिट. में सीटू ऊतक प्रस्तुत करने का हम वर्णित एक अक्षुण्ण और कामकाज सीएनएस, पीएन और पलटा सर्किट है. इस ऊतक तैयार करने का लार्वा उड़ मांसपेशियों मानक प्रोटोकॉल, (जब वह बाहर टिकी है) जहां लार्वा शरीर दीवार मांसपेशी फैला है से अधिक लाभ है. टूटती synaptic आकारिकी विकृत और पलटा आधारित संकुचन ट्रिगर कर सकते हैं. हमारे अंदर बाहर प्रस्तुत करने यंत्रवत् स्थिर था, और असाधारण अच्छा प्रकाशिकी है कि वास्तविक समय में सेलुलर परिवर्तन के उच्च संकल्प विश्लेषण में मदद की थी. इसके अलावा तैयारी अंदर से बाहर के लिए बच करने के लिए एक घंटे और एक लंबे समय के पाठ्यक्रम पर synaptic परिवर्तन की अनुमति दृश्य.

विच्छेदन के दौरान, पीएन या सीएनएस हानिकारक से बचने के ख्याल रखना. इसके अलावा फाड़ या इस नुकसान के रूप में tracheae पर खींच मांसपेशियों की कोशिकाओं से बचें. शरीर दीवार मांसपेशियों के रूप में संभव के रूप में आराम से रहो. HL-6 द्रुतशीतन और ऊतक शरीर दीवार मांसपेशियों को आराम और पार शरीर दीवार तनाव कम कर देता है. कृत्रिम hemolymph में कैल्शियम (2mm) स्वास्थ्य और glial कोशिकाओं की आकारिकी के लिए आवश्यक है.

इमेजिंग स्थिर, गैर करार मांसपेशी ऊतक पर निष्पादित किया जाना चाहिए. जबकि 5 मिमी ग्लूटामेट कुशलता neurally मांसपेशी संकुचन पैदा ब्लॉक है, कैल्शियम चैनल ब्लॉकर Nifedipine एक उपयोगी विकल्प हो सकता है. Nifedipine 10 micromolar ब्लॉक में सबसे तंत्रिका (लेकिन सभी नहीं) मांसपेशी संकुचन पैदा. मांसपेशी कोशिका neurotransmitter रिहाई के साथ जुड़े चैनल से अधिक प्रभावी ढंग से झिल्ली पर Nifedipine वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल ब्लॉक, इस प्रकार मांसपेशी संकुचन अवरुद्ध है, जबकि सामान्य NMJ synaptic समारोह (Morrales एट अल 1999) की अनुमति.

एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रिया का उपयोग करना, हम robustly कोशिकी कार्बोहाइड्रेट न्यूरॉन टर्मिनल, जो विरोधी एचआरपी प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं पर व्यक्त अवशेषों लेबल. हम उत्कृष्ट लेबलिंग जैक्सन प्रयोगशालाओं, उपलब्ध पूर्व संयुग्मित से fluorophores (हमारे अध्ययन Cy5 में) की एक किस्म के लिए विरोधी - एचआरपी एंटीबॉडी का उपयोग कर प्राप्त की. इस दृष्टिकोण किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी कि बाह्य मैट्रिक्स अणुओं लेबल उदाहरण के लिए एक बाह्य मिलान, पहचानता है के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित हो सकता है.

बगल में "अंदर बाहर" ऊतक तैयारी, सारस एट अल 2008 द्वारा इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के एक संशोधन के साथ युग्मित, सेलुलर प्रसार बाधाओं की जांच करने के लिए उपयोगी है. प्रतिदीप्त dextran डाई प्रसार भी समय और visualizing अंतर सेलुलर रिक्त स्थान, जैसे synaptic clefts में perfusate और दवा प्रविष्टि के लिए उपयोगी हो सकता है है.

फ्लोरोसेंट dextran रंगों के साथ, यह एक छोटी मात्रा छिड़काव कक्ष का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. अगर वहाँ भी "मोटी" डाई संरचना आप छवि के लिए तलाश को कवर समाधान की एक सीमा परत है, डाई समाधान इसके विपरीत डाई संचार रिक्त स्थान है और आसपास के ढांचे के बीच की कमी की वजह से ब्याज की सुविधा, अस्पष्ट हो सकता है.

अंत में, हमारे संरचनात्मक लेबलिंग तकनीक जीवित ऊतक के लिए एक उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली उपयुक्त की आवश्यकता है. हम Volocity सॉफ्टवेयर (कामचलाऊ व्यवस्था) के साथ संयोजन के रूप में कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी (कोरम प्रौद्योगिकियों और Perkin - Elmer सिस्टम), एक लंबे समय तक काम लंबाई, उच्च संख्यात्मक एपर्चर 63X पानी विसर्जन लेंस, और visualizing GFP के लिए उपयुक्त है, dsRed और दूर लाल लेसरों और फिल्टर fluorophores. इमेजिंग के लिए हम कारगिल प्रयोगशालाओं से कस्टम तैयार की खुर्दबीन उद्देश्य तेल का इस्तेमाल करने के लिए कृत्रिम hemolymph, 63X पानी विसर्जन लेंस के साथ संयोजन के रूप में HL-6, अपवर्तक सूचकांक मैच. इस तेल के बिना, अपवर्तक त्रुटि महत्वपूर्ण था और विकृत चित्र में हुई. सीटू की तैयारी में हमारे अन्य 3 डी इमेजिंग सिस्टम, जैसे एपीआई DeltaVision स्कैनिंग बहाली प्रणाली के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. हालाँकि, ध्यान मोटी, जीना ऊतक तैयारी से प्रकाश तितर बितर के उच्च स्तर पर काबू पाने के लिए लिया जाना चाहिए.

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Acknowledgments

इस परियोजना CIHR और NSERC द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम उड़ उपभेदों व्यक्त dsRed लेबल (बी.जे. लाइन), SSR, UBC और जैव इमेजिंग सुविधा के निर्माण में योगदान करने के लिए कंटिया Jusiak स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. Reagent N/A NA 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable Reagent Molecular Probes, Life Technologies D34680 Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) Reagent Jackson ImmunoResearch 123-175-021 Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit Reagent Molecular Probes, Life Technologies A10475 We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 Reagent Cargill Labs Custom Formulated
Ultra Fine Forceps Tool Fine Science Tools 11252-23 or 11295-20
Spring scissors Tool Fine Science Tools 91500-09
Ultra fine clipper scissors Tool Fine Science Tools 15200-00
Perfusion Chamber RC 20 Series Tool Warner Instruments 64-02222
Spinning Disc confocal Microscope Quorum Technologies Quorum Wave FX Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope

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References

  1. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  2. Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
  3. Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
  4. Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).

Comments

1 Comment

  1. Beautiful images. It would be great to see some data on how mobile the glial cell processes might be, and what mobilizes them. From watching the video, you indicate that some of the glial cell precesses run deep in the SSR, is this right? Can you refer me to any published electron microscopy that might show this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 16, 2009 - 4:09 PM

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