Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

Cette procédure commence par la préparation d’une larve de drosophile de manière à ce qu’elle ait été retournée pour exposer la paroi corporelle, la surface des cellules musculaires, les motoneurones associés et les cellules ggl en combinant la coloration fluorescente pour les terminaisons neuronales présynaptiques, l’expression endogène de la GFP et du rouge DS, ciblée sur les membranes des cellules musculaires gliales et postsynaptiques et la visualisation de l’espace parasynaptique à l’aide de colorants fluorescents, Une image claire des changements structurels se produisant au niveau de la jonction neuromusculaire gliale peut être observée dans une préparation vivante. Bonjour, je suis D. Brink au laboratoire de SLA de Vanessa à l’Université de la Colombie-Britannique, au département de zoologie. Aujourd’hui, je vais vous montrer une préparation tissulaire et deux techniques de marquage cellulaire pour l’imagerie de tissus de larves vivantes pour la microscopie confocale.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier les cellules gliales au niveau de la synapse du muscle nerveux. Alors maintenant, pour quelque chose de complètement différent, la préparation des tissus à l’envers commence par la mise en scène des larves. Cette procédure sera démontrée sur les troisièmes larves errantes car elles sont grandes et faciles à disséquer, n’utilisez que W trois larves qui rampent activement.

Ensuite, nettoyez la surface des larves avec un pinceau très doux dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée doublement. Le nettoyage des larves est important car il permet d’obtenir une meilleure optique et de réduire les bactéries. Une fois les larves nettoyées, transférez-la dans une petite boîte de Pétri avec trois millilitres de HL glacé six avec cinq millimolaires de glutamate.

Mettez le plat sur de la glace jusqu’à ce que l’animal cesse de bouger et se détende, ce qui prend généralement environ deux minutes. Une fois que les larves ont cessé de bouger, vous pouvez commencer la dissection tissulaire à l’aide d’un microscope de dissection en tenant les ciseaux à ressort dans votre main dominante et la pince à pointe très fine. D’autre part, faites un petit trou dans la paroi du corps avec les ciseaux pour équilibrer la pression sur la paroi du corps tout en tenant doucement l’animal au fond du plat.

Avec la pince coupée les deux segments postérieurs, disséquez les viscères. Un corps adipeux sortira probablement de la cavité corporelle par l’incision. Coupez également ce tissu.

Continuez à tenir doucement les larves contre le fond du plat avec la pince fine. De l’autre main, tenez une épingle à insectes à pointe émoussée numéro zéro et poussez-la contre les pièces buccales des larves. Poussez les pièces buccales à travers la cavité corporelle comme si vous retourniez une chaussette sur votre poing.

Le tissu à l’envers devrait ressembler à ceci. Avec les ciseaux à ressort de dissection ultra fins, disséquez le corps gras et les trachées de la paroi du corps. Retirez autant de corps gras que possible.

Essayez très fort de ne pas tirer les traches ou de déconnecter le système nerveux. Déchirer les traches déchirera des trous dans le muscle de la paroi corporelle. Lorsque vous avez terminé la dissection, le muscle doit être translucide et détendu, non opaque ou contracté.

Si vous mettez le muscle dans HL six sans glutamate à température ambiante, il se contractera probablement rythmiquement. Parce que les générateurs de motif moteur dans le SNC sont actifs, la paroi intacte du corps à l’envers a tendance à se plier en deux le long des lignes médianes dorsale et ventrale. Ainsi, la préparation donne un hémicycle gauche ou droit à visualiser.

Enfin, montez le tissu dans une lame de microscope à l’aide d’une lamelle de recouvrement pontée. Les procédures de montage du tissu seront montrées plus tard. Pour commencer à marquer les bâtons neuronaux, pipetez 30 microlitres de solution d’anticorps primaires anti-HRP marquée par fluorescence dans HL six et placez une goutte sur une boîte de Pétri.

Ensuite, immergez la préparation de la paroi corporelle à l’envers. Dans le bain de matrice. Vous pouvez voir l’étiquetage terminal des neurones après environ cinq minutes, mais incuber pendant 10 à 20 minutes pour un étiquetage complet et brillant.

Pour rincer l’étiquette HRP en excès, mettez le mouchoir dans un demi-millilitre de HL six pendant 10 à 30 secondes à température ambiante. Le colorant non lié se rince rapidement, de sorte que le cycle de rinçage n’a pas besoin d’être long ou vigoureux. Le tissu marqué est maintenant prêt à être monté et visualisé par microscopie.

Une variante du protocole de marquage d’anticorps vivants qui vient d’être présenté consiste à utiliser une dextrine conjuguée par fluorescence pour mettre en évidence les espaces extracellulaires remplis de liquide. Pour commencer cette procédure, diluez le colorant de dextrine conjugué par fluorescence dans HL six à 0,001 milligramme par millilitre. Vous devrez peut-être faire varier la concentration de dextrine si vous n’êtes pas préoccupé par le moment exact de l’axe di dans l’espace extracellulaire.

Pipetez une goutte de 20 microlitres de colorant sur une lamelle pontée et transférez la préparation tissulaire dans le bain de colorant. Si le tissu à l’envers n’a pas besoin d’être perfusé ou si le volume de HL six doit être réduit, il peut être monté sur une glissière à double pont. Commencez par coller deux lamelles carrées de 18 millimètres sur une lame de microscope très propre.

Laissez un espace de deux millimètres entre les bords des lamelles et centrez l’espace. À peu près au milieu de la diapositive. Laissez la colle sécher complètement ou elle formera un film sur le support aqueux autour de votre préparation de tissus.

Ensuite, placez une goutte de 30 microlitres de HL six dans l’espace entre les caillus. Positionnez le tissu à l’envers dans la goutte de HL six. Vous devrez peut-être positionner le tissu en diagonale si la larve est grande et que votre système d’acquisition d’images dispose d’un réseau de pixels limité.

Appliquez une petite quantité de vaseline sur les bords d’une troisième lamelle de 18 millimètres et placez-la côté graisse vers le bas sur les deux capots collés sur le mouchoir, appuyez doucement. Voici les résultats de nos deux méthodes de marquage fluorescent aigu de la préparation larvaire de l’intérieur vers l’extérieur obtenues avec un microscope confocal à disque tournant. La première est une image d’empilement optique d’une synapse musculaire du nerf glial avec des terminaisons Buton marquées en direct anti HRP.

À la surface de la cellule musculaire, nous pouvons voir des terminaisons de type neurone clairement marquées, pseudo colorées en bleu. Au milieu de la pile d’images, nous trouvons des extensions gliales étiquetées GFP en vert, ainsi que des bâtons bleus marqués HRP. En encerclant les bâtons, nous pouvons voir des sections transversales de la poche comme le SSR, les subs, les réticules synaptiques, qui sont colorés en rouge également au milieu de la pile et au fond de la pile se trouvent les DS étiquetés en rouge SSR.

Les SSR sont les régions synaptiques spécialisées de la cellule musculaire. Les bns se nichent à l’intérieur des poches des cellules musculaires, tout comme certaines parties des extensions gliales vertes. Les extensions des cellules gliales s’intercalent autour du BNS et du SSR, mais ne couvrent pas la surface de la synapse comme une couverture dans les couches les plus profondes de l’empilement.

On retrouve les extensions gliales vertes et le SSR rouge, mais pas autant de terminaux de buton. Nous pouvons également trouver des coupes transversales du nerf moteur qui innerve le muscle. Les cellules gliales enveloppent le nerf moteur, il est donc également vert.

Le deuxième résultat du marquage fluorescent aigu de la préparation larvaire à l’envers est la synapse marquée à la dextrine fluorescente. Ici, le liquide dans l’espace para-synaptique ou la fente synaptique est étiqueté en rouge. Sur les couches superficielles de l’image de l’empilement optique, il y a une couche fluide de colorant de dextrine rouge, et vous pouvez voir où elle s’accumule dans les dépressions ondulatoires sur la membrane plasmique musculaire.

Dans les couches plus profondes de la pile, le colorant fluorescent de dextrine s’est infiltré dans les fentes synaptiques, de petits anneaux de colorant en forme de beignet se forment entre les terminaisons neuronales et les poches SSR marquées en bleu. Il s’agit de la fente synaptique mise en évidence par un colorant. La lamelle gliale verte ne bloque pas la pénétration du colorant dans la fente dans les couches profondes de la pile d’images.

Les caractéristiques les plus importantes sont la SSR ou région synaptique du muscle étiquetée en bleu, et les extensions gliales plates qui sont vertes. De même, la gaine gliale autour des axones déconcertants observés dans les couches profondes est verte. La gaine gliale semble exclure le colorant de dextrine.

Je viens de vous montrer une nouvelle façon de visualiser la synapse musculaire du nerf glial dans une préparation tissulaire à l’envers des larves de drosophile. Lors de la préparation des tissus, il est important de ne pas oublier de s’efforcer de manipuler les tissus avec précaution et de s’assurer que le muscle est détendu et que les nerfs périphériques ne sont pas endommagés. J’aimerais conclure par une citation de Marx.

Le temps passe comme une flèche. La peur vole comme une banane.