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编制果蝇实时成像的胚胎使用悬滴协议

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Biology

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Summary

一个简单,廉价,​​有效的方法是准备住成像分析果蝇胚胎。我们的协议提供湿度和气体交换,不压缩的果蝇胚胎。这种方法适用于基于GFP的使用立体显微镜或直立复式显微镜的果蝇胚胎的实时成像。

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Reed, B. H., McMillan, S. C., Chaudhary, R. The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol. J. Vis. Exp. (25), e1206, doi:10.3791/1206 (2009).

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Abstract

绿荧光蛋白质(GFP)为基础的timelapse生活成像的动态进程,如组织形态发生,细胞与细胞间的粘附,或细胞死亡的基因调控研究的一个强大的技术。果蝇胚胎表达GFP很容易使用以立体或共聚焦显微镜成像。任何带电成像协议的目标是尽量减少不利影响,如脱水和缺氧。前准备活成像分析果蝇胚胎的协议涉及dechorionated胚胎放置在卤烃油和夹层之间的卤烃气体渗透膜和盖玻片

Protocol

制备

  1. 收集胚胎标准的葡萄汁琼脂平板 4 。它方便地使用一个自动化的果蝇卵收集器(Flymax科学器材有限公司)。使用同步上演胚胎集合将减少必须执行,以获得足够数量的胚胎在发育阶段所需的数量dechorionations。
  2. 准备一个dechorionation幻灯片,附加了一块双面胶带载玻片;删除从磁带的支持。
  3. 准备切割一块组织,以适应在香港总商会以及实时成像室。在精心组织和湿用蒸馏水。
  4. 混合卤烃油(卤烃产品公司)粘度700系列和56系列在以1:1的比例。该混合物可以存储并无限期使用。
  5. 盖玻片(22 × 40毫米,第2号)的表面上放置几小滴卤烃油。该卷是并不重要,但应在20-40μL为了。

程序

  1. 随着立体显微镜的帮助下,收集胚胎使用一对珠宝商的镊子(第5号),或一个非常优良的油漆刷的葡萄汁琼脂板。胚胎往往坚持互相钳“提示;他们很容易聚集在团块。
  2. 随着立体显微镜的帮助下,轻轻地放下,坚持到磁带表面上的dechorionation幻灯片钳提示胚胎团块。
  3. 再次使用的体视显微镜,轻轻地微调或中风的一侧钳胚胎为了打破开放外糯绒毛膜不破裂的内在卵黄膜(如果卵黄膜破裂,胚胎破裂)。
  4. 一旦外层的蛋壳已破裂,挑逗胚胎绒毛膜; dechorionated胚胎往往要坚持到表面的镊子。小心避免触摸磁带表面dechorionated胚胎。
  5. 只要一个胚胎dechorionated,迅速转移到盖玻片先前准备的卤烃油下降。触摸账面dechorionated胚胎的卤烃油滴表面钳的一角 - 这个位置被驱逐出来的钳入油胚胎。
  6. 确认胚胎转移到滴油。这是可以做到与你工作在一个黑色的背景,并使用光纤照明光源设置在一个斜角肉眼。
  7. 试图dechorionate另一个胚胎之前,清洁镊子从任何石油。涂油钳绒毛膜表面上有较少的购买,使得dechorionation更加困难。
  8. Dechorionated胚胎蓬勃的卤烃油。使用产钳或画笔,并通过立体显微镜下观察时,推胚胎油价下跌的底部,并安排在所需的位置。
  9. 快速翻转盖玻片以及在实时成像室。确认胚胎所需方向对盖​​玻片休息。由于他们在油中的浮力,胚胎会浮动盖玻片表面。盖玻片固定用胶带实时成像室。通风孔,在该地区的磁带跨越盖玻片和实时成像室以及结束之间的差距在磁带削减室。
  10. 一个正直的荧光显微镜或荧光体视显微镜,现在可以用于图像的胚胎。

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Discussion

我们描述了一种实时成像分析,我们称之为悬滴协议的准备果蝇胚胎的新方法。不幸的是,它是不可能的使用悬滴协议,如果倒置显微镜工作。在这种情况下,夹层技术(抽象以上所述),必须使用压缩的胚胎仍然令人担忧。

在细胞的形状和大小进行测量,以计算力量与形态运动相关的实验,使用一个堂堂正正的显微镜和悬滴协议是可取的,因为胚胎压缩减少。此外,减少胚胎压缩使用悬滴协议而夹层技术提出了一个扁平的表面呈现圆形,胚胎表面不失真的后果。当使用共聚焦显微镜,因此,有必要收集更广泛的Z - Stack(每个堆叠多个切片)时使用的夹心法与悬滴协议。然而,每片的Z - Stack数目增加,增加收购时间,以及任何照片毒性或激光激发的光漂白。显然,减少压缩实验的好处是在Z - Stack的收购时间的增加部分抵消。然而,尽管这在Z - Stack的收购时间的增加,我们观察到的优秀的生存能力使用悬滴协议的胚胎。

悬滴协议也是有限的荧光显微镜,观察胚胎,在该事件发出的光的光路不会通过现场影像室。使用DIC的显微镜或其他非荧光光学实时成像胚胎可以实现通过修改现场影像室,允许从冷凝器通过暂停胚胎一个光路。

使用悬滴技术时关注的一个问题可能是不可取的运动或胚胎timelapse收购期间领域的“漂流”。对倒盖玻片下方浮动时,我们发现,胚胎是非常稳定的,并没有使用时,无论是干式或油浸目标位置转移。多timelapse收购使用电动显微镜阶段,也不会破坏胚胎,准备使用悬滴协议的立场。任何使用悬滴技术制备的胚胎的运动可以消除通过减少卤烃滴油的大小,并确保独立的油滴不活成像室的边缘融合或沿排汗。

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Acknowledgments

我们非常感谢支持的BHR通过发现格兰特以及来自自然科学和加拿大工程研究理事会(NSERC)的一个研究工具和仪器格兰特。我们也承认H.小田和布卢明顿果蝇中心提供,例如实时成像序列的遗传股股票。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides
coverslips (22 x 40 mm, No. 2)
double-sided tape
jeweller’s forceps (Dumont style No. 5)
halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.)
a utility knife or single edge razor blade
tissue paper
scissors
distilled water
general purpose tape
a pipet suitable for delivering 20-40 μl.
The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.

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References

  1. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
  2. Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. 248-2429 (2002).
  3. Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
  4. Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).

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