Kärnöverföring till Mouse oocyter

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna film och protokollet är avsedda att hjälpa lära kärnöverföring.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kärnöverföring till en obefruktade ägget kan återställa utvecklingspotential i en differentierad cell. Detta visar att de processer som ligger bakom utvecklingen, differentiering och åldrande är epigenetisk snarare än genetisk processer. Reversibiliteten av dessa processer öppnar spännande perspektiv inom grundforskning och på mer avlägsna framtiden, regenerativ medicin. I musen kan embryonala stamceller hämtas från klonade embryon preimplantatorisk skede. Sådana embryonala stamceller har förmågan att ge upphov till alla celltyper i den vuxna organismen. Viktigare är att dessa celler är genetiskt identiska till donatorn. Om tillämpligt för människors, skulle detta göra det möjligt härledning av stamceller från en patient. Dessa celler kan sedan delas in i de drabbade celltyp av patienten och studerade in vitro, eller användas för att ersätta skadade eller saknade celler. Studien av kärnöverföring i musen är viktig eftersom den kan upplysa oss om principerna för kärnkraft omprogrammering. Den här filmen och den åtföljande protokollet är avsedda att hjälpa lärandet kärnöverföring hos mus, en metod som först utvecklades i den grupp av professor Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

Protocol

Förberedelser:

  1. En detaljerad beskrivning av superovulation och microdrop embryo kultur kan hittas någon annanstans 2.
  2. Förbered en petriskål med microdrops av embryon odlingssubstrat (t.ex. KSOM, Chemicon). Täck med mineralolja (mineralolja partier bör testas för kompatibilitet med embryo kultur). Utjämna till 37 ° C i luft plus 5% CO 2. (I Thermo-Electron 3110 vatten mantlade inkubator eller motsvarande)
  3. Förbered en maträtt för isolering av oocyter: Placera droppar Hepes buffrad CZB & hyaluronidas (0,1% w / v, Sigma) i ena halvan av skålen och HCZB i den andra hälften. Täck med mineralolja. Håll skålen varm på en uppvärmd skede av en dissektion mikroskop.
  4. Förbered mikroskop: Placera ett innehav pipett med en yttre diameter på ca 50 μ m (något mindre än diametern på ägget), och en öppning på ca 20 μ m en pipett hållaren. Holding pipetter är lätta att göra med nödvändig utrustning, en nål avdragare (Sutter instrument) och en microforge (Narishige), men de kan också köpas från Humagen.

    Belastning 3-5 kvicksilver μ L i svansen på en mikropipett (innerdiameter 8 μ m). Undvik kvicksilverspill. Förbered ett fat med flera små droppar vardera 11% w / v PVP (polyvinylpyrrolidon) i HCZB och 5 μ g / ml cytochalasin B i HCZB. Använd locket på en petriskål snarare än skålen själv som locket har en kort fälg som inte kommer att störa flödet av innehavet och pipetter enucleation. Rikta hålla pipetten och enucleation pipetten HCZB släpp. Aspirera lite HZCB i spetsen av innehavet pipetten.
  5. Beredning av donator celler beror till stor del på celltyp och experimentet utredaren avser att utföra. I allmänhet bör givarnas celler behandlas med en proteolytiskt enzym som trypsin och förvaras på is för att minska klibbighet tills överföringen.
  6. Humant sätt avliva möss 14-15 timmar efter administrering av hCG. Harvest äggledarna och dissekera dem i den varma HCZB-hyaluronidas droppar. Efter ca. 5 min, kommer oocyter vara mestadels fri från cumulus celler. De bör då tvättas flera gånger i HCZB, sedan tvättas ytterligare i pre-jämvikt KSOM droppar, och hålls i inkubatorn tills enucleation.

Enucleation

Manipulationer görs med hydraulisk micromanipulators, (Narishige) på ett inverterat mikroskop, som Nikon TE200. En piezo-mikromanipulator (Primetech) används för att borra zona pellucida. Platt spets enucleation och pipetter överföring kan köpas från Humagen. Rengör och smörj enucleation pipetten i PVP droppar genom att utvisa mikroskopiska kvicksilver droppar och genom att aspirera och utvisa PVP. För att förhindra klibbighet av nålen, bör samma förfarande ske mellan varje grupp av oocyter som antingen enucleated eller överförs.

Placera en liten grupp av äggceller till HCZB-cytochalasin B-släpp. Storleken på gruppen bör anpassas till graden av erfarenhet av utredaren. Oocyter bör inte hållas på scenen längre än 20-30 min. Flytta instrumenten till HCZB-cytochalasin B-droppar. Innehavet pipetten och enucleation pipetten bör bringas i linje med de ekvatoriella plan äggcellen. Detta blir möjligt om innehavet pipetten har en ytterdiameter som är något mindre än äggcellen själv. Rotera ett äggcellen tills annorlunda brytningsindex metafas spindel kan ses. Om en nybörjare inte kan se spindeln kan metafas plåten kan identifieras med hjälp av DNA-dye Hoechst och UV-belysning, men det är inte förenligt med ett effektivt embryots utveckling. Placera metafas spindeln klockan 3 och håll det väl med att hålla pipetten. Applicera piezo pulser att penetrera zona pellucida. Peka på metafas plattan med enucleation pipetten. När motståndet i metafas spindel kan vara "känt", aspirera spindeln och dra ut nålen. Äggcellen cytoplasma är flytande, flyttar metafas spindeln dock som en klump vid beröring med pipett. Försök att minska mängden cytoplasman som avlägsnas med spindeln. Efter en grupp av oocyter har enucleated, tvätta dem genom embryo odlingsmedium och placera dem i inkubatorn tills överföringen. Vissa enucleated oocyter bör inte överlåtas men bör aktiveras och fungera som en kontroll för enucleation. Dessa ägg kommer fragmentet inom flera timmar, vilket indikerar lyckade enucleation.

Kärnöverföring

Placera celler till PVP-lösning (11% PVP i HCZB). Om många kloner gripandet vid 1-cell skede bör PVP koncentration sänkas till 5% eller mindre. Blanda celler bra with PVP. Plocka upp celler med en pipett med en inre diameter som är något mindre än diametern av cellen. I cellens membran skulle gå sönder vid aspiration. I vissa fall kan repetitiva utvisa och aspiration samt tillämpning av milda piezo pulser användas för att bryta givaren cellen. En ny droppe donator celler bör göras med varje grupp av oocyter som överförs, som donator celler blir klibbig efter en tid. Injicera den trasiga givaren cellen strax efter att bryta membranet. För överföringen, fokusera på de ekvatoriella planet av äggcellen själv snarare än de ekvatoriella planet av zona pellucida och placera överföring och hålla pipetten i samma plan. Håll äggcellen, inklusive en del av dess cytoplasma ordentligt. Penetrera zona pellucida med piezo-pulser. Ta givaren kärnan till toppen av pipetten och tryck sedan pipettspetsen nästan på motsatt sida av enucleated äggcellen, nära innehavet pipett gör en djup fåra i äggcellen. Aspirera en mycket liten mängd äggcellen cytoplasman i pipetten, tillämpa en enda svag piezo puls att bryta äggcellen membranet, mata givaren kärnan, dra tillbaka nålen snabbt samtidigt som aspirerande på cytoplasmamembran längst till höger i fåran. Genom att samtidigt dra ut kanylen och aspirerande, bör det vara möjligt att stänga hål kvar av NT. Denna "hål borttagning tekniken kommer att minska antalet oocyter som Lyse under NT. Tvätta rekonstruerade ägg i KSOM och returnera dem till inkubator för 1-3 timmar.

Äggcellen aktivering

Förbered en halv tallrik med droppar av kalcium gratis MCZB och den andra hälften med droppar av kalcium gratis MCZB plus 10 mM Sr 2 + och 5 μ g / ml cytochalasin B för att hämma polära kroppen extrudering. Jämvikta i 30 min. under 5% CO 2 i luften. Tvätta NT embryon bra i kalciumfri MCZB och sedan placera dem i små grupper i olika droppar kalciumfri MCZB. Återgå skålen till inkubatorn och kultur i 5-6 timmar. För att kontrollera för den artificiella aktiveringen protokoll och för embryo odlingsbetingelser bör icke enucleated ägg användas. De kommer att utvecklas som partenogenetiska embryon. Efter aktivering, tvätta embryon genom KSOM och placera embryon i inkubatorn för långsiktig kultur. Pronuclei skall vara synliga vid denna tidpunkt, vilket indikerar en framgångsrik överföring.

Embryo Culture Media kokbok

Mästare Salter

Börja med 980 ml ​​ultrarent H 2 O i sterila 1 L flaska

Lägg torr komponenter:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5 mm) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glukos (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Lägg till likvida komponenterna

Na-laktat (mjölksyra) 5,3 mL & nbsp; Sigma 44.263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15.140-122

För MCZB Stock Salter:

Filtrera sterilisera 500 salter ml mästare (bra för 3-4 månader, förvaras vid 4 ° C)

För HCZB Stock Salter:

Börja med 500 ml mästare salter

Tillsätt 50 mg PVA (kall-lösliga, Sigma P-8136)

Rör i 30-60 min och sterila filter (bra för 3 månader, förvaras vid 4 ° C)

Ca + + Gratis MCZB (för ägg aktivering i 5% CO 2)

Börja med 99 ml MCZB lager salter

Lägg torr komponenter:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na-pyruvat (pyrodruvsyra) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamin 15mg Sigma G-8540

Bovint serumalbumin (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Snurra tills alla komponenter är upplöst, sterila filter.

HCZB (för mikromanipulation i omgivande atmosfär)

Börja med 99 ml HCZB lager salter

Lägg torr komponenter:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761

Lägg till likvida komponenterna:

128 mm CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

Justera pH till 7,5 med 1 N HCl

Snurra tills det är upplöst, sterila filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lycka till!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

DE vill tacka Dr Göm Akutsu för att dela hans NT tricks och Dr Stephen Sullivan och Garrett Birkhoff för kritisk läsning av protokollet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics