脑银行业:使你的研究样本中,大部分

Biology

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Summary

脑银行和生物材料的系统抽样提供无偏体视学的基础上,并最大限度地从每个试样获得潜在的数据。

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Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).

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Abstract

无偏体视学是一种准确,有效地估算总神经元的数量(或其他类型的细胞)在特定地区的利益的方法

Protocol

第1部分:前处理的组织

  1. 组织应多聚甲醛,戊二醛,或福尔马林灌注。这可以通过标准transcardial,通常用于收获其他器官灌注。在本研究的主题是深刻的盐酸氯胺酮(10毫克/公斤,IM)与戊巴比妥钠(25毫克/公斤,四)过量安乐死,镇静剂和用0.1 M PBS灌注,直到完全exsanguinated transcardially人。其次是在PBS的4%多聚甲醛为5分钟(约1升)的解决方案。
  2. 大脑应stereotaxically封锁,从头骨取出,称重,量确定2。组织,然后应cryoprotected分级蔗糖溶液与30%蔗糖磷酸盐缓冲液中的终浓度。组织块应被冻结在戊烷在-65 ° C,并保存于-80 ° C,直到您准备切片。

第2部分:系统抽样

  1. 系统抽样依赖于适当的计划,以切片前。应该很好地确定整个地区的喙尾鳍和背腹程度的兴趣。一个使用物种的立体地图是有帮助的定义感兴趣的区域,并确定感兴趣的区域的长度。一旦感兴趣的区域的长度是确定有必要建立的采样间隔。例如,从立体地图集您确定整个rostro尾鳍的感兴趣的区域范围是大约3mm的长度时,在冠状面切片。然后,您决定设置的低温恒温器第50微米,在这个速度,你将有60节,包括感兴趣区域的喙尾鳍程度。 6-10系统采样的部分,对于一个典型的无偏体视学研究需要获得可靠的结果。在这个例子中10个章节等距整个采样间隔的1 / 6节rostro尾程度的结果。

第3部分:大脑银行的创建

  1. 一旦部分采样频率已经确定,下一步是要确定哪些污渍,将立即执行。例如,如果你是用甲酚紫染色,你会捕捉幻灯片上的1 / 6节。这将是系列的第1。如果你知道有可能一些潜在的抗体,你想运行,但,他们是希望看到的数据,您的主要污渍提供或根本没有时间进行免疫组化,放置的顺序,其余5节系列切成井含有抗原的保护(1%聚乙烯吡咯烷酮,乙二醇50%,在o.1M PBS,pH值7.4 )。下面的表格提供了一个抽样方案,包括1张幻灯片和1盘为大脑银行(见表1)部分路段(标准48孔板)。
    表1
    表1:这里的部分采样频率的1 / 6 。第一部分是放置甲酚紫染色的幻灯片和未来5节到抗原放置保存。幻灯片上的第7号,然后捕获和部分9-12放置在抗原保留。这种循环反复,直到该地区的利益或组织块详尽的切片。
  2. 下一步是要详尽的部分组织块。将少量的嵌入夹头中等,让它冻结。放入切片头夹头和刮胡子的冷冻介质,足有一个平坦的表面。从切片机头部和地方单位的低温恒温器内取出夹头。倒入嵌入夹头介质和牢固的地方定位夹头断然stereotaxically切方脑块。慢慢地,完全地嵌入在安装介质的大脑。放置到切片机头部和部分采样频率使用预先确定的参数部分的大脑夹头。
  3. 一旦组织块已经详尽的切片和部分成​​井,板盖盖子,用封口膜包装的盖子,并在-20 ° C冰箱的地方。日志总数为每个系列,部分采样间隔为每个动物的数量,以及一系列的部分。此日志将是至关重要的的轨道,保持大脑银行随后的部分去除,为今后的免疫组织化学。

第4部分:代表性的成果:

在这种方式的系统化采样已在我们的实验室在过去3年一个标准的做法。我们有一个很大的成功执行免疫组织化学材料已在抗原存储保存三年后,这是没有信号的恶化(图1)切片。此外,由于我们的大脑银行的一部分,我们已经接近20000系统的部分非人类记录灵长类动物的大脑(图2)作为我们的长期研究计划的一部分。

图1,这是一段从非人类灵长类动物枕极免疫染色显示NeuN第六层和间质白质神经元。这种特殊的部分是存储中的抗原,在-20 ° C保存期为2年。比例尺=100μm的。

图2
图2,现 ​​在我们vervet大脑银行的近20,000名来自超过30只猴子的系统部分组成。

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Discussion

系统抽样是一种廉价的方法,旨在最大限度地提高研究材料。此取样策略的目的是,遵守的规则,需要整个地区的系统采样的无偏体视。至关重要的是,每个系列的部分路段秩序维持。在我们的实验室中,我们已经成功地使用银行仓鼠和非人类灵长类动物的脑切片这种方法。到目前为止,我们已经收集了接近20000 vervet猴(Chlorocebus aethiops sabeus)的脑切片,进行常规免疫组已存放了一年多的部分。良好的特点大脑银行的好处,包括收集之间资金的决定,新的学生迅速地收集数据的能力,最大限度地减少新的动物,从而最大限度地提高科研经费的使用和处理的数据的可能性。

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Acknowledgments

作者想感谢他持续的技术支持Ikiel Ptito。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylene glycol Fisher Scientific E178-4
Polyvinyl pyrrolidone Fisher Scientific BP431-500
Thermal Scientific Embedding Medium Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
  2. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. (2009).

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