سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نظرا لطبيعة عابرة للمرنا المسبق ، يمكن أن يكون من الصعب عزل ودراسة

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Watkins, K. H., Stewart, A., Fairbrother, W. G. A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA. J. Vis. Exp. (34), e1622, doi:10.3791/1622 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التسلسل الرناوات التي شاركت في immunoprecipitate (CO - IP) مع البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة زاد فهمنا الربط وذلك بإثبات أن يؤثر في كثير من الأحيان ملزمة الموقع وظيفة عامل الربط. ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي استراتيجية أخذ العينات من فرصة يعتبر تحديد الحمض النووي الريبي منضمة إلى عامل الربط يتناسب وفرة الخلوية. وقد وضعنا في رواية نهج المختبر عن درس خصوصية ملزمة للخلاف عابرة قبل مرنا. هذا النهج يستخدم مجموعة المصممة خصيصا قليل النوكليوتيد أن البلاط عبر الإنترونات ، exons متماثلة ، تقاطعات لصق ، أو غيرها من قبل مرنا. يخضع تجمع إلى نوع من التحديد الجزيئي. هنا ، ونحن لشرح الطريقة التي تفصل في جزء قليل النوكليوتيد مقيدة وغير منضم والاستفادة من مجموعة واللون two استراتيجية لتسجيل كل عمليات تخصيب قليل النوكليوتيد في جزء محدد. بيانات مجموعة يولد خرائط عالية الدقة مع القدرة على تحديد تسلسل محدد من المحددات الهيكلية وبروتين نووي ريبوزي (RNP) ملزمة للمرنا المسبق. وهناك ميزة فريدة من نوعها لهذا الأسلوب هو قدرته على تجنب التحيز مرنا تجاه أخذ العينات المرتبطة بالملكية الفكرية والتقنيات الحالية سيليكس ، كما تم تصميمه خصيصا للسباحة وتوليفها من قبل مرنا التسلسل. مرونة تجمع قليل النوكليوتيد ميزة أخرى منذ المجرب الذي يختار لدراسة المناطق والبلاط عبر والخياطة تجمع لاحتياجاتهم الفردية. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للمرء أن فحص آثار الأشكال ، أو طفرات على ملزمة على نطاق واسع أو استنساخ في مكتبة مراسل الربط الوظيفي وتحديد [أليغنوكليوتيد] التي هي المخصب في جزء المدرجة. هذه الرواية ذات الدقة العالية في المختبر نظام رسم الخرائط يوفر وسيلة فريدة لدراسة التفاعلات RNP مع الأنواع قبل مرنا عابرة ، الذي منخفضة وفرة يجعل من الصعب دراسة مع التقنيات الحالية في الجسم الحي.

Protocol

تصميم حمام سباحة والانتعاش بنسبة ضئيلة

  1. الخطوة الأولى هي لتصميم تجمع قبل مرنا لدراستها. ويمكن القيام بذلك باستخدام متصفح الجينوم UCSC وتحميله جينات معينة ، تقاطعات لصق ، أو غيرها من مجالات الاهتمام.
  2. مرة واحدة وقد تم اختيار نوافذ الفائدة ، وعبر لهم باستخدام البلاط حسابي الشروط التالية : الطول وينبغي قراءة 30 النيوكليوتيدات مع تداخل 10 النوكليوتيدات ، وبالتالي يتم إزاحة كل جزئية من 20 النيوكليوتيدات واحدة السابقة. * ينبغي زيادة التداخل أليغو في القرب من مواقع لصق لضمان التغطية الكافية ، وزيادة التداخل 10-20 النيوكليوتيدات يمكن إنجاز هذا.
  3. الجناح كل جزئية 30 النوكليوتيدات مع تسلسل التمهيدي العالمي ، والتي سيتم استخدامها لتضخيم المصب بركة. وينبغي تقديم طلبات المغطى بنسبة ضئيلة لاجيلنت ، حيث سيتم طباعتها على تسلسل ميكروأري قليل النوكليوتيد المخصصة.
  4. لاسترداد oligos الحمض النووي من سطح ميكروأري تبدأ من خلال وضع الشريحة تغطية الصفيف في صفيف غرفة التهجين وpipetting بلطف ميكرولتر من 500 درهم 2 O على الشريحة
  5. شطيرة الصفيف على رأس تغطية الشريحة ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء التي يمكن أن تعطل هذه العملية. تأكد من وضع وجهه مجموعة أسفل بحيث جنب مع oligos لمس سطح المياه. وهناك قاعدة جيدة من التجربة هو "اجيلنت اللمسات اجيلنت" وهذا يعني أن التسمية اجيلنت على مجموعة وجوه التسمية اجيلنت تغطية على الشريحة
  6. إغلاق غرفة التهجين بين عشية وضحاها وتناوب على 99 درجة مئوية في فرن التهجين
  7. في اليوم التالي ، وإزالة بعناية مجموعة من الغرفة ورسم الخروج من الماء ، والذي يتضمن الآن oligos تتحرر من سطح الصفيف. هذا هو بركة بنسبة ضئيلة
  8. مكان التجمع في أنبوب 1.5 مل إيبندورف ويصوتن تجمع في السعة بنسبة 50 ٪ لمدة 3-5 البقول second
  9. المقبل ، التي تجمع تضخيم PCR دورة منخفضة ، وذلك باستخدام أجهزة الاشعال العالمية مع العلامة T7 إلحاق إلى النهاية. في الجولة الأولى ، تفسد على 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، يصلب على 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، واستطال لمدة 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية. لجولات لاحقة ، لا 10 ثانية ، 20 ثانية ، و 10 ثوان في كل منها درجة الحرارة ، مع استطالة خطوة نهائية لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية. لأن عدد من الدورات اللازمة لتضخيم تجمع يعتمد على كفاءة الاسترداد بنسبة ضئيلة ، فإنه قد يكون من الضروري محاولة أرقام دورة متعددة. يجب الحرص على عدم المبالغة في تضخيم بركة ، الذي تدل عليه عصابة طخت على هلام الأكريلاميد. ويمكن تخزين العينات PCR تزداد عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
  10. الخطوة النهائية في إعداد بنسبة ضئيلة هي تدوين RNA باستخدام طقم ™ MEGAshortscript من Ambion. * لقد تم تعديل بروتوكول التالية من Ambion
    1. أذاب الاحتياطي T7 الرد 10X ، أربعة حلول ريبونوكليوتيد والماء في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على انزيم ميكس T7 على الجليد
    2. تجميع خليط التفاعل في أنبوب microcentrifuge ريبونوكلياز خالية في درجة حرارة الغرفة. يمكن مكونات الحمض النووي يسبب رد فعل العازلة قالب لترسيب إذا خلط رد فعل الجليد.
    3. وفقا للترتيب التالي ، 3 ميكرولتر ماصة nuclease خالية من المياه ، و 2 ميكرولتر من رد فعل العازلة 10X ، 2 ميكرولتر من كل حل ملي NTP 75 ، 5 ميكرولتر من الحمض النووي القالب (تجمع تضخيم PCR بنسبة ضئيلة) و 2 ميكرولتر من أنزيم T7 ، على سبيل وحدة تخزين النهائي لل20 ميكرولتر
    4. نفض الغبار الأنبوب برفق لمزج رد فعل لفترة وجيزة ثم microfuge لجمع الخليط في قاع الأنبوب.
    5. احتضان رد الفعل في thermocycler عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وسوف تكون فترة حضانة التي تعتمد على قالب ، وبالتالي فإنه قد يكون من الضروري استخدام تجربة الوقت المقرر لتحديد الوقت الأمثل لاحتضان الغلة القصوى
    6. بعد 2 ساعة ، وإزالة القالب الحمض النووي عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الدناز توربو للتفاعل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية
    7. إنهاء التفاعل واسترداد رنا بواسطة استخراج الفينول / الكلوروفورم وهطول الأمطار الايثانول.
      1. لحجم رد الفعل 20 ميكرولتر ، إضافة ميكرولتر من 115 درهم 2 O و 15 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M على رد الفعل.
      2. المزيج جيدا ثم تضاف 75 ميكرولتر من حمضية الفينول و 75 ميكرولتر من كلوروفورم. حل عن طريق مزج vortexing ، ثم microfuge لدقيقة واحدة على 13000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل طبقة مائية لأنبوب جديد وكرر استخراج
      3. نقل طبقة مائية لأنبوب جديد وإضافة 150 ميكرولتر من كلوروفورم. دوامة الخليط وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل. نقل طبقة مائية لأنبوب جديد.
    8. استرداد رنا بإضافة مجلدين من الايثانول البارد 100 ٪ للطبقة المائية وخلط جيدا. البرد الخليط لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في -20 درجة مئوية ثم الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في السرعة القصوى لتكوير الحمض النووي الريبي. إزالة بعناية وطاف resuspend وبيليه في 105 ميليلتر من الاحتياطي 0.1x (TE) تريس - EDTA..
  11. فمن الصعب إزالة كافة النيوكليوتيدات خالية من رد فعل كيت T7 ، حتى لأدق النتائج ، كميا باستخدام الحمض النووي الريبي RiboGreen.
    1. للبدء في الكميات ، ما يكفي من تمييع first 1X TE ، 2300 ميكرولتر + 50μL/sample.
    2. المقبل ، وجعل RiboGreen. ستحتاج ميكرولتر 1000 + 50 ميكرولتر / العينة. لعينات مجموعة عالية مزيج (1 ميكروغرام / مل إلى 20 نانوغرام / مل) من 1:200 RiboGreen في TE 1X ، وبالنسبة للعينات نطاق منخفض (50 نانوغرام / مل إلى 1 نانوغرام / مل) مزيج 1:2000 RiboGreen في TE 1X ؛ الماصة 50 ميكرولتر من محلول RiboGreen في كل بئر من لوحة غامضة ومبهمة ، بدءا من A1 وتتحرك باستمرار ، وليس بين
    3. تمييع الحل الأسهم RNA إلى 2 ميكروغرام / مل لعينات مجموعة عالية أو 100 نانوغرام / ميكرولتر لعينات مجموعة منخفضة
    4. باستخدام حلول الأوراق المالية ، وإنشاء منحنى القياسية من ست التخفيفات 01:02 اللاحقة من المخزون الأصلي 2 نانوغرام / مل ميكروغرام / مل أو 100 ؛ 240 ميكرولتر الماصة للسهم في أنبوب الشريط PCR. في أنابيب 7 المتبقية ، ماصة 120 ميكرولتر من TE 1X. تأخذ 120 ميكرولتر من المخزون النووي الريبي جيدا ، والاختلاط مع أنبوب 2. تأخذ 120 ميكرولتر من الأنبوب (2) والاختلاط مع أنبوب 3. كرر حتى أنبوب 7. وسوف يكون فقط 8 أنبوب الشركة المصرية للاتصالات ، وسوف تكون فارغة الخاص بك. ماصة 50 ميكرولتر من الحلول المنحنى القياسي في لوحة غامضة ومبهمة ، A1 : H2 (تشغيل منحنى مرتين)
    5. في أنبوب جديد ، مزيج من 45 ميكرولتر TE مع 5 ميكرولتر من تجمع بنسبة ضئيلة وإضافة كافة ميكرولتر من 50 إلى بئر يحتوي على 50 ميكرولتر من RiboGreen.
    6. باستخدام قارئ لوحة ضبط آلة لقراءة مضان من أعلى بعد مزيج مدته دقيقة واحدة مع الطول الموجي من 485 نانومتر الإثارة والانبعاثات الطول الموجي من 530 نانومتر ، وقراءة لوحة
    7. استخدام منحنى القياسية ولدت لتحديد الحمض النووي الريبي المستردة ، التي ينبغي أن تكون مخزنة في -20 درجة مئوية.

شارك في مناعي تجمع بنسبة ضئيلة مع الاهتمام RNP

  1. قبل بداية التعاون مناعي ، وإعداد البروتين والبروتين Dynabeads G من Invitrogen من خلال خلطها في نسبة 1:1 تصل إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر في رد الفعل. على سبيل المثال ، لاثنين من ردود الفعل وقمت بإضافة 50 ميكرولتر كل واحد من كل حبة.
  2. استخدام حامل الفصل المغناطيسي مثل هذا واحد من Novagen لعقد الخرز في مكانه أثناء إزالة طاف وتغسل حبات مرتين مع حجم مساو من 1X PBS الباردة
  3. بعد غسل الثاني ، resuspend حبات في حجم مساو من 1X PBS الباردة وإضافة 2 نانوغرام من الأجسام المضادة في رد الفعل. هذا المبلغ يمكن أن تختلف تبعا للجسم ، لذا التجريب أمر ضروري لايجاد الظروف المثلى.
  4. احتضان الخليط الضد / حبة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة دوارة
  5. في الصباح ، إضافة 2 ميكروغرام في رد فعل sonicated الحمض النووي الريبي مجموع الخميرة إلى كتلة غير محددة وملزمة ، وتناوب لمدة 30 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية.
  6. استخدام الحامل المغناطيسي لعقد الخرز ، وإزالة طاف وتغسل حبات مرتين مع 1X PBS الباردة ، وترك من غسل PBS الثاني في الأنبوب.
  7. إخراج أنابيب جديدة ، واحدة لكل رد الفعل وقسامة 50 ميكرولتر من خليط حبة في كل أنبوب. دعونا نجلس والخرز في حين تستعد مزيج الرئيسي
  8. لكل فعل إضافة 200 نانوغرام من تجمع بنسبة ضئيلة ، وهي نسبة متساوي المولية لحماية أجهزة الاشعال ، 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع sonicated الخميرة ، 20 ميكرولتر من استخراج النووية هيلا (وهذا هو مصدر RNP) ، و E العازلة لجلب حجم ما يصل الى 120 ميكرولتر. والاشعال حماية إصدارات RNA من الاشعال عالمية. قوالب النسخ ترتيب الاشعال العالمية مع العلامة T7 إلحاق النهاية ، ثم نسخ الحمض النووي الريبي من القوالب باستخدام ™ MEGAshortscript كيت.
  9. إزالة طاف من aliquots حبة والخرز resuspend في 120 ميليلتر من مزيج الرئيسي. صخرة ردود الفعل عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات.
  10. بعد الاحتضان ، لكل فعل ، إزالة قسامة الصغيرة (بما في ذلك الخرز) عن "الكل" عينة الحمض النووي الريبي
  11. مكان ما تبقى من ردود الفعل على الوقوف والفصل المغناطيسي إزالة طاف. على الرغم من أنه ليس من الضروري تحليل هذا التدفق من خلال عينة المصب ، قد يكون من المفيد للحفظ.
  12. تغسل حبات 1-2 مرات مع 50 ميكرولتر من 1X PBS الباردة. الحمض النووي الريبي منضمة إلى الأجسام المضادة على الخرز هو "الملكية الفكرية" عينة.
  13. Resuspend في "الكامل" و "الملكية الفكرية" الخرز في 50 ميكرولتر من SDS 1 ٪ في الشركة المصرية للاتصالات 0.1x العازلة للحرارة والعينات عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لأزل الحمض النووي الريبي.
  14. إزالة طاف ، والتي تحتوي على الحمض النووي الريبي الآن ان كانت متجهة سابقا إلى الخرز ونظيفة من خلال استخراج الفينول / كلوروفورم يعقبه هطول الأمطار الايثانول. تجفيف بيليه وresuspend في 50 ميكرولتر العازلة TE 0.1x.

عكس النسخ وتضخيم للمشاركين في مجال الملكية الفكرية العينات تمهيدا لوضع العلامات aminoallyl

  1. المقبل ، يجب أن عينات الحمض النووي الريبي تستنسخ العكسي وتضخيم PCR. للتفاعل النسخ العكسي ، واستخدام أجهزة الاشعال عكس عالمية.
  2. لكل عينة ، تبدأ عن طريق خلط 1 ميكرولتر منالتمهيدي عكس عالمية ، مع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي قالب (من رد فعل مناعي) و 10 ميكرولتر من DH 2 O. حرارة الانفعالات في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم البرد على الجليد أو الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.
  3. في حين أن العينات باردة ، وجعل هذا المزيج الرئيسية التالية. لكل فعل الجمع بين 4 ميكرولتر من 10 dNTPs ملم ، 2 ميكرولتر من العازلة Arrayscript 10X ، 1 مثبط ريبونوكلياز ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر إنزيم النسخ العكسي. مزيج دقيق وإضافة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل رد فعل عكس النسخ.
  4. استخدام جهاز PCR لاحتضان هذه العينات على 42 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 4 درجات مئوية حتى هناك حاجة لتضخيم هذه العينات.
  5. بعد الاختزال عكس عينات الحمض النووي الريبي ، PCR تضخيم لها باستخدام أجهزة الاشعال عالمية ، مع واحدة من البطاقات التي تحتوي على أجهزة الاشعال T7. وعدد الدورات اللازمة لتضخيم تجمع تعتمد على كفاءة IP المشترك لذلك قد يكون من الضروري محاولة دورات متعددة. كل رد فعل يتطلب 5 ميكرولتر من 10X العازلة رد فعل طق ، 0.2 ميكرولتر من كل التمهيدي (100 ملم) ، و 1 ميكرولتر من القالب [كدنا] (من رد فعل عكس النسخ) ، 1 ميكرولتر من 10 dNTPs مم ، 42،2 درهم ميكرولتر من 2 O ، و 0.4 ميكرولتر من أنزيم طق.

    بدء PCR التي يحتضنها العينات في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. المقبل ، بالنسبة لكل تفسد ، ودورة في 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ويصلب في 55 ثانية لمدة 30 درجة مئوية ، واستطال على 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، مع استطالة النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  6. المقبل ، تدوين العينات مرة أخرى باستخدام أدوات MEGAshortscript ™ ، ومع ذلك ، وهذه المرة إضافة 2 ميكرولتر من UTP aminoallyl ، بدلا من UTP T7. سيتم استخدام UTP aminoallyl لتسمية RNA مع الأصباغ قبرصي.
  7. الفينول / الكلوروفورم والايثانول يعجل العينات. لا يستخدم Glycoblue أو خلات الأمونيوم ، وكلا الأمرين قد تتداخل مع التهجين من العينات إلى الصفيف. تجفيف بيليه وresuspend في 4.5 ميكرولتر من كربونات الصوديوم 0.1 M.

الأميني الآليل توسيم RNA مع ملونات قبرصي

  1. لبدء وضع العلامات بروتوكول حل كل من الأصباغ الفلورية ، وcy3 cy5 ، في 45 ميكرولتر من DMSO. لتجنب الضوء ، والتفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام
  2. إضافة 2.5 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لعينات الحمض النووي الريبي ومزيج دقيق
  3. المقبل ، إضافة 3 ميكرولتر من Cy3 إلى نموذج "الكلية" ، و 3 من ميكرولتر Cy5 إلى نموذج "الملكية الفكرية". احتضان هذه العينات في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ؛ العينة CY - 3 سوف تتحول الأحمر أو الوردي بينما CY - 5 سوف تتحول زرقاء.
  4. لإنهاء رد الفعل ، إضافة UL 6 من 4 - M هيدروكسيل حمض الهيدروكلوريك في كل عينة ، مزيج دقيق وتدور لفترة وجيزة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تنقية عن طريق استخراج عينات المسمى الفينول / كلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول وبيليه resuspend في 50 ميكرولتر من TE 0.1x

هجن العينات إلى ميكروأري التهجين باستخدام صفيف اجيلنت كيت

  1. بدء تهجين ، عن طريق المزج بلطف 50 ميكرولتر من 10X عازلة تمنع ، 140 ميكرولتر من H2 nuclease يا خال ، 25 ميكرولتر من Cy3 المسمى التجمع "الكل" ، 25 ميكرولتر من Cy5 المسمى التجمع "الملكية الفكرية" ، و 10 ميكرولتر من 25x العازلة تجزئة و 250 ميكرولتر من التهجين 2X العازلة ، مع الحرص على تجنب إدخال الفقاعات. Microfuge العينة لفترة وجيزة لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب ، وكذلك للحد من الفقاعات.
  2. مكان الشريحة تغطية س الدائري في غرفة التهجين وماصة بعناية الحل على الشريحة.
  3. مكان الصفيف الكشف على الجزء العلوي من الغلاف إلى الشريحة "شطيرة" الحل. تذكر لتوجيه مجموعة من الشرائح بحيث التسمية اجيلنت على مجموعة وجوه التسمية اجيلنت على الشريحة الغطاء.
  4. المشبك الساندويتش الشريحة / مجموعة في غرفة التهجين وتناوب على 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  5. في حين أن مجموعة غير الدورية ، وتقديم الحلول التالية 50 مل في أنابيب مخروطية 50 مل : واحد المخروطية مليئة 50 مل من DH 2 O ، وهما 1X SCC العازلة الحلول ، كل في أنبوب منفصلة ، واحدة عازلة SCC 2X.
  6. بعد حضانة لمدة ثلاث ساعات ، unclamp بعناية ساندويتش مجموعة / الانزلاق ووضعه في مخروطي يحتوي على 50 مل العازلة SCC 2X. باستخدام زوج من ملاقط ، منفصلة بلطف مجموعة من الشريحة الغطاء وسحب غطاء الشريحة. يجب الحرص على عدم لمس الصفيف كما يتم سحبها خارج الشريحة. إغلاق المخروطية وعكس برفق لمدة 60 ثانية.
  7. باستخدام الملقط ، ونقل الصفيف إلى حل SCC 1X ، وكأب الأنبوب ، وعكس بلطف لمدة 1 دقيقة ثم نقل الصفيف إلى الحل الثاني ، ومرة ​​أخرى SCC 1X عكس برفق لمدة دقيقة واحدة.
  8. أخيرا ، ونقل الصفيف إلى أنبوب درهم 2 O وعكس برفق لمدة 30 ثانية.
  9. تجفيف عن طريق وضع مجموعة حواف الشريحة على Kimwipe. تواصل تدوير المصفوفة على مسح التأكد من عدم تعطيل الجانب الذي يحتوي على oligos.
  10. مكان جاف في الصفيففارغة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل والمسح الضوئي مع ماسح ضوئي ميكروأري

تفسير ميكروأري

  1. سوف الماسح ميكروأري خلق صورة TIF من الصفيف. تشغيل هذه الصورة من خلال ميزة استخراج اجيلنت البرمجيات ، وذلك باستخدام ملف الشبكة (التي قدمتها اجيلنت) والتي هي فريدة من نوعها تجمع محددة.
  2. يقوم البرنامج اجيلنت تفسير الإشارة في كل ميزة لإنشاء ملف ، والتي يتم تحليل مع مخطوطة برل. إشارة في كل الميزة تطبيع مع كثافة في مجموع تلك القناة. على سبيل المثال في ميزة خاصة في قناة خضراء ، وينقسم لشدة قناة خضراء لميزة الفردية كثافة الإجمالية للقناة الخضراء على كافة الميزات. الناتج النهائي هو نسبة تسجيل للقناة الأحمر عبر قناة خضراء في كل ميزة على صفيف.
  3. يمكن أن تكون بيانات تجمع بنسبة ضئيلة من ميكروأري إعادة تعيينها إلى الجينوم للحصول على صورة للمكان ، وكيف بقوة ، منضما RNP المصالح.

الشكل 1. التجريبية التخطيطي

الشكل 1A
ألف التبليط المخطط. بعد اختيار وتحميل ما قبل مرنا متواليات من الفائدة ، يتم اختيار تجانب المنطقة من خلال نوافذ في 30 النوكليوتيدات هذا التحول في زيادات 10 النوكليوتيدات. عالمي الجناح التمهيدي مواقع الربط كل جانب من النافذة.

الرقم 1B
باء التجميعي صفيف. وينبغي تقديم طلبات المغطى بنسبة ضئيلة لاجيلنت ، حيث سيتم طباعتها على تسلسل ميكروأري قليل النوكليوتيد المخصصة.

الرقم 1C
جيم المشارك مناعي. بعد غلي oligos قبالة مجموعة ، في احتضان استخراج هيلا النووية ، إضافة إلى استخراج ثم حبات المغناطيسية التي تعد مع الأضداد ضد RNP المصالح. تسمية تجمع بنسبة ضئيلة بدءا Cy3 وتجمع ملزمة IP مع Cy5 وتنطبق على مجموعة الكشف والمسح الضوئي.

الشكل 2. التأشير الجينوم مع البيانات وتحليلها لتخصيب اليورانيوم.

الشكل 2
A. تحويل متوسط ​​درجة التنسيق في كل من البيانات الجينومية الصفيف إلى قاعدة العشر سجل وخريطة هذا الشأن إلى إحداثيات معينة. وتعطى مثالا على هذه الخطوة في المتوسط ​​لمدة 3 المتداخلة 30 - NT oligos مع العشرات من 2 ، 4 ، و 0.5 ، حيث المجدولة درجة تخصيب المتوسط ​​لكل إطار NT - 10 أعلاه. ويمكن تحديد المناطق الجينومية تصور باستخدام المسار مخصص في متصفح الجينوم USCS. نافذة المتصفح مثال معين هو في الجينات clta ، حيث يتم إعطاء ميزات الجين (exons متماثلة / الإنترونات / الربط البديلة الخ) على طول القاع ، وسجل عشرات تخصيب المتوسط ​​من oligos PTB محدد يتم تمثيلها بواسطة قضبان عمودية داكنة اللون الأحمر. PTB يربط بقوة فقط من المنبع اكسون 2 في المسالك polypyrimidine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عندما تفعل هذا الإجراء مهم لنتذكر أن إنشاء تجمع مرنة وقابلة للتعديل في الحمض النووي الريبي إما أو مستوى البروتين. ويمكن على مستوى الحمض النووي الريبي الأخذ orthologous المناطق ، والطفرات المرض ، وتعدد الأشكال ، أو الطفرات العشوائية في تسلسل قليل النوكليوتيد. ويمكن في مستوى البروتين يمكن تعديل عامل الحمض النووي الريبي ملزمة الفسفرة أو تعديلات أخرى متعدية آخر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب البيئة ملزم إما زيادة أو نقصان مستويات من العوامل الإضافية التي تتفاعل أو التنافس مع البروتين النووي الريبي ملزمة للاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics