MALDIサンプル調製:超薄層法

Biology

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Summary

このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI - MS)でペプチドやタンパク質を解析するための超薄型行列/分析物層の準備を示しています。

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Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

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Abstract

このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI - MS)1、2によってペプチドやタンパク質を解析するための超薄型行列/分析物層の準備を示しています。超薄層のメソッドは、行列/分析物混合物のその後の結晶化のための播種の地盤となるサンプルプレート、上のマトリックスの結晶の基材層(α-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸)の生産を含む。他のサンプルの成膜方法に比べて超薄層法の利点(例えば乾燥液滴)は、(i)は、提供されているような塩や界面活性剤などの不純物、(ⅱ)優れた分解能、及び(iii)より高い空間的均一性に寛容です。このメソッドは、タンパク質の精密質量測定のために特に便利です。プロトコルは、最初に開発され、最適化された膜タンパク質の分析のためにして正常に2と12の膜貫通ドメイン2の間に含まれている、イオンチャネル、代謝産物輸送体、および受容体を分析するために使用されました。初版発行以来、それはまた、可溶性タンパク質の解析にも同様に有用であることが示された。実際、我々は、380 kDaの高い3の分子量を有するものを含む広範囲の特性を、有するタンパク質の多数のためにそれを使用している。それは現在、全てのタンパク質の分子質量分析のための選択の手法です。説明する手順は、一貫して高品質のスペクトルを生成し、それは、敏感な、堅牢で、導入が容易です。

Protocol

それは、薄層の調製の間にパウダーフリーの手袋を着用することは非常に重要です。

サンプルプレートの清掃

  1. ステンレス鋼や金MALDIサンプルプレートを使用してください。
  2. MeOHで洗浄し、キムワイプで軽く拭いてください。表面を傷つけないように、キムワイプで表面を擦ったり、こすらないでください。
  3. H 2 Oで洗浄し、キムワイプで軽く拭いてください。
  4. MeOHで洗浄し、キムワイプで軽く拭いてください。
  5. 必要に応じて、常にMeOHで終わる、メタノール/ H 2 O / MeOHのクリーニングサイクルを繰り返します。
  6. ないゴーストスポットまたはプレート上の残渣がないことを確認してください。幽霊スポットがある場合はあなたの手袋をはめた手(キムワイプでこすったりしないで下さい)で表面をこすっている間、脱イオン水で皿をすすぐ。のMeOH / H 2 O / MeOHのクリーニングサイクルを繰り返します。
  7. 洗浄後すぐにプレートを使用してください。

薄層の基質溶液の調製

  1. イソプロパノール飽和4 - HCCA(2部ACN、1部の水、および0.1%の最終TFA)と3部の1部を混在させること。

    注:薄層の基質溶液は非常に安定しており、年間の暗所で室温で保管することができます。また、4℃で保存することができる

薄層基板を作る

  1. プレートの左中央の上に薄層の基質溶液を20 -50μLを適用し、ピペットチップの側に広がる。一方向にスイープ。
  2. ソリューションの乾燥、有機溶媒が蒸発するなど、非常に迅速に、プレートの表面に水の微小水滴を残して。この時点で、キムワイプのプライと最初は優しく、それと板の表面にしみで人差し指を包む。
  3. 表面を水滴から解放されると、キムワイプを用いて単方向の抜本的な運動とプレート全体を拭いてください。

    注:ソリューションは、プレートの表面全体に十分に広がっていない場合は、ACNの組成を増加させ、薄層を再現。ソリューションの広がりに影響を及ぼす可能性のあるいくつかのパラメータは、周囲の湿度や温度などがあります。

    注:ゴールドプレートを使用すると、レイヤーが通常観察と光の角度によって、黄色がかった反射として表示されます。鋼板で、レイヤーのエッジのみが正常に表示されます。

  4. 楽器を汚染から行列を防ぐために、プレートホルダーに配置する前に新鮮なキムワイプでプレートのエッジをきれいにします。

マトリックス溶液の調製

  1. 4 - HCCA飽和 FWIの(ギ酸3部、1部の水、2部イソプロパノール)膜と可溶性タンパク質の両方の分析のために推奨されます。それは非常に疎水性の大きなペプチド(M> 4000 U)の分析のために特殊な場合にも使用される可能性があります。それは完全に法の利点を破り、薄層基板を溶解するようにタンパク質をスポットで使用されるマトリックス溶液は、〜50%有機コンテンツを超えていないことを確認してください。

薄層基板のテスト

  1. プレート上にマトリックス溶液のスポット0.5μL。白っぽい沈殿物が薄層と液滴間のインターフェイスで表示されます。この層は通常10〜15秒以内に、完全に液滴の底部をカバーするとき、真空ラインに余分な液体を吸引除去する。それはフォームへの沈殿のための30秒より長くかかる場合、それは、薄層基板及び/またはマトリックス溶液に問題があるかもしれないことを示しています。

サンプルアプリケーション

  1. 出発溶液中の分析物の濃度は10および1000μmの範囲内とする。
  2. 0.2と2μmの間で最終的な分析対象成分の濃度のマトリックス溶液中の分析ソリューションを希釈する。たとえば、サンプルとマトリックス溶液の9μl1μlので始まります。

    注:行列は最終的な解決策で飽和されているに近いことを確認してください、さもないと薄層の基板を再溶解される。

    注:まともな信号を得るために必要な分析物の濃度は、ソリューションの複雑さと組成物(例えば、汚染物質)と検体ionizabilityに大きく依存している。

    注:シングルステップ希釈が良い結果が得られない場合、別の希釈のステップを試してみてください。直感に反するが、高濃度の分析対象のソリューションはめったに良いスペクトルを生成しません。

    :膜タンパク質は、通常、大規模な希釈を必要とする。

  3. プレート上のサンプル/マトリックス混合物の0.5μlスポット。白っぽい沈殿物が薄層と液滴間の界面に形成されます。この沈殿物は、マトリックスと分析物のcocrystallizationです。この層は完全に液滴の底部をカバーする、有珠10〜15秒内で同盟国は、真空ラインに余分な液体を吸引除去する。それはフォームへの沈殿のために30秒以上かかる場合、それは結晶化を防止したり、分析対象があまりにも集中している汚染物質が存在、している可能性があります。

較正アプリケーション

  1. 0.1 -0.5μmの間の最終的な較正濃度と同様の方法で較正/マトリックス混合物を準備します。
  2. サンプルスポットのすぐ近くでプレート上にスポット0.5μlの較正/マトリックス混合物。この物理的な近接性は、プレートがスペクトルにcalibrantsのいくつかのレーザーショットを追加するには、サンプル収集中に較正スポットへのサンプルスポットから移動させる擬似内部キャリブレーションの手順で使用されます。このアプローチは、唯一の外部キャリブレーションよりも高い質量精度のキャリブレーションを保証します。

洗浄工程

  1. 氷冷0.1%水溶液TFA溶液の約2μlので各スポットを洗う。真空ラインに余分な液体を吸引除去する。

質量スペクトルの取得

  1. これで、マススペクトルを取得する準備が整いました。あなたがFWIマトリックス溶液を使用する場合には、ホルミル化などの分析物に不可逆的な改変を防ぐために、できるだけ早くあなたのスペクトルを取得する必要があります。

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References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

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