मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं के अलगाव (HUVEC)

Biology

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Summary

यह वीडियो प्रोटोकॉल और मानव मानव गर्भनाल से नाल की नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के अलगाव की संस्कृति को दिखाता है. एक बार अलग इन विट्रो अनुकूलित आतंच जेल मनका भी ह्यूजेस प्रयोगशाला द्वारा प्रदर्शन परख की तरह angiogenesis assays में इन कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Davis, J., Crampton, S. P., Hughes, C. C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183, doi:10.3791/183 (2007).

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Abstract

Angiogenesis एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है, जहां angiogenic stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया में, नए जहाजों मौजूदा vasculature से बनाया जाता है है. इन चरणों में शामिल हैं: तहखाने झिल्ली प्रसार और प्रवास endothelial कोशिकाओं (अंकुरण) (ईसी) बाह्य मैट्रिक्स, डोरियों, लुमेन गठन, सम्मिलन, और एक नया तहखाने झिल्ली के गठन में चुनाव आयोग के संरेखण में की गिरावट. इन विट्रो assays में कई करने के लिए इस प्रक्रिया का अध्ययन किया गया विकसित किया है, लेकिन अधिकांश केवल angiogenesis के कुछ चरणों की नकल, और आकृति विज्ञान के वाहिकाओं अक्सर vivo में जहाजों समान नहीं है. यहाँ हम का प्रदर्शन इन विट्रो angiogenesis परख है कि मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग और fibroblasts इस्तेमाल में अनुकूलित. यह मॉडल angiogenesis की कुंजी प्रारंभिक चरणों के सभी का स्मरण दिलाता है, और महत्वपूर्ण बात वाहिकाओं पेटेंट कहनेवाला polarized चुनाव आयोग द्वारा घिरा lumens प्रदर्शित करते हैं. वेसल्स आसानी से चरण विपरीत और समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जा सकता है, और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध रूप में बरामद.

Protocol

प्रक्रिया

  1. स्वच्छ और अतिरिक्त रक्त बंद पैड थपका पर कॉर्ड लेटाओ. रस्सी के दोनों सिरों पर ताजा कटौती करें.
  2. प्लास्टिक की सुई पर म्यान के साथ नस में 21 1 / 2 जी सुई डालें . (नस सबसे बड़ा खोलने है, 2 छोटे धमनियों हैं)
  3. Hemostat के साथ जगह में सुई दबाना और हैंक्स के 20cc सिरिंज सुई देते हैं.
  4. हैंक्स मध्यम दबाव के साथ नस के माध्यम से पुश. ब्लीच के साथ बीकर में बर्बाद लीजिए. (एक हाथ से होल्डिंग सुई और गर्भनाल जबकि धक्का नस से बाहर popping सुई को रोका जा सके.) यदि नस में खून का एक बहुत कुछ है, दूसरी बार धोने.
  5. पैड पर गर्भनाल लेटाओ और नस के अन्य अंत दबाना. हैंक्स कॉर्ड के साथ लीक की जांच करने के लिए कुछ एमएल के साथ भरें. 5 एमएल वापस लेने और नीचे दबाना डिस्कनेक्ट.
  6. 20cc सिरिंज डिस्कनेक्ट. 10cc सिरिंज से सवार निकालें. सुई 10cc सिरिंज संलग्न, 10ml collagenase में डालना और सवार की जगह. नस में collagenase पुश जब तक आप देख पहली राशि खुले अंत बाहर निकलें. खुले अंत पुनः दबाना और collagenase के साथ भरने जब ​​तक वहाँ नस के उदारवादी बढ़ाना है. चिकनी पेशी संदूषण में बहुत ज्यादा फैलावट परिणाम है.
  7. कॉर्ड धीरे मालिश.
  8. DPBS में सेते कॉर्ड (hemostats सुई, सिरिंज और संलग्न के साथ) 37 ° C 15 मिनट के लिए.
  9. जबकि incubating, 2 एन डी कॉर्ड के साथ 1-8 कदम जारी है.
  10. ऊष्मायन के बाद, कॉर्ड ले बीकर के बाहर और जबकि 50ml ट्यूब पर कॉर्ड पकड़े नीचे दबाना ऊपर अंत में कटौती ट्यूब में सब कुछ इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें.. कॉर्ड के माध्यम से शेष collagenase पुश करने के लिए, तो 20cc सिरिंज देते हैं और मध्यम दबाव के साथ के माध्यम से हैंक्स धक्का.
  11. यदि कोई चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की जरूरत है, इस समय गर्भनाल त्यागें. अन्यथा, एक दूसरे 50ml ट्यूब में 37 ~ 5ml collagenase और सेते के साथ एक ही गर्भनाल जगह ° 30-60 मिनट के लिए सी.
  12. ट्यूब रखें जब तक सभी डोरियों कर रहे हैं.
  13. ~ 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर ट्यूबों स्पिन .
  14. Aspirate (~ 1-2 एमएल के लिए छोड़कर) सतह पर तैरनेवाला T25 एक में 5mls PHEC में गोली + और ​​प्लेट Resuspend.
  15. 37 में डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2 रातोंरात सेते हैं .
  16. अगले दिन सतह पर तैरनेवाला हटाने और नए मीडिया के साथ बदलें. अगर वहाँ कई लाल रक्त कोशिकाओं रहे हैं, एक बार धोने M199 के साथ, तो PHEC + जोड़ने. के रूप में हमेशा की तरह incubating जब तक थाली मिला हुआ है (1-4 दिनों) जारी रखें. एक gelatinized T75 में भाजित.
  17. T75 एक बार मिला हुआ है और तीन T75s में विभाजित है,. फ्लास्क प्रति दो शीशियों रुक.

नोट: Endothelial कोशिकाओं (unactivated) एक cobblestone भूमिका है. Endothelial कोशिकाओं अलगाव के बाद कभी कभी सही (लंबे और नुकीले) सक्रिय है, के एक जोड़े के बाद गुजरता है वे आम तौर पर एक unactive राज्य में लौटने.

सफाई

  1. बहुत ध्यान से, sharps कंटेनर में सुइयों के निपटान.
  2. बड़ा biohazard कंटेनर में सीरिंज की फेकें.
  3. छोटे biohazard बैग में सभी ऊतक रखो. बंद बैग और -20 पर फ्रीज जलाए जाने तक °.
  4. Virucide में कम से कम 10 मिनट के लिए सभी उपकरणों लेना.
  5. ऊष्मायन मीडिया जोड़ें / ब्लीच बीकर बर्बाद. चलो कम से कम 10 मिनट के लिए बैठते हैं.
  6. Biohazard बेकार में बेंच पैड त्यागें.
  7. नीचे और beakers, बेंच शीर्ष और vircide के साथ पानी के स्नान ढक्कन के अंदर और बाहर स्प्रे. 10 मिनट बैठते हैं, तो पोछ लो.
  8. कुल्ला गर्म पानी के साथ beakers और उपकरणों और रैक पर लटका करने के लिए सूखी (बंद यंत्र दाग ताकि वे जंग नहीं है).
  9. सिंक के नीचे decontaminated अपशिष्ट के निपटान.
  10. फ्रिज अप्रयुक्त मीडिया लौटें.
  11. Biohazard बेकार में दस्ताने को फेंक.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Collagenase 10ml per cord, warmed to 37°C
Tissue culture flasks T75, one per cord.
Hanks medium
scissors sterile
beaker sterile
50 ml tubes

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Comments

10 Comments

  1. may you tell me wath kind of collagenase do you use? thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 16, 2008 - 5:47 AM
  2. hi   i have been using dispase to isolate cells. iam succeeding in getting the cells but they are not spreading properly . even after two days iam not able to see  the typical cobble stone appearance. can you help.  Rathna  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 1, 2008 - 11:25 AM
  3. hallo,can you tell me what's the  PHEC+ ?thank you !

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 6:27 AM
  4. Hi, do you have any idea how many cells I can get from a 90% confluent flask (²5 or 75 qcm)? Many thanks in advance, Karin

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2009 - 8:06 AM
  5. From my experience working with HUVEC, a confluent T²5 flask has about 400,000 to 600,000 million cells while a confluent T75 flask has approximately ²-4 millions cells. From this, you can probably roughly deduce how many cells are in a 90% confluent T²5/T75 flask. I hope this help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2009 - 5:45 AM
  6. hi
    how to i prepare collagenase for HUVEC isolation

    Reply
    Posted by: swati s.
    October 22, 2009 - 1:45 PM
  7. Hi,

    I was a synthetic organic chemist and am trying to conduct a bio-organic project. I will be very thankful if you would share some info with me about how to lysate the HUVECs.

    Ge

    Reply
    Posted by: Ge Z.
    January 11, 2010 - 6:56 PM
  8. To answer Ge's question, our lab lysate the HUVEC by adding lysate buffer 1x either in DPBS or water.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 2:54 PM
  9. Thank you so much for the answer. May I have more info regarding the components of your lysate buffer and at what condition do you lysate HUVECs?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 3:09 PM
  10. hi,

    Very Intresting way, but I wonder how many passages they can be usefull?
    Is there any difference between commercially available ones and freshly isolated ones(these ones)?
    Thanks in advance:-)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 3, 2012 - 11:57 AM

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