कैंसर कोशिकाओं के PuraMatrix इनकैप्सुलेशन

Biology
 

Summary

इस वीडियो को दर्शाता है कैसे encapsulate और संस्कृति PuraMatrix, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेप्टाइड जेल कोडांतरण आत्म में कैंसर की कोशिकाओं.

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Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692, doi:10.3791/1692 (2009).

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Abstract

बढ़ती सबूत है कि तीन आयामों में संवर्धन कैंसर की कोशिकाओं को अधिक सटीकता से पता चलता है recapitulates ट्यूमर जीव विज्ञान की जटिलता. इन मॉडलों के कई पुनर्गठन तहखाने वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स कि इन सेल संस्कृति मॉडल के विकास को प्रभावित कर सकते हैं एक चर मात्रा में होते हैं जो जानवरों से व्युत्पन्न झिल्ली का उपयोग. यहाँ, हम विस्तार से वर्णन है और PuraMatrix, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आत्म कोडांतरण पेप्टाइड जेल है कि पशु व्युत्पन्न सामग्री और रोगज़नक़ों encapsulate और डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन, OVCAR 5 प्रचार से रहित है की तैयारी का उपयोग करें. हम वर्णन कैसे PuraMatrix तैयार करने से पहले का उपयोग करने के लिए द्वारा शुरू करते हैं. अगला, हम का प्रदर्शन कैसे ठीक PuraMatrix और सेल निलंबन का मिश्रण करने के लिए hydrogel में कोशिकाओं encapsulate. एक मनोवैज्ञानिक वातावरण में सेल संस्कृति मीडिया या इंजेक्शन के अलावा पर, PuraMatrix के पेप्टाइड घटक तेजी से स्वयं एक 3D hydrogel कि 500-200 एनएम के एक औसत रोमकूप आकार के साथ एक nanometer पैमाने रेशेदार संरचना दर्शाती है assembles में

Protocol

तकनीकी नोट्स:

  • जमाना लवण के अलावा द्वारा शुरू की है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोई लवण PuraMatrix के साथ संपर्क में आते हैं जब तक जमाना वांछित है, अपरिवर्तनीय जमाना बहुत कम ईओण ताकत का लवण (उदाहरण के लिए, <0.05 एम) के लिए जोखिम का कारण होगा.
  • बचे हुए स्टॉक समाधान है कि तैयार हैं एक बाद की तारीख में बशर्ते वे नमक के साथ संपर्क में नहीं आया है इस्तेमाल किया जा सकता है. तुम दोहराने sonication के बारे में चिंता करने की जरूरत नहीं है.
  • वायु बुलबुले बाँझ centrifugation द्वारा पीछा ट्यूबों में PuraMatrix aliquoting हटाया जा सकता है है.
  • मीडिया परिवर्तन के दौरान बहुत सावधान रहना है के रूप में आकांक्षा आसानी से PuraMatrix बिस्तर को बाधित कर सकते हैं.

सामग्री:

बी.डी. PuraMatrix RAD16 Hydrogel-1% पेप्टाइड (कैट 354,250 #): undiluted मिश्रण की कुल पेप्टाइड एकाग्रता 10 मिलीग्राम / एमएल है.

  • जल स्नान Sonicator या भंवर
  • 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश
  • सेल संस्कृति मीडिया
  • बाँझ छनित एच 2 हे
  • बाँझ छानने का 20% Sucrose
  • (5,000 कोशिकाओं को सभी अच्छी तरह से /) कक्ष: OVCAR 5

सभी चरणों सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

प्रक्रिया:

  1. 30 मिनट के लिए पानी के स्नान sonicator में 1% PuraMatrix (RAD16) Sonicate चिपचिपापन पहले कम उपयोग करने के लिए.
  2. 1% PuraMatrix समाधान अब बाँझ ट्यूबों में aliquoted जा सकता है भविष्य प्रयोगों को सरल.
    1. हवाई बुलबुले के गठन से बचें, अगर वे फार्म बस नीचे बाँझ 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर (300 XG) PuraMatrix युक्त ट्यूबों स्पिन.
    2. undiluted मिश्रण की कुल पेप्टाइड एकाग्रता 10 मिलीग्राम / एमएल है.
  3. 4 कुओं के दो सेट 2.5 मिलीग्राम / एमएल और 1.25 मिलीग्राम / मिलीलीटर कुल पेप्टाइड एकाग्रता, क्रमशः पर चढ़ाया जाएगा.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से 0.2 बाँझ फ़िल्टर 20% sucrose और 5 मिलीग्राम / एमएल और 2.5 मिलीग्राम / एमएल की कुल पेप्टाइड सांद्रता के लिए 13.3% sucrose सुक्ष्ममापी के साथ सेट में PuraMatrix पतला, क्रमशः 10% sucrose में बी.डी. PuraMatrix की एक 2x एकाग्रता को प्राप्त करने.
    1. 20% sucrose, sucrose के 10 छ, तो मात्रा 50 मिलीलीटर पानी के लिए पतला.
    2. 13% और 10% sucrose के 20% शेयर समाधान गिराए द्वारा तैयार किया जा सकता है है.
      1. 13% Sucrose (हर 10 मिलीलीटर के लिए): 6.5 मिलीलीटर 20% + sucrose के 3.5 मिलीलीटर बाँझ एच 2 ओ
      2. 10% Sucrose (हर 10 मिलीलीटर के लिए): 5.0 मिलीलीटर 20% + sucrose के 5.0 मिलीलीटर बाँझ एच 2 ओ
  5. आप थाली करने का इरादा कुओं की संख्या के आधार पर PuraMatrix पेप्टाइड का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. (नीचे उदाहरण देखें.) तो व्यक्ति मास्टर मिश्रण के 25 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में विभाज्य.
    1. मास्टर मिश्रण दो बार कुल पेप्टाइड वांछित अंतिम एकाग्रता में तैयार किया जाना चाहिए के रूप में चढ़ाना के दौरान कोशिकाओं के बराबर मात्रा के साथ पतला हो जाएगा.
      1 आंकड़ा
  6. सेल monolayer सेल संस्कृतियों trypsinizing के द्वारा सेल निलंबन तैयार करें.
    1. 0.05% trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर प्रत्येक फ्लास्क T-75 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. सेल संस्कृति 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (मिलीलीटर प्रति trypsin के पिछले चरण में इस्तेमाल मीडिया के कम से कम 2 मिलीलीटर का उपयोग करें.) युक्त मीडिया के अलावा द्वारा trypsin बेअसर
  8. 5 मिनट के लिए एक सेल गोली बनाने के लिए 1000 rpm (~ 300 XG) में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    1. 10% बाँझ फ़िल्टर sucrose में कोशिकाओं Resuspend.
    2. कोशिकाओं की गणना और नीचे फिर 1000 rpm (~ 300 XG) में 5 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए मीडिया में पाया नमक की मात्रा का पता लगाने को दूर.
  9. 2.0 x 10 में 10% sucrose में OVCAR-5 कोशिकाओं Resuspend 5 कोशिकाओं / एमएल इतना है कि अच्छी तरह से प्रति अंतिम कोशिका गिनती 5,000 कोशिकाओं प्रत्येक कुएं में किया जाएगा .

    निम्नलिखित कदम तेजी से किया जाना चाहिए.
  10. पहले व्यक्ति PuraMatrix के मास्टर मिश्रण के रूप में ऊपर योजनाबद्ध में दिखाया गया है के 25 μl युक्त ट्यूब 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / मिलीलीटर निलंबन का 25 μl जोड़ें.
    1. जल्दी ट्यूब में pipetting (~ 5 ऊपर और नीचे गुना) द्वारा हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना मिश्रण.
    2. फिर एक 96 में अच्छी तरह से डिश के उचित अच्छी तरह से में 50 μl सेल मिश्रण निलंबन PuraMatrix / विंदुक.
    3. धीरे से अच्छी तरह से किनारे करने के लिए 150 μl सेल संस्कृति मीडिया (RPMI + 10% FBS) pipetting द्वारा बी.डी. PuraMatrix का जमाना आरंभ करें
      चित्रा 2
  11. 8 में उल्लिखित जब तक सभी कुओं मढ़वाया गया है चरणों को दोहराएँ.
  12. 30 मिनट के बाद बहुत धीरे ~ 2 / 200 μl विंदुक का उपयोग करने के लिए hydrogel के पीएच संतुलित मीडिया के 3 हटायें .
    1. का उपयोग करें के रूप में इस मैट्रिक्स को बाधित करेगा नहीं एक निर्वात Aspirator
    2. अच्छी तरह से विंदुक टिप इतना है कि प्लेसयह PuraMatrix बिस्तर स्पर्श नहीं करता है और धीरे से अच्छी तरह से मीडिया को दूर.
    3. केयर PuraMatrix में कोशिकाओं की संस्कृति के दौरान मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए .
  13. बहुत धीरे PuraMatrix में अच्छी तरह से युक्त समझाया कोशिकाओं के पक्ष में ताजा सेल संस्कृति मीडिया के 150 μl जोड़ने.
  14. ध्यान से 10 और 11 कदम दोहरा द्वारा एक अच्छी तरह से ताजा संस्कृति मीडिया के साथ हर 48 घंटे में सेल संस्कृति मीडिया बदलें.

प्रतिनिधि परिणाम:

1 आंकड़ा
चित्रा 1 OVCAR-5 कोशिकाओं समझाया गया के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है. नीलम लेजर 750 एनएम के लिए देखते: छवियाँ एक औंधा ओलिंप FV1000 स्पेक्ट्रा भौतिकी DeepSee तिवारी के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया. इमेजिंग सत्र 1 दिन, 3, 5 और 7 के बाद चढ़ाना पर आयोजित की गई. एक लंबे समय तक काम दूरी, 40x उद्देश्य सूई पानी PuraMatrix (ओलिंप 0.8 LUMPLFLN एनए) के माध्यम से छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था. तीन आयामी मात्रा 1.47 सुक्ष्ममापी अक्षीय चरणों में छवि ढेर प्राप्त द्वारा एकत्र किए गए थे. दो गैर descanned डिटेक्टरों autofluorescence उत्सर्जन बैंगनी (440-490 एनएम) और हरी (510-550 एनएम) bandpass फिल्टर का उपयोग कर एकत्र. अंतिम छवियों और गहराई ढेर फिल्में ImageJ का उपयोग कर दोनों का पता लगाने चैनलों के संयोजन के द्वारा संसाधित किया गया. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

References

  1. Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).

Comments

3 Comments

  1. How can you analyze in the confocal 3D cultures in a 96 well plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2010 - 10:11 AM
  2. Luis - for confocal imaging we recommend plating cultures in glass-bottom dishes or multiwell plates. We have recently described an extensive imaging-based approach for analysis and characterization of growth and treatment response of the 3D cultures in two publications: 1) J. Biomed. Opt., Vol. 15, 051603 (²010); doi:10.1117/1.3483903 and ²) Cancer Res; 70(²²); 9319&#x²013;²8. doi: 10.1158/0008-547².CAN-10-1783

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2010 - 11:20 AM
  3. how could you extract RNA from this 3D cultures?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2011 - 11:40 AM

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