마우스 Oocytes에 핵 전송

Biology

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Summary

이 영화와 프로토콜은 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

unfertilized oocyte에 핵 송금은 차별화된 세포로 발달 잠재력을 복원할 수 있습니다. 이것은 개발, 차별과 노화 기본 프로세스가 아니라 유전자 공정보다 epigenetic는 것을 보여줍니다. 이러한 프로세스의 안팎이 없게 짠 천성은 재생 의학에서 기초 연구에 흥미로운 관점을 열고, 그리고 더 먼 미래 인치 마우스에서 배아 줄기 세포는 복제 preimplantation 스테이지 배아에서 파생된 수 있습니다. 이러한 배아 줄기 세포는 성인 유기체의 모든 세포 유형을 일으키다 수있는 능력이 있습니다. 중요한 것은,이 세포는 기증자에게 유전자 동일합니다. 인간에 ​​적용되는 경우,이 환​​자에서 줄기 세포의 파생을 허용합니다. 이러한 세포는 다음 환자의 영향을 세포 유형으로 차별하고 체외에서 공부하거나, 손상되었거나없는 세포를 대체하는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 핵 프로그래밍의 원리에 대한 정보를 알려줄 수로 마우스에 핵 이전의 연구는 중요한 남아 있습니다. 이 영화와 함께 프로토콜이 마우스에 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다, 처음에 교수 야나기 (와카야마 외. 1998)의 그룹에있는 방법을 개발했습니다.

Protocol

준비 :

  1. superovulation 및 microdrop 배아 문화의 자세한 설명은 다른 찾을 수 있습니다.
  2. 배아 문화 매체 microdrops (예 : KSOM, Chemicon)를 배양 접시를 준비합니다. 미네랄 오일 (미네랄 오일 일괄는 배아 문화과의 호환성을 위해 테스트해야합니다)와 커버. 37 평형 ° 공기 플러스 5% CO 2에서 C. (온습 전자 3,110 물을 외피 보육 또는 동급에서)
  3. oocytes의 격리를 위해 요리를 준비 : hepes 장소의 방울은 다른 반쪽의 요리와 HCZB 중 절반 (0.1 % W / V, 시그마) hyaluronidase & CZB 버퍼. 미네랄 오일 커버. 해부 현미경의 열띤 무대에서 요리를 따뜻하게 유지.
  4. 플레이스 약 50 μ M (oocyte의 직경보다 약간 작은)의 외경의 개최 피펫, 피펫 한 자의 약 20 μ m의 개방 : 현미경을 준비합니다. 개최 pipettes는 필요한 장비, 바늘 풀러 (셔터 인 스트 루먼트)와 microforge (Narishige)로 만들어 쉽게, 그러나 그들도 Humagen에서 구입하실 수 있습니다.

    micropipette (내경 8 μ의 m)의 꼬리에 3-5 μ의 내 수은을로드합니다. 수은의 유출을 피하십시오. 여러 개의 작은 방울 11% 각 HCZB에 W / V PVP (polyvinylpyrrolidone) 5 μ g / HCZB에 ML cytochalasin B와 함께 요리를 준비합니다. 뚜껑은 잡고 핵의 제거의 pipettes의 움직임을 방해하지 않습니다 짧은 가장자리가로 페트리 접시의 뚜껑보다는 접시 자체를 사용합니다. HCZB 드롭에서 개최 피펫과 핵의 제거의 피펫을 맞춥니다. 개최 피펫의 끝에 조금 HZCB를 대기음.
  5. 기증자 세포의 준비는 크게 셀 유형과 조사가 수행하고자하는 실험에 따라 달라집니다. 일반적으로 기증자 세포는 같은 트립신과 같은 proteolytic 효소로 치료 및 전송까지 끈적 거림을 줄이기 위해 얼음에 보관해야합니다.
  6. 편안 hCG의 관리 후 생쥐에게 14~15시간를 안락사. 하베스트 oviducts과 따뜻한 HCZB - hyaluronidase 방울에서 그들을 해부하다. 후 약. 5 분, oocytes는 적운 세포에서 대부분 무료입니다. 그런 다음 다음 사전 equilibrated KSOM의 방울에서 추가 씻어, HCZB에서 여러 번 씻어, 그리고 핵의 제거까지 인큐베이터에 보관해야합니다.

핵의 제거

노는 그러한 니콘 TE200로 거꾸로 현미경에 유압 micromanipulators (Narishige)로 이루어집니다. 압전의 micromanipulator (Primetech)은 조나 pellucida를 시추하는 데 사용됩니다. 플랫 - 스쳐 핵의 제거 및 전송 pipettes은 Humagen에서 구입하실 수 있습니다. 미세한 수은의 방울을 추방하여과 PVP를 aspirating하고 추방하여 깨끗하고 PVP 방울의 핵의 제거의 피펫에 기름칠을. 바늘의 끈적 거림을 방지하기 위해 같은 절차를 중 enucleated 또는 전송됩니다 oocytes 각 그룹 사이에 완료되어야합니다.

HCZB - cytochalasin B 드롭에 oocytes의 작은 그룹을 놓으십시오. 그룹의 크기는 조사의 경험의 수준으로 조정해야합니다. Oocytes은 20-30 분 이상을 위해 무대에 보관해서는 안됩니다. HCZB - cytochalasin B 방울로 악기를 이동합니다. 개최 피펫과 피펫의 핵의 제거는 oocyte의 적도 평면과 정렬을 가지고 있어야합니다. 보관 피펫이 oocyte 자체보다 약간 작은 외경이있다면이 가능합니다. 다른 굴절률 metaphase 스핀들을 볼 수있을 때까지 oocyte를 돌리세요. 초보자가 스핀들을 볼 수없는 경우, metaphase 판은 효율적인 배아 발달과 호환되지 않습니다 그러나 DNA 염색 Hoechst와 자외선 조명을 사용하여 확인할 수 있습니다. 3 시방향에 metaphase 스핀들 위치하고 개최 피펫과 잘 들어요. 조나 pellucida에 침투 압전 펄스를 적용합니다. 핵의 제거의 피펫으로 metaphase 접시를 터치. metaphase 스핀들의 저항은 '기분'가능되면 스핀들을 기음과 바늘을 철회. 피펫과 접촉할 때 oocyte의 세포질은 유체이며, metaphase 스핀들 그러나 덩어리로 이동합니다. 스핀들과 함께 제거됩니다 세포질의 양을 줄이기 위해보십시오. oocytes의 그룹이 enucleated 후에는 배아 문화 매체를 통해 그들을 씻어 및 전송까지 배양기에 그들을 놓으십시오. 일부 enucleated oocytes는 전송하지 않아야하지만, 활성화되어야하며 핵의 제거를 제어하는​​ 역할을합니다. 몇 시간이 oocytes 것입 조각, 성공적인 핵의 제거를 말해줍니다.

핵 전송

PVP 용액 (11 % HCZB에서 PVP)에 플레이스 세포. 1 세포 단계에서 많은 클론의 체포하면 PVP 농도 5 % 이하로 인하해야합니다. 혼합 세포 잘 재치H PVP. 세포의 지름보다 약간 작은 내경을 가진 피펫과 조직을 선택하십시오. 세포의 막이 열망에 휴식한다. 어떤 경우에는 반복적인 추방과 열망뿐만 아니라 부드러운 압전 펄스의 응용 프로그램은 기증자의 세포를 휴식하는 데 사용할 수 있습니다. 기증자 세포가 잠시 후 끈적 해짐에 따라 기증자 세포의 새로운 방울이 전송되는 oocytes의 각 단체와 함께하여야한다. 곧 멤브레인을 깨는 후 깨진 기증자의 세포를 주사. 전송, oocyte 자체보다는 조나 pellucida의 적도 비행기의 적도 비행기에 초점을, 같은 비행기의 전송 및 보관 피펫 위치를. 단호의 세포질의 일부​​를 포함한 oocyte 잡아. 압전 펄스를 사용하여 조나 pellucida에 침투. 피펫의 팁을에 기증자의 핵을 가지고 다음 oocyte에 깊은 고랑을 만들고, 가까운 개최 피펫에, 거의 enucleated oocyte의 반대편에 피펫 팁 밀어. 피펫으로 oocyte의 세포질의 매우 작은 금액을 기음, oocyte 막을 깰 수있는 하나의 약한 압전 펄스를 적용 기증자의 핵을 추출, 고랑의 오른쪽 끝에있는 세포질 막에 aspirating 동안 급속하게 바늘을 철회. 동시에 바늘을 철수하고 aspirating함으로써, NT에 의해 남겨진 구멍을 닫을 수 있어야한다. 이 '구멍 제거 기술은 NT 동안 lyse oocytes의 수를 줄일 수 있습니다. KSOM에서 복원 oocytes을 씻고 1-3시간위한 배양기로 돌아갑니다.

Oocyte 활성화

칼슘 무료 MCZB의 방울과 칼슘을 무료로 MCZB 플러스 10mM 시니어 2 방울과 나머지 절반과 요리 중 하나가 절반을 준비 + 및 북극 신체 압출을 억제 5 μ g / ML cytochalasin B. 30 분 평형. 5 미만 %가 공중으로 2 CO. 칼슘 무료 MCZB에 잘 NT의 배아를 세척 후 칼슘 무료 MCZB의 다른 방울의 작은 그룹에서 그들을 놓으십시오. 5~6시간에 대한 보육 및 문화에 요리를 반환합니다. 인공 인증 프로토콜 및 배아 문화 조건을 제어하려면이 아닌 enucleated oocytes를 사용해야합니다. 그들은 parthenogenetic의 배아로 개발합니다. 활성화에 따라, 장기 문화의 인큐베이터에 KSOM과 장소 배아를 통해 배아를 씻으십시오. Pronuclei가 성공적으로 전송을 나타내는,이 시점에 표시되어야합니다.

배아 문화 미디어 요리책

마스터 솔츠

무균 1 L 병에 980 ML ultrapure H 2 O로 시작

건조 구성 요소를 추가합니다

NaCl 4,760 MG (81mM) 시그마 S - 5886
KCl 360 MG (5mM) 시그마 P - 5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 MG (1.18mM) 시그마 M - 2773
KH 2 PO 4 160 MG (1.17mM) 시그마 P - 5655
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2NA 40 MG (0.1mM) 시그마 E - 6635
포도당 (D) 1000 MG (5.5mM) 시그마 G - 6152

액체 구성 요소 추가

나 - 락트 산 (젖산) 5.3 ML & NBSP; 시그마 44,263
Pen'Strep 10 ML Gibco 15140-122

MCZB 스톡 솔츠 경우 :

소독 500 ML 마스터 소금을 (; 4 저장 ° C 3~4개월에 좋은) 필터

HCZB 스톡 솔츠 경우 :

500 ML 마스터 염 시작

(; 시그마 P - 8136 얼음 용해) 50 MG PVA 추가

30-60 분 및 필터 멸균 (; 4 저장 ° C 3 개월 동안 좋은)에 휘저어

칼슘 + + 무료 MCZB (5 % CO 2에서 oocytes 활성화를위한)

99 ML MCZB 주식 염 시작

건조 구성 요소를 추가합니다


NaHCO 3 211 MG 시그마 S - 5761

나 - pyruvate (pyruvic 산성) 3 MG 시그마 P - 4562

L - 글루타민 15mg 시그마 G - 8540

소 혈청 알부민 (BSA) 500 MG 시그마 A - 3311

모든 구성 요소까지 소용돌이가 해소되며 살균 필터.

HCZB (주위 분위기에서 미세 조작에 대한)

99 ML HCZB 주식 염 시작

건조 구성 요소를 추가합니다


Hepes - 나 520 MG 시그마 H - 3784

NaHCO 3 42 MG 시그마 S - 5761

액체 구성 요소를 추가합니다

128 MM CaCl 2 (18.8g / L) 1 ML 시그마 C - 7902

1 N HCL와 7.5 산도를 조정

녹아까지 소용돌이, 멸균 필터.

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Discussion

행운을 빕니다!

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Acknowledgments

DE는 프로토콜의 중요한 독서에 대한 그의 NT 트릭과 박사 스테판 설리번과 개렛 Birkhoff를 공유하기위한 박사 숨기기 아쿠쓰 감사하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

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References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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