Ядерная передача в ооциты мыши

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот фильм и протокол призваны помочь обучению переноса ядра.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ядерные передачи в неоплодотворенные яйцеклетки может восстановить потенциал развития в дифференцированные клетки. Это показывает, что процессы, лежащие развития, дифференциации и старения эпигенетические, а не генетические процессы. Обратимость этих процессов открывает захватывающие перспективы в области фундаментальных исследований, а в более отдаленном будущем, в регенеративной медицине. В мыши, эмбриональные стволовые клетки могут быть получены из клонированных эмбрионов предимплантационной стадии. Такие эмбриональные стволовые клетки обладают способностью давать начало всем типам клетка взрослого организма. Важно, что эти клетки генетически идентичны донору. Если это применимо к человеку, это позволило бы вывод стволовые клетки пациента. Эти клетки могут затем быть дифференцированы в пострадавших типа клеток самого пациента и учился в пробирке, или использоваться для замены поврежденных или отсутствующих клеток. Изучение переноса ядра в мышь по-прежнему важно, как он может сообщить нам о принципах ядерного перепрограммирования. Этот фильм и сопровождающие протокол призваны помочь обучению переноса ядра в мышь, метод разработан в группе профессора Уапа (Вакаяма и соавт. 1998).

Protocol

Препараты:

  1. Подробное описание суперовуляции и микрокапельной культуры эмбриона может быть найден в другом месте 2.
  2. Подготовка чашки Петри с микрокапель эмбриона культуральной среде (например, KSOM, Chemicon). Обложка с минеральным маслом (партий нефтепродуктов должны быть проверены на совместимость с эмбрионом культуры). Равновесия при температуре 37 ° С на воздухе плюс 5% СО 2. (В Термо-Электрон 3110 водяной рубашкой инкубатор или эквивалент)
  3. Подготовка блюдо для изоляции ооцитов: Место капель HEPES буфере CZB и гиалуронидазы (0,1% м / о, Sigma) в одной половине блюдо и HCZB в другой половине. Крышка с минеральным маслом. Держите блюдо теплым на нагретой этапе вскрытия микроскопом.
  4. Подготовка микроскопом: Место проведения пипетку наружным диаметром около 50 μ м (немного меньше, чем диаметр ооцита), и открытие около 20 μ м в одной пипетки держателя. Холдинг пипетки легко сделать с необходимым оборудованием, иглы съемник (Саттер Instruments) и microforge (Narishige), но они также могут быть приобретены у Humagen.

    Нагрузка 3-5 μ л ртути в хвосте микропипетки (внутренний диаметр 8 μ м). Избегайте ртути разливов. Подготовка блюдо с нескольких небольших капель на 11% вес / ПВП (поливинилпирролидон) в HCZB и 5 μ г / мл цитохалазин в HCZB. Используйте крышку чашки Петри, а не блюдо себя как крышка имеет короткий край, что не будет мешать движению и проведению энуклеации пипеток. Совместите проведения пипетки и энуклеации пипетки в падение HCZB. Аспирируйте немного HZCB на кончике пипетки холдинга.
  5. Подготовка донорских клеток во многом зависит от типа клеток и эксперимента следователь намерен выполнять. В общем, донорских клеток, следует относиться с протеолитических ферментов, таких как трипсин и держится на льду, чтобы уменьшить липкость до передачи.
  6. Гуманно усыпить мышей 14-15 часов после введения ХГЧ. Урожай яйцеводы и анализировать их в теплой HCZB-гиалуронидазы капель. После ок. 5 мин, ооциты будут в основном свободны от кучевых клеток. Они должны быть затем промывают несколько раз в HCZB, затем промывают в дальнейшем предварительно уравновешенную капель KSOM, и хранятся в инкубаторе до энуклеации.

Энуклеация

Манипуляции осуществляются с гидравлическим микроманипуляторами, (Narishige) на инвертированный микроскоп, такие как Nikon TE200. Микроманипулятора пьезо (Primetech) используется для бурения зона pellucida. Плоским наконечником энуклеации и передачи пипетки можно приобрести у Humagen. Очистите и смажьте энуклеации пипетки в ПВП капель, выслав микроскопические капельки ртути и аспирационных и исключение ПВП. Для предотвращения клейкости иглы, то же процедура должна быть выполнена между каждой группой ооцитов, которые либо энуклеированных или переданы.

Место небольшая группа ооцитов в HCZB-цитохалазином падение B. Размер группы должны быть адаптированы к уровню опыта исследователя. Ооцитов не должны храниться на сцене дольше, чем 20-30 мин. Перемещение инструментов HCZB-цитохалазин капель. Проведение пипетки и энуклеации пипетки должны быть приведены в соответствие с экваториальной плоскости яйцеклетки. Это станет возможным, если проведение пипетка имеет наружный диаметр, что немного меньше, чем яйцеклетки себя. Поворот яйцеклетки до разному преломления метафазы шпинделя могут быть видны. Если новичок не может видеть шпинделя, метафазной пластинки можно получить, используя ДНК красителя Hoechst и ультрафиолетовое освещение, однако, что не совместимо с эффективным эмбрионального развития. Позиция метафазы шпинделя в 3 часа и удерживайте ее хорошо с проведением пипетки. Применить пьезо импульсов проникнуть зона pellucida. Сенсорный метафазной пластинки с энуклеации пипетки. Как только сопротивление метафазы шпинделя может быть "чувствовал", аспирация шпинделя и вывести иглу. Цитоплазме ооцита является жидкостью, метафазы шпинделя однако движется как комок при прикосновении с пипеткой. Постарайтесь уменьшить количество цитоплазмы, который удаляется с шпинделя. После группы ооцитов была энуклеированных, мыть их через эмбрион культуральной среде и их размещение в инкубаторе до передачи. Некоторые энуклеированных ооцитов не должно быть передано, но должна быть активирована и служить в качестве контроля для энуклеации. Эти ооциты будет фрагмента в течение нескольких часов, что указывает на успешное энуклеации.

Ядерная передача

Место клеток в ПВП решение (11% ПВП в HCZB). Если многие клоны арест на 1-клеточной стадии, концентрации ПВП должен быть снижен до 5% или менее. Смешайте клетки и остроумиеч ПВП. Возьмите клеток с пипеткой с внутренним диаметром чуть меньше, чем диаметр клетки. Мембране клетки должно сломаться при аспирации. В некоторых случаях, повторяющиеся исключения и аспирации, а также применение нежные импульсы пьезо может быть использован для разрыва клетки-донора. Новая капля донорской клетки должны быть сделаны с каждой группы ооцитов, которые передаются, как донорских клеток становятся липкими через некоторое время. Inject сломанной донорских клеток вскоре после разрыва мембраны. Для передачи, сосредоточиться на экваториальной плоскости ооцитов себя, а не экваториальной плоскости зона pellucida, и положение передачу и проведение пипетки в одной плоскости. Держите ооцитов в том числе часть своей цитоплазмы твердо. Проникнуть зона pellucida использованием пьезоэлектрических импульсов. Принесите донора ядра до кончика пипетки, затем нажмите кончиком пипетки почти до противоположной стороны извлекли ядра яйцеклетки, близких к проведению пипетки, делая глубокие борозды в яйцеклетки. Аспирируйте очень небольшое количество цитоплазме ооцита в пипетку, нанесите один слабый пульс пьезо сломать ооцитов мембраны, извлечь донора ядра, извлеките иглу быстро, а аспирационных на цитоплазматические мембраны в правом конце борозды. При одновременном снятии иглой и аспирационных, она должна быть предусмотрена возможность закрытия отверстий, оставленных NT. Эта «дыра удаления техника позволит сократить количество яйцеклеток, что во время лизиса NT. Вымойте реконструированных яйцеклеток в KSOM и возвращения их в инкубатор на 1-3 часов.

Ооцитов активации

Подготовка половины блюдо с капельками кальция свободного MCZB, а другая половина с каплями кальция свободного MCZB плюс 10 мМ Sr 2 + и 5 μ г / мл цитохалазин ингибировать полярных экструзии тело. Равновесие в течение 30 мин. под 5% CO 2 в воздухе. Вымойте NT эмбрионы хорошо в бескальциевой MCZB, а затем поместить их в небольшие группы в различных капель бескальциевой MCZB. Вернуться блюдо инкубатора и культуры в течение 5-6 часов. Для контроля за искусственными протокол активации и для условий культивирования эмбрионов, не извлекли ядра ооцитов должны быть использованы. Они будут развиваться как партеногенетических эмбрионов. После активации, мыть эмбрионов путем KSOM и место эмбрионов в инкубаторе для долгосрочного культуры. Пронуклеусы должны быть видны в это время точки, указывая на успешную передачу.

Эмбрион Культурное Cookbook

Мастер Соли

Начните с 980 мл сверхчистой H 2 O в стерильных 1 л бутылка

Добавить сухие компоненты:

NaCl 4760 мг (81 мм) Sigma S-5886
KCl 360 мг (5 мм), Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 мг (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 мг (1.17mM) Sigma P-5655
ЭДТА 2NA 40 мг (0,1 мм) Sigma E-6635
Глюкоза (D) 1000 мг (5,5 мм) Sigma G-6152

Добавить жидкие компоненты

Na-лактата (молочной кислоты) 5,3 мл & NBSP; Сигма 44263
Pen'Strep 10 мл Gibco 15140-122

Для Соли MCZB складе:

Фильтры стерилизовать 500 мл мастер солей (хороший в течение 3-4 месяцев, хранить при 4 ° С)

Для Соли HCZB складе:

Начните с 500 мл соли мастера

Добавить 50 мг ПВА (холодный растворимый, Sigma P-8136)

Перемешать в течение 30-60 мин и стерильный фильтр (хорошо для 3-х месяцев, хранить при 4 ° С)

Са + + Бесплатный MCZB (для активации ооцитов в 5% CO 2)

Начните с 99 мл соли MCZB акции

Добавить сухие компоненты:


NaHCO 3 211 мг Sigma S-5761

Na-пирувата (пировиноградной кислоты) 3 мг Sigma P-4562

L-Глютамин 15 мг Sigma G-8540

Бычий сывороточный альбумин (BSA) 500 мг Сигма-3311

Swirl, пока все компоненты растворяются, стерильный фильтр.

HCZB (для микроманипуляция в окружающей атмосфере)

Начните с 99 мл соли HCZB акции

Добавить сухие компоненты:


Hepes-Na 520 мг Sigma H-3784

NaHCO 3 42 мг Sigma S-5761

Добавить жидких компонентов:

128 мМ CaCl 2 (18.8g / л) 1 мл Sigma C-7902

Отрегулируйте рН до 7,5 с 1 N HCl

Swirl до полного растворения, стерильный фильтр.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Удачи!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

DE хотели бы поблагодарить д-ра Скрыть Akutsu для обмена его NT трюки и д-р Стивен Салливан и Гаррета Биркгофа для критических чтение протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics