전체 몽키 브레인에서 대규모 단백질 탐지에 대한 배치 Immunostaining

Biology

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Summary

전체 영장류 두뇌를 통해 대상 단백질의 대규모 면역이 포함 소설 조직을 고용하고 주어진 시간에 여러 자유 부동 섹션의 배치 얼룩을위한 창조적인 장치를 이용하여 결합 방법을 sectioning에서 가능합니다.

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Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain. J. Vis. Exp. (29), e1286, doi:10.3791/1286 (2009).

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Abstract

Immunohistochemistry (IHC)는 대상 단백질의 검출에 가장 널리 사용되는 실험 기법 중 하나입니다

Protocol

Immunohistochemisty 다양한 실험 동물 모델의 두뇌에있는 단백질 표현을 특성화를 위해 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 유사한 두뇌 크기와 설치류 및 기타 일반적인 실험 모델의 두뇌에 체계적인 immunohistochemical 절차를 수행하기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그러나, 전체 원숭이의 두뇌에 걸쳐 같은 면역 절차를 수행하는 방법에 대한 포괄적인 계정을 제공하는 우리의 지식에 게시된 작업은 없습니다. 어떤 다음은 다양한 대상 단백질의 대규모 immunohistochemical 감지에 대한 전체 원숭이 두뇌를 준비하는 방법에 대한 자세한 설명입니다. 이 작품은 상업 및 학문적 노력 사이의 협력의 결과로 떠오르고있다. 이와 같이 포함하고 sectioning 조직에 관한 세부 사항은 NSA의 독점적인 지식 남아 있습니다.

1 부 : 동물 치료 및 조직 준비

성인 vervet 원숭이 (Cercopithecus aethiops)에서 두뇌는 현재 프로토콜에 사용됩니다. 모든 절차는 생물 의학 연구 1 동물의 사용과 관리에 대한 애니멀 케어의 캐나다 협의회 (CCAC) 지침을 준수 실시하고 있습니다.

  1. 동물은 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)와 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)와 마취입니다.
  2. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다.
  3. 두뇌가 컨테이너의 하단에 싱크 ˚ C까지 externalized 두뇌는 0.02 %의 나트륨 azide를 포함한 등급 PBS 버퍼 자당 솔루션 (순서 10, 20, 30 %)에 위치 4에서 관리하고 있습니다. 두뇌가 냉동 sectioning를 겪습 때까지 솔루션은 수일마다 교체됩니다.
  4. 그들의 독점 MultiBrain에 들어서는 ™ 삽입 및 냉동 sectioning 기술, 두뇌는 신경 과학 어소 (녹스빌, 테네시 NSA)로 전송됩니다.
  5. 섹션이 제대로 지향되어야 (즉, 왼쪽, 오른쪽 방향)와 histological 처리가 완료된 후 다시 정렬 수 있도록 세븐 (7) 정렬 랜드마크가 포함 행렬에 배치됩니다.
  6. 각각의 시리얼 부분이 블록에서 수집되기 전에 냉동 블록 디지털 블록 얼​​굴 사진입니다. 디지털 이미지뿐만 아니라이 두뇌의 부분은 나중에 각각 해부 및 histological지도 3D 재건에 사용될 수 있습니다.
  7. 시리얼 자유 부동 코로나 섹션은 섹션 50 μm의의 두께, 전체 두뇌에서 수집됩니다.

2 부 : Histological 처리

섹션은 주어진 공간 간격으로 선택됩니다 (예, 500 μm의) 우리의 실험 목적을 위해 다음과 같은 항체로 처리되었습니다 연약한 - X 정신 지체 단백질 (FMRP, Chemicon, 테메큘라, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals 주식 회사; 볼티모어, MD), 그리고 NeuN (Chemicon, 테메큘라, CA). FMRP는 다량으로 정상과 순열 사업자 두뇌의 뉴런이 발견 세포질 단백질이다. NeuN (핵의 연결)는 구체적으로 대부분의 뉴런에 존재하며 핵의 연결, perikarya 일부 근위의 연결 프로세스 3 배포되는 DNA 바인딩 신경 세포 특정 단백질 NeuN를 인식합니다. SMI - 32 neurofilament 단백질 4 비 phosphorylated 에피토프을 인식 단클론 항체이다.

  1. 500 μm의의 간격, 약 140 섹션은 항체마다 사용됩니다.
  2. 모든 incubations, 세척 및 얼룩 단계는 전문 얼룩 요리와 바구니 (; 녹스빌, 테네시 HistoTools)를 사용하여 가벼운 동요와 함께 진행하고 있습니다.
  3. 섹션 먼저 항체 분자의 특이 현상이 자꾸 발생 배경 얼룩을 줄이기 위해 0.1 M PBS/0.3 % 트리톤 X - 100 (TX) / 60 분 5 % 정상 쉰 혈청 (NHS)이있는 솔루션에 incubated 수 있습니다.
  4. 공급 업체의 지시에 따라, immunostaining FMRP에 대한 표시 섹션 항원 Unmasking 솔루션 (버링게임, CA 벡터 연구소)를 사용하여 항원 복구의 추가 단계를 받고있다.
  5. 섹션은 다음 하룻밤과 0.1 M PBS/0.3 % TX / 3 % NHS를 (NeuN 항체에 대한 FMRP 및 SMI - 32과 1 / 2, 000에 대한 5분의 1, 000의 희석 요소로 포함하는 각각의 항체 솔루션에서 별도의 일 incubated 수 있습니다.
  6. 1 /; 다음날은 섹션은 말에서 제기 biotinylated 방지 마우스 이차 항체에 실온에서 2 H (벡터 연구소에 대한 부화 다음 세척 용액 세 10 분 기간 (0.1 M PBS/0.3 % TX)에 씻어 아르 0.1 M PBS/0.3 % TX / 3 % NHS 1,000 희석).
  7. 3 10 - 분 세척을 추가로 설정 후, 섹션은 실온에서 1 H에 대한 아비딘 - 비오틴 복합 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 (벡터 연구소)의 솔루션에 배치됩니다.
  8. 마지막으로, 세척 다른 설정 후, 섹션은 니켈 향상된 디아 10 분 대상이 아르minobenzidine (NI - DAB) 진한 파란색이 immunoreactive 뉴런 이내에 얼룩이 생성 반응.
  9. histological 절차의 완료에, 부분은 젤라틴 - 코팅 유리 슬라이드에 탑재하고 있습니다.
  10. 모든 섹션은 공기 건조 하룻밤되고 표준 절차에 따라 coverslipped.

파트 3 : 대표 결과 :

이 방법은 전체 원숭이 두뇌에 걸쳐 관심의 대상 단백질의 완전한 표현 프로필을 생산하고 있습니다. 여기 FMRP, NeuN과 같은 원숭이의 뇌에 SMI32 표현의 스냅샷을 제공하는 대표적인 코로나 섹션을 표시합니다.

그림 1 : 스테 이닝 요리 (A)와 바구니 (B)가 면역 무료 - 부동 섹션의 대규모 일괄 처리에 사용.

그림 2 : FMRP (A), NeuN (B)와 SMI32 (C) 항체에 대한 스테인드 vervet 원숭이 머리에서 대표 코로나 섹션.

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Discussion

가능한 전체 원숭이의 뇌에 단백질의 대규모 감지하게이 절차에서 두 중요한 단계가 있습니다. 하나는 NSA의 독점적인 지식 남아 삽입과 sectioning 프로토콜입니다. 다른 하나는 HistoTools에서 제공하는 얼룩 요리와 바구니를 사용하는 것입니다. 후자는 주어진 시간에 많은 (~ 40) 섹션을 쉽고 빠르게 처리하실 수 있습니다. 또한 균일하게 뇌 전체 부분을 치료를위한 수단을 제공하고 과학적으로 소리 histological 치료를합니다. 또한, 임베디드 랜드마크의 사용은 디지털 말린 coverslipped 슬라이드에서 얼룩 패턴을 습득하고 분석 다양한 형태로 디지털 파일을 대상 수있는의 추가한 이점을 제공합니다. 우리 세 항체의 예제를 제공하기는하지만,이 절차 특히 다른 표적 단백질뿐만 아니라 histological 얼룩, cytoarchitecture 다양한 대뇌 피질의 영역을 표시하고 따라서 매핑 목적으로 사용되는 이들의 다양한 적용할 수 있습니다.

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Acknowledgments

우리는 프랭크 에르빈, 로버타 Palmour 및 영장류 작품들의 지속적인 지원 세인트 키츠, 서인도 제도에있는 Behavioural 과학 재단 연구소의 직원에게 감사하고 있습니다. 보건 연구 (AC)과 국립 공학 및 캐나다 (MP)의 연구위원회의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 -이 작품은 깨지기 쉬운 X 리서치 SZ 캐나다의 재단 (FXRFC)와의 화목에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-FMRP monoclonal antibody Chemicon International MAB2160 Requires antigen retrieval in fixed tissue.
anti-NeuN monoclonal antibody Chemicon International MAB377 N/A
anti-Neurofilament H monoclonal antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI32 N/A
Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories H-3300 N/A
Normal horse serum Invitrogen 16050122 500 mL
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse Vector Laboratories BA-2000
VECTASTAIN ABC Kit (Standard) Vector Laboratories PK-4000 1.5 mg
Staining dish for floating sections HistoTools 10009 12 x 65 mm
Staining transport basket HistoTools 10012 large
(fits 12 x 65 mm dish)
Triton X-100 Fisher Scientific P8514B N/A
DAB Fisher Scientific AC11209-0050 N/A

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References

  1. Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
  2. Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
  3. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
  4. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).

Comments

2 Comments

  1. I am very interested in performing immunohistochemistry experiments in aged monkey brains. However, preliminary tests have shown very high endogeneous (lipofuscin??) autofluorescence in the tissue. Is there an effective way to get rid of autofluorescence in a manner that preserves the tissue for IHC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Sergio,

    Here is a protocol used in my former lab with quite a bit of success:

    Reagent:
    70% (v/v) Ethanol containing 1% (w/v) sudan black B (stirred in the dark for ² h)

    Method
    1. Use a standard immunochemical staining protocol.
    ². Apply the reagent prepared above for 10 min at the step before incubation with the reagent conjugated to the fluorochrome.
    3. Quickly rinse the slides ten times in TBS or PBS.
    4. Continue with the immunochemical staining protocol.

    Hope this helps. Let me know how it turns out for you.
    Good luck,
    SZ

    Reply
    Posted by: Shahin Z.
    May 3, 2010 - 3:40 PM

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