שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד ללמוד

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Watkins, K. H., Stewart, A., Fairbrother, W. G. A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA. J. Vis. Exp. (34), e1622, doi:10.3791/1622 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סידור RNAs כי שיתוף immunoprecipitate (Co-IP) עם חלבונים RNA מחייב גדלה ההבנה שלנו של שחבור ידי הוכחת כי המיקום מחייב לעתים קרובות משפיעה על תפקוד של גורם שחבור. עם זאת, כמו כל אסטרטגיה הדגימה את הסיכוי לזיהוי RNA חייב גורם שחבור הוא יחסי שפע הסלולר שלה. פיתחנו רומן בגישה חוץ גופית עבור מדידות סגוליות מחייבים חולף אחרת מראש mRNA. גישה זו משתמשת בריכה oligonucleotide שתוכננו במיוחד כך פני אריחי אינטרונים, אקסונים, צמתים אחוי, או אחר מראש mRNA. הבריכה היא נתון כלשהו מבחר מולקולרית. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה על ידי הפרדת oligonucleotide לתוך חלק כבול מאוגד ולנצל שני מערך צבע אסטרטגיה כדי להקליט את העשרת oligonucleotide כל שבריר כבול. הנתונים מערך מייצר ברזולוציה גבוהה מפות עם היכולת לזהות רצף ספציפי מבניים determinates של ribonucleoprotein (RNP) מחייב mRNA מראש. יתרון ייחודי שיטה זו היא היכולת שלה למנוע הטיה כלפי הדגימה mRNA הקשורים ה-IP הנוכחית וטכניקות Selex, כמו הבריכה היא תוכננה במיוחד ו מסונתז מתוך רצף ה-mRNA מראש. הגמישות של הבריכה oligonucleotide הוא יתרון נוסף מאז הנסיין בוחר אילו אזורים ללמוד על פני אריח, בהתאמת הבריכה הצרכים האישיים שלהם. באמצעות טכניקה זו, ניתן assay את ההשפעות של פולימורפיזם או מוטציות על הכריכה בקנה מידה גדול או לשכפל את הספרייה לתוך כתב שחבור פונקציונלי לזהות oligonucleotides כי מועשרים בשבריר כלל. זה רומן במבחנה ברזולוציה גבוהה תוכנית מיפוי מספק דרך ייחודית ללמוד אינטראקציות עם RNP מראש mRNA מינים חולפים, אשר נמוך שפע גורם להם קשה ללמוד עם הנוכחי טכניקות vivo.

Protocol

בריכת עיצוב אוליגו התאוששות

  1. הצעד הראשון הוא לתכנן את הבריכה מראש mRNA כדי להיחקר. ניתן לעשות זאת באמצעות דפדפן הגנום UCSC והורדה של גנים מסוימים, צמתים אחוי, או אזורים אחרים בעלי עניין.
  2. לאחר החלונות עניין נבחרו, על פני אריח אותם המחשוב באמצעות התנאים הבאים: אורך לקרוא צריך להיות 30 נוקלאוטידים עם 10 נוקליאוטידים חופפים, ולכן כל אוליגו מוסט 20 נוקלאוטידים מזה מראש. * חפיפה אוליגו צריכה להיות מוגברת בסמיכות לאתרים אחוי מנת להבטיח כיסוי הולם, להגדיל את החפיפה 10-20 נוקלאוטידים יכולים להשיג את זה.
  3. הצלע כל אוליגו 30 רצפי נוקליאוטידים עם פריימר אוניברסלי, אשר ישמש כדי להגביר את הזרם הבריכה. פרוש הזמנות אוליגו יש להגיש Agilent, שבו רצפי יודפסו על microarray oligonucleotide אישית.
  4. כדי לשחזר את oligos DNA מפני השטח microarray להתחיל על ידי הצבת את השקופית לכסות מערך בתא הכלאה מערך בעדינות pipetting 500 μL של DH 2 O לשקופית
  5. סנדוויץ המערך על גבי החלק את המכסה, לטפל כדי למנוע בועות אוויר אשר יכולים לשבש את התהליך. הקפידו למקם את פני מערך מטה כך את הצד עם oligos הוא נוגע פני המים. כלל אצבע טוב הוא "Agilent נוגע Agilent", כלומר את התווית Agilent במערך הפנים את התווית Agilent בשקופית לכסות
  6. סגור את תא הכלאה ולסובב לילה בשעה 99 ° C בתנור הכלאה
  7. למחרת, להסיר בזהירות את מערך מהאולם ולהסיק את המים, אשר מכיל כעת oligos המשוחררת מפני השטח המערך. זוהי בריכה אוליגו
  8. מניחים את הבריכה צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ו sonicate הבריכה בבית משרעת 50% 3-5 פולסים second
  9. בשלב הבא, להגביר את הבריכה על ידי מעגל ה-PCR נמוך, באמצעות primers אוניברסלי עם תג T7 המצורף עד הסוף. במשך סיבוב לפגל הראשון, ב 94 מעלות צלזיוס למשך דקה 1, לחשל על 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, להאריך דקה 1 ב 72 ° C. עבור סיבובים לאחר מכן, לעשות 10 שניות, 20 שניות, 10 שניות בטמפרטורת כל בהתאמה, בצעד התארכות הסופי של 5 דקות בשעה 72 ° C. מכיוון שמספר מחזורי צורך להגביר את הבריכה תלוי היעילות של התאוששות אוליגו, זה עשוי להיות נחוץ כדי לנסות מספרים מחזור מרובים. היזהר שלא מעל להגביר את הבריכה, אשר מסומן על ידי להקה מרוח על ג'ל acrylamide. דגימות ה-PCR מוגבר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  10. השלב האחרון בהכנת אוליגו הוא לתמלל RNA באמצעות ערכת ™ MEGAshortscript מ Ambion. * פרוטוקול הבאים הותאם מ Ambion
    1. ההפשרה הצפת התגובה 10x T7, ארבעה פתרונות ribonucleotide מים בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על מערבבים אנזימים T7 על הקרח
    2. להרכיב את תערובת התגובה בצינור RNase ללא microcentrifuge בטמפרטורת החדר. רכיבי למאגר התגובה עלולה לגרום תבנית ה-DNA כדי לזרז אם התגובה היא מעורבת על הקרח.
    3. לפי הסדר הבא, פיפטה 3 מים μL nuclease חינם, 2 μL של למאגר התגובה 10x, 2 μL של כל פתרון 75 מ"מ NTP, 5 μL של תבנית ה-DNA (מאגר מוגבר PCR אוליגו) ו 2 μL T7 של האנזים, עבור נפח הסופי של μL 20
    4. פליק הצינור בעדינות כדי לערבב את התגובה אז בקצרה microfuge לאסוף את התערובת בתחתית של התחתית.
    5. דגירה התגובה thermocycler על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. זמן דגירה יהיה תלוי תבנית, ולכן ייתכן שיהיה צורך להשתמש ניסוי זמן כמובן לקבוע את זמן הדגירה האופטימלית תשואה מקסימאלית
    6. לאחר 2 שעות, להסיר את תבנית ה-DNA על ידי הוספת 1 μL של טורבו DNase לתגובה ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות
    7. לסיים את התגובה ולשחזר את הרנ"א על ​​ידי מיצוי פנול / כלורופורם משקעים אתנול.
      1. לקבלת נפח 20 תגובה μL, להוסיף 115 μL של DH 2 O ו - 15 μL של נתרן אצטט M 3 לתגובה.
      2. מערבבים היטב לאחר מכן להוסיף 75 μL של μL פנול 75 חומצי של כלורופורם. מערבבים את הפתרון על ידי vortexing, microfuge מכן למשך דקה אחת על 13,000 סל"ד בטמפרטורת החדר. מעבירים את השכבה המימית לצינור חדש וחזור על מיצוי
      3. מעבירים את השכבה המימית לצינור חדשה ולהוסיף 150 μL של כלורופורם. וורטקס את התערובת צנטריפוגות כמו קודם. מעבירים את השכבה המימית לצינור חדש.
    8. שחזר את הרנ"א על ​​ידי הוספת שני כרכים של אתנול קר 100% לשכבה מימית ערבוב טוב. צ'יל את התערובת למשך תקופה מינימלית של 15 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות במהירות המרבית כדי גלולה רנ"א. הסר בזהירות את supernatant ו resuspend גלולה ב 105 μL של הצפת 0.1x (TE) טריס-EDTA ..
  11. קשה להסיר את כל נוקלאוטידים ללא תגובה את ערכת T7, כך את התוצאות המדויקות ביותר, לכמת את RNA באמצעות RiboGreen.
    1. כדי להתחיל את quantitation, קודם לדלל מספיק 1x TE, 2300 μL + 50μL/sample.
    2. בשלב הבא, להפוך את RiboGreen. יהיה עליך μL 1000 + 50 μL / מדגם. לקבלת דוגמיות מגוון גבוהה (1 מיקרוגרם / מ"ל ​​עד 20 נ"ג / מ"ל) לערבב 1:200 RiboGreen ב 1x TE; עבור דגימות בטווח נמוך (50 ng / mL עד 1 ng / mL) לערבב 1:2000 RiboGreen ב 1x TE ; פיפטה 50 μL של פתרון RiboGreen לבאר כל צלחת אטום, החל A1 ו נע למטה, לא מעבר
    3. מדולל פתרון מניות RNA ל 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור דגימות בטווח גבוה או 100 ng / μL עבור דגימות טווח נמוך
    4. באמצעות פתרונות המניות, ליצור עקומת סטנדרט של שישה 01:02 דילולים הבאות של המניות המקורי 2 ng / mL מיקרוגרם / מ"ל ​​או 100; פיפטה 240 μL של המניה לתוך צינור רצועת PCR. ב 7 צינורות הנותרים, פיפטה 120 μL של 1x TE. קח 120 μL ממלאי RNA היטב, לערבב עם צינור 2. קח 120 μL מהצינור 2 ומערבבים עם צינור 3. חזור על הפעולה עד צינור 7. Tube 8 תהיה רק ​​TE יהיה ריק שלך. פיפטה 50 μL של פתרונות עקומת סטנדרט לתוך הצלחת אטום, A1: H2 (להפעיל את עקומת פעמיים)
    5. בתוך צינור חדש, לערבב 45 μL של TE עם μL 5 הבריכה אוליגו ולהוסיף כל μL 50 היטב המכיל 50 μL של RiboGreen.
    6. באמצעות קורא הצלחת להגדיר את המכשיר כדי לקרוא הקרינה מלמעלה אחרי תערובת של דקה אחת עם גל עירור של 485 ננומטר אורך גל 530 ננומטר פליטת ולקרוא את הצלחת
    7. השתמש עקומת תקן שנוצר לכמת את RNA התאושש, אשר צריך להיות מאוחסן ב -20 ° C.

Co-immunoprecipitation הבריכה עם אוליגו RNP עניין

  1. לפני תחילת שיתוף immunoprecipitation, להכין את חלבון וחלבון Dynabeads G מ Invitrogen ידי ערבוב אותם ביחס של 1:1 עד נפח סופי של 50 μL לכל תגובה. לדוגמה, עבור שתי תגובות הייתם מוסיפים 50 כל אחד μL כל חרוז.
  2. השתמש Stand ההפרדה מגנטי כמו זה של Novagen להחזיק את החרוזים במקום בזמן שאתה להסיר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים עם נפח שווה של קר 1x PBS
  3. לאחר לשטוף את השני, resuspend החרוזים בנפח שווה של קר 1x PBS ולהוסיף 2 ננוגרם של הנוגדן לכל תגובה. סכום זה עשוי להשתנות בהתאם הנוגדן, ולכן יש צורך בניסויים כדי למצוא את התנאים האופטימליים.
  4. דגירה את התערובת נוגדן / חרוז לילה ב 4 ° C על פלטפורמת מסתובב
  5. בבוקר, להוסיף 2 מיקרוגרם לכל תגובה של רנ"א סך sonicated שמרים לחסום הלא ספציפית מחייב, לסובב עבור 30 דקות נוספות ב 4 ° C.
  6. באמצעות מתלה מגנטי להחזיק חרוזים, להסיר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים עם קר 1x PBS, עוזב את PBS החל לשטוף את השני הצינור.
  7. הוציאו צינורות חדשים, אחד עבור כל תגובה 50 aliquot μL של התערובת חרוז לתוך צינור אחד. בואו החרוזים לשבת בעת הכנת תערובת אמן
  8. עבור כל תגובה להוסיף 200 ננוגרם של הבריכה אוליגו, יחס equimolar של primers הגנה, 2 מיקרוגרם של sonicated סך שמרים RNA, 20 μL של תמצית גרעיני הלה (זהו מקור RNP), ו-E חיץ להביא את נפח עד 120 μL. Primers הגנה גירסאות RNA של primers אוניברסלית. סדר תבניות שעתוק של primers אוניברסלי עם תג T7 המצורף עד הסוף, אז לתמלל RNA של תבניות באמצעות ™ MEGAshortscript קיט.
  9. הסר את supernatant מן aliquots חרוז וחרוזים resuspend ב μL 120 תמהיל האב. רוק התגובות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
  10. לאחר דגירה, עבור כל תגובה, להסיר aliquot קטן (כולל את החרוזים) עבור מדגם "סך הכל" RNA
  11. מניחים את שאר התגובות על הפרדה המגנטי עומד להסיר את supernatant. אמנם אין צורך לנתח את זרימת הזרם באמצעות מדגם, זה עשוי להיות שימושי כדי לשמור.
  12. שטפו את החרוזים 1-2 פעמים עם 50 μL של קר 1x PBS. RNA חייב הנוגדן על החרוזים הוא מדגם "IP".
  13. Resuspend "סך הכל" ואת "IP" חרוזים μL 50 SDS של 1% חיץ TE 0.1x והחום דגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי elute רנ"א.
  14. הסר את supernatant, אשר כעת המכיל את הרנ"א כי הייתה קשורה בעבר את החרוזים ונקי על ידי מיצוי פנול / כלורופורם ואחריו משקעים אתנול. יבש את הכדור ואת resuspend אותו 50 חיץ μL TE 0.1x.

שעתוק הפוך והגברה של שיתוף IP דגימות כהכנה תיוג aminoallyl

  1. בשלב הבא, דגימות רנ"א יש עיבד הפוך PCR מוגבר. עבור התגובה שעתוק לאחור, השתמש primers אוניברסלי הפוך.
  2. עבור כל דגימה, להתחיל על ידי ערבוב של 1 μLפריימר אוניברסלי הפוכה, עם μL 1 של תבנית רנ"א (מן התגובה immunoprecipitation) ו 10 μL של DH 2 O. מחממים את התגובות על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על הקרח, או לשמור על 4 ° C.
  3. בעוד דגימות מגניב, לעשות את המיקס מאסטר הבאה. עבור כל תגובה לשלב 4 μL של dNTPs 10 מ"מ, 2 μL של חיץ Arrayscript 10x, 1 μL מעכב RNase, ו 1 שעתוק μL אנזים הפוך. מערבבים היטב ומוסיפים 8 μL של תמהיל מאסטר התגובה לכל שעתוק לאחור.
  4. השתמש מכונת PCR כדי לדגור דגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, אז 4 ° C עד דגימות נדרשים עבור הגברה.
  5. לאחר הפוך לתעתוק דגימות RNA, PCR להגביר אותם באמצעות primers אוניברסלי, עם אחד primers המכיל תג T7. מספר המחזורים הדרוש כדי להגביר את הבריכה תהיה תלויה ביעילות של IP משותפת, כך זה עשוי להיות נחוץ כדי לנסות המחזורים מרובים. התגובה של כל דורש 5 μL של חיץ תקי 10x התגובה, 0.2 μL של כל צבע יסוד (100 מ"מ), 1 μL של תבנית cDNA (מן התגובה שעתוק לאחור), 1 μL של dNTPs 10 מ"מ, 42.2 μL של DH 2 O, ו 0.4 μL של האנזים תקי.

    בגין PCR על ידי דוגרים דגימות ב 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הבא לפגל עבור כל מחזור, ב 94 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, לחשל ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, להאריך ב 72 ° C למשך דקה אחת, עם התארכות סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. בשלב הבא, לתמלל את דגימות שוב באמצעות ערכת ™ MEGAshortscript עם זאת, בשלב זה מוסיפים 2 μL של aminoallyl UTP, במקום UTP T7. UTP aminoallyl ישמש התווית RNA עם צבעים סיי.
  7. פנול / כלורופורם ואתנול לזרז את הדגימות. אין להשתמש Glycoblue או אמוניום אצטט, אשר שניהם עלולים להפריע הכלאה של הדגימות למערך. יבש את הכדור ואת resuspend ב μL 4.5 של קרבונט M 0.1 נתרן.

אמינו-allyl תיוג של רנ"א עם צבעים סיי

  1. כדי להתחיל את הפרוטוקול תיוג להמיס כל אחד צבעי ניאון, cy3 ו cy5, ב 45 μL של DMSO. כדי להימנע אור, לעטוף את צינורות אלומיניום ולאחסן ב -20 ° C בחושך
  2. הוסף 2.5 μL מים nuclease-RNA חופשי דגימות ומערבבים היטב
  3. לאחר מכן, להוסיף 3 μL של Cy3 על מדגם "סך הכל", ו - 3 μL של Cy5 על מדגם "IP". דגירה דגימות בחושך במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר; מדגם סי-3 יהפוך אדום או ורוד בעוד סיי-5 יהפוך כחול.
  4. כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 6 UL של 4-M hydroxylamine HCl מדגם אחד, לערבב היטב ספין בקצרה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לטהר את הדגימות מסומן על ידי מיצוי פנול / כלורופורם ואחריו אתנול המשקעים resuspend גלולה ב 50 μL של 0.1x TE

להכליא דגימות microarray באמצעות ערכת הכלאה Agilent Array

  1. בגין הכלאה בעדינות על ידי ערבוב 50 μL של חיץ חסימת 10x, 140 μL של nuclease ללא H2 O, 25 μL של הבריכה Cy3 שכותרתו "סך הכל", 25 μL של Cy5 שכותרתו הבריכה "IP", 10 μL של חיץ הפיצול 25x ו 250 μL של למאגר הכלאה 2x, לטפל כדי למנוע החדרת בועות. Microfuge המדגם בקצרה לאסוף את הפתרון בתחתית של התחתית וגם להפחית בועות.
  2. מניחים את השקופית O-טבעת לכסות בחדר הכלאה ובזהירות פיפטה הפתרון לשקופית.
  3. הנח את מערך איתור על גבי החלק את המכסה כדי "כריך" הפתרון. זכור כדי להחליק את מערך לכוון כך את התווית Agilent במערך הפנים את התווית Agilent בשקופית לכסות.
  4. הצמד את הכריך שקופיות / מערך בתא הכלאה ולסובב ב 50 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  5. בעוד מערך מסתובב, לעשות את הפעולות הבאות פתרונות 50 מ"ל צינורות חרוטי 50 מ"ל: האחד חרוט מלא 50 מ"ל של DH 2 O, שני 1x SCC חיץ פתרונות, כל אחד בצינור נפרד, ואחד חיץ 2x SCC.
  6. לאחר דגירה של שלוש שעות, בזהירות unclamp את הכריך מערך / שקופיות למקם אותו ב 50 מ"ל חרוטי המכיל את מאגר 2x SCC. בעזרת פינצטה, בעדינות נפרד מן המערך והחלק את הכיסוי ולשלוף את השקופית לכסות. היזהר שלא לגעת מערך כמו השקופית שלף. סגור את חרוטי להפוך בעדינות למשך 60 שניות.
  7. בעזרת פינצטה, להעביר את מערך לפתרון 1x SCC, מכסה את הצינור, בעדינות להפוך לרגע 1 ולאחר מכן להעביר את מערך הפתרון השני SCC 1x ושוב להפוך בעדינות עוד דקה.
  8. לבסוף, העברת מערך הצינור של DH 2 O להפוך בעדינות למשך 30 שניות.
  9. יבש את המערך על ידי הצבת את הקצוות של השקופית על Kimwipe. המשך לסובב את מערך על לנגב לוודא שלא לשבש את הצד המכיל את oligos.
  10. הנח את מערך היבשהשפופרת ריק 50 מ"ל חרוטי ולסרוק עם סורק microarray

פרשנות microarray

  1. סורק microarray תיצור תמונה TIF של המערך. הפעל את התמונה באמצעות התוכנה הבלטת תכונות Agilent, באמצעות קובץ רשת (מסופק על ידי Agilent), אשר הינו ייחודי בריכה הספציפי שלך.
  2. התוכנה Agilent יפרש את האות על כל תכונה כדי ליצור קובץ, אשר מנותח עם תסריט Perl. האות על כל תכונה היא לנרמל עוצמת סך בערוץ זה. לדוגמה ב תכונה מסוימת בערוץ ירוק, האינטנסיביות של ערוץ ירוק עבור תכונה הפרט מחולק לפי העוצמה הכוללת של הערוץ הירוק על כל התכונות. התוצר הסופי הוא היחס יומן של הערוץ האדום מעל הערוץ הירוק כל תכונה במערך.
  3. הנתונים בריכה אוליגו מ microarray ניתן למפות מחדש חזרה בגנום כדי לקבל תמונה של איפה, כמה חזקה, RNP ריבית מחויב.

באיור 1. ניסיוני סכמטית

איור 1a
א ריצוף התוכנית. לאחר בחירת והורדת mRNA טרום רצפים של עניין, אזור בחירה הוא דרך מרוצפת ב 30 חלונות נוקלאוטיד כי השינוי במרווחים של 10 נוקליאוטידים. פריימר אוניברסלי מחייב האגף אתרים בכל צד של החלון.

איור 1b
ב Array סינתזה. פרוש הזמנות אוליגו יש להגיש Agilent, שבו רצפי יודפסו על microarray oligonucleotide אישית.

איור 1 ג
ג Co-immunoprecipitation. לאחר הרתיחה oligos את המערך, דגירה בתמצית הלה גרעיני, ואז מוסיפים את תמצית חרוזים מגנטיים כי הם מוכנים עם נוגדן כנגד RNP של עניין. לייבל הבריכה אוליגו החל Cy3 ובריכת IP מאוגד עם Cy5 וליישם מערך איתור סריקה.

איור 2. ביאורים את הגנום עם וניתוח של נתונים העשרה.

איור 2
א להמיר את הציון הממוצע בכל לתאם כל גנומית מנתוני מערך להיכנס לבסיס עשר ו מפה ציון לקואורדינטות הנתון. המחשה של שלב זה נתון ממוצע עבור 3 חופפים 30-NT oligos עם עשרות רבות של 2, 4 ו 0.5, כאשר הציון הממוצע העשרה עבור חלון 10-NT כל בגרף לעיל. האזורים שנבחרו גנומי ניתן דמיינו באמצעות מסלול מותאם אישית דפדפן הגנום USCS. דפדפן למשל חלון נתון בגן clta, שבו תכונות הגן (אקסונים / אינטרונים / שחבור חלופי וכו ') ניתנות בחלק התחתון וממוצע ציונים יומן העשרה מן PTB הנכנס oligos מיוצגים על ידי הקווים האנכיים כהה אדום. PTB נקשר חזק רק נגד הזרם של אקסון 2 בדרכי polypyrimidine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כשעושים הליך זה חשוב שלה לזכור כי הקמת הבריכה היא גמישה ופתוחה לשינויים בבית או RNA או רמת חלבון. ברמה RNA האזורים orthologous, מוטציות מחלה, פולימורפיזמים, או מוטציות אקראיות יכול להיות מוחדר רצף oligonucleotide. ברמת החלבון גורם RNA מחייב ניתן לשנות על ידי זרחון או שינויים אחרים לפרסם translational. בנוסף, הסביבה מחייב ניתן להשפיע או כדי להגדיל או להקטין את רמות של גורמים נוספים כי אינטראקציה או להתחרות עם החלבון RNA מחייב של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics