MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS) 1, 2. De ultra-dunne laag methode betreft de productie van een substraatlaag van matrix kristallen (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic zuur) op het monster plaat, die dienst doet als een seeding grond voor verdere kristallisatie van een matrix / analyt mengsel. Voordelen van de ultra-dunne laag methode ten opzichte van andere sample depositie benaderingen (bijv. gedroogde druppel) zijn die het biedt (i) een grotere tolerantie voor verontreinigingen zoals zouten en wasmiddelen, (ii) een betere resolutie, en (iii) hogere ruimtelijke uniformiteit. Deze methode is vooral handig voor de nauwkeurige bepaling van de massa van eiwitten. Het protocol werd in eerste instantie ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de analyse van membraaneiwitten en worden gebruikt om met succes te analyseren ion kanalen, metaboliet vervoerders, en receptoren, die tussen 2 en 12 transmembraan-domeinen 2. Sinds de oorspronkelijke publicatie, is het ook aangetoond dat het ook nuttig zijn voor de analyse van oplosbare eiwitten. Inderdaad, we hebben het gebruikt voor een groot aantal eiwitten met een breed scala aan eigenschappen, waaronder die met moleculaire massa's zo hoog als 380 kDa 3. Het is op dit moment onze methode van keuze voor de moleculaire massa analyse van alle eiwitten. De beschreven procedure een constant hoge kwaliteit spectra, en het is gevoelig, robuust en eenvoudig te implementeren.

Protocol

Het is zeer belangrijk voor poeder-handschoenen te dragen tijdens de voorbereiding van de dunne laag.

Reiniging van het monster plaat

  1. Gebruik een roestvrij staal of goud MALDI sample plaat.
  2. Wassen met MeOH en veeg voorzichtig met een Kimwipe. Niet wrijven of het oppervlak scrub met de Kimwipe, om te voorkomen krassen op het oppervlak.
  3. Wassen met H 2 O en veeg voorzichtig met een Kimwipe.
  4. Wassen met MeOH en veeg voorzichtig met een Kimwipe.
  5. Indien nodig, herhaal MeOH / H 2 O / MeOH reinigingscyclus, altijd eindigend met MeOH.
  6. Zorg ervoor dat er geen spook vlekken of residu dat resteert op de plaat. Als er spook plekken, spoel de plaat met gedeïoniseerd water, terwijl het oppervlak te wrijven met de gehandschoende hand (Wrijf niet met Kimwipes). Herhaal de MeOH / H 2 O / MeOH reinigingscyclus.
  7. Gebruik de plaat onmiddellijk na het wassen.

Voorbereiding van de dunne laag substraat-oplossing

  1. Meng 1 deel van verzadigde 4-HCCA (2 delen ACN, een deel water, en 0,1% TFA finale) en 3 delen isopropanol.

    Opmerking: De dunne laag substraat oplossing is zeer stabiel, en kan bij kamertemperatuur bewaard worden in het donker voor een jaar. Het kan ook worden opgeslagen bij 4 ° C.

Het maken van de dunne laag substraat

  1. Van toepassing zijn 20-50μL van de dunne laag substraat oplossing op de linker-midden van de plaat, en verspreid dit met de zijkant van een pipet tip. Vegen in een richting.
  2. Als de oplossing droogt, het organische oplosmiddel verdampt heel snel, met achterlating van minuut druppels water op het oppervlak van de plaat. Op dit punt, wikkel je wijsvinger met een laag van Kimwipe en aanvankelijk voorzichtig vlek het oppervlak van de plaat mee.
  3. Wanneer het oppervlak is bevrijd van waterdruppels, veeg de hele plaat met uni-directionele bewegingen vegen met behulp van een Kimwipe.

    Opmerking: Als de oplossing niet genoeg verspreid over het plaatoppervlak, verhoging van de ACN samenstelling en recreëren de dunne laag. Enkele parameters die van invloed kunnen de verspreiding van de oplossing zijn luchtvochtigheid en temperatuur.

    Let op: Met gouden platen, de laag meestal weergegeven als een geelachtige reflectie, afhankelijk van de kijk-en lichte hoeken. Met stalen platen, alleen de rand van de laag is normaal zichtbaar.

  4. Maak de randen van de plaat met een frisse Kimwipe voordat u hem in de plaat houder matrix te voorkomen dat het besmetten van het instrument.

De voorbereiding van de matrix-oplossing

  1. Verzadigde 4-HCCA in FWI (3 delen mierenzuur, 1 deel water, 2 delen isopropanol) wordt aanbevolen voor de analyse van zowel de membraan en oplosbare eiwitten. Het kan ook gebruikt worden in bijzondere gevallen voor de analyse van zeer grote hydrofobe peptiden (M> 4000 u). Zorg ervoor dat de matrix-oplossing wordt gebruikt voor het spotten van de eiwitten niet ~ 50% organisch gehalte overschrijden, omdat het volledig oplossen van de dunne laag substraat, het verslaan van de voordelen van de methode.

Test van de dunne laag substraat

  1. Spot 0.5μL van de matrix-oplossing op de plaat. Een witte neerslag zal verschijnen op het grensvlak tussen de dunne laag en de druppel. Wanneer deze laag de onderkant van de druppel volledig dekt, meestal binnen 10-15 seconden, zuigen de overtollige vloeistof met een vacuüm lijn. Als het langer duurt dan 30 seconden voor de neerslag te vormen, is het een indicatie dat er mogelijk een probleem met de dunne laag substraat en / of de matrix oplossing.

Voorbeeld applicatie

  1. De analyt concentratie in het begin oplossingen moeten worden binnen de 10 en 1000μM.
  2. Verdun de analyt-oplossing in matrix-oplossing tot een uiteindelijke analietconcentratie tussen 0,2 en 2μM. Bijvoorbeeld, te beginnen met 1μl van het monster en de 9μl van matrix oplossing.

    Opmerking: Zorg ervoor dat de matrix is goed als verzadigd in de uiteindelijke oplossing, anders zult u Los het dunne laag substraat.

    Let op: Analyte concentraties die nodig om fatsoenlijk signalen te verkrijgen, zijn sterk afhankelijk van de oplossing de complexiteit en de samenstelling (bijvoorbeeld, contaminanten) en analyt ionizability.

    Opmerking: Als een single-stap verdunning geen goede resultaten opleveren, moet je nog een verdunning stap proberen. Hoewel de contra-intuïtieve, zeer geconcentreerde analyt oplossingen zelden tot goede spectra.

    Let op: Membraaneiwitten vereisen doorgaans een grotere verdunningen.

  3. Spot 0.5μl van het monster / matrix mengsel op het bord. Een witte neerslag zal vormen op het grensvlak tussen de dunne laag en de druppel. Deze neerslag wordt het cocrystallization van de matrix en analyt. Wanneer deze laag de onderkant van de druppel volledig dekt, usubondgenoot binnen 10-15 seconden, zuigen de overtollige vloeistof met een vacuüm lijn. Als het langer duurt dan 30 seconden voor de neerslag te vormen, kan het een indicatie van een verontreiniging aanwezig is, dat voorkomt de kristallisatie, of je analiet is te geconcentreerd.

Kalibrant toepassing

  1. Bereid de kalibrant / matrix mengsel in een vergelijkbare manier met een laatste kalibratieoplossing concentratie tussen 0,1-0.5μM.
  2. Spot 0.5μl kalibrant / matrix mengsel op het bord in de nabijheid van het monster plekken. Deze fysieke nabijheid wordt gebruikt in een pseudo-interne kalibratie procedure waarin de plaat is uit de steekproef plek verplaatst naar de kalibratieoplossing plek tijdens afnemen van het monster, een paar shots van de laser kalibranten toe te voegen aan het spectrum. Deze aanpak staat garant voor een hogere nauwkeurigheid van massa's kalibratie dan externe kalibratie alleen.

Wasstap

  1. Was elke spot met ongeveer 2μL van een ijskoude 0,1% waterige oplossing TFA. Aspireren overtollige vloeistof met een stofzuiger lijn.

Overname van massaspectra

  1. U bent nu klaar om de massa spectra te verkrijgen. Als u de FWI matrix-oplossing, moet u uw verwerven spectra zo snel mogelijk om onomkeerbare wijziging te voorkomen dat de analyt, zoals formylering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics