Drug Delivery systémique et locale pour traiter les maladies du système nerveux central dans les modèles rongeurs

Neuroscience
 

Summary

Approfondie des essais précliniques de médicaments qui agissent sur le système nerveux central implique souvent évaluer et comparer la biodistribution de drogue en association avec des parcours spécifiques de l'administration. Ici, trois méthodes couramment utilisées de l'administration systémique (intraveineuse, intrapéritonéale et orale) ainsi qu'une méthode pour la distribution locale (convection-enhanced delivery) est démontrée chez la souris.

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Serwer, L., Hashizume, R., Ozawa, T., James, C. D. Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models. J. Vis. Exp. (42), e1992, doi:10.3791/1992 (2010).

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Abstract

Approfondie des essais précliniques du système nerveux central (SNC) thérapeutique comprend un examen des voies d'administration et de biodistribution agent dans l'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Entre les deux grandes catégories de l'administration, locaux vs systémique, les approches systémiques de livraison sont souvent préféré en raison de sa facilité d'administration. Cependant, l'administration systémique peut entraîner une concentration sous-optimale des médicaments étant réalisé dans le SNC, et conduire à des conclusions erronées quant à l'efficacité agent. Les méthodes locales de délivrance de médicaments sont plus envahissantes, mais peut-être nécessaire pour atteindre des niveaux thérapeutiques du SNC médicaments. Ici, nous démontrons une bonne technique de trois voies d'administration systémique de médicaments: injection intraveineuse, injection intrapéritonéale, par gavage oral. En outre, nous montrons une méthode pour la livraison locale dans le cerveau: convection-enhanced delivery (CED). L'utilisation de composés à marquage fluorescent est inclus pour l'imagerie in vivo et la vérification de bonne drug administration. Les méthodes sont présentées à l'aide de modèles murins, mais peut facilement être adapté pour une utilisation chez les rats.

Protocol

1. Modes de livraison systémiques

Bien que l'administration systémique de médicaments n'est pas l'approche la plus efficace pour atteindre des concentrations élevées en médicaments dans le SNC, les livraisons systémiques sont pratiques et bien accepté par les patients. Ici, nous allons montrer les procédures correctes pour trois approches couramment utilisés administration systémique: l'injection intraveineuse, injection intrapéritonéale et orale par gavage.

A. intraveineuse (injection dans la veine caudale)

  1. Avant de commencer la procédure, le poids corporel de chaque souris doivent être enregistrées. Comme pour toutes les études précliniques, le poids corporel doivent être surveillés régulièrement (deux fois par semaine ou plus) pour évaluer la toxicité potentielle des médicaments. Pas plus de 1% du poids de la souris dans le volume doit être injecté en une seule fois. Par exemple, pas plus de 0,2 ml de liquide doit être injecté dans une souris de 20 g. Tous les fluides injectés par voie intraveineuse doivent être stérilisés selon une méthode appropriée.
  2. La souris doit être réchauffé pendant 5-10 minutes en utilisant soit un coussin chauffant ou une lampe chauffante pour dilater la veine de la queue. Si vous utilisez une lampe chauffante, contrôler la souris à tout moment pour éviter l'hyperthermie.
  3. La souris est transférée à un dispositif de retenue, qui retient la souris tout en permettant l'accès à la veine de la queue (voir vidéo). Dans la queue de la souris, il ya quatre vaisseaux visibles: les vaisseaux sur les côtés dorsales et latérales sont des veines, et le navire sur la face ventrale est une artère. Pour accéder à la veine de la queue, la queue de la souris est maintenu au point le plus distal, et une rotation de 90 degrés, de sorte que la veine est orienté vers le haut. Le site d'injection est nettoyée avec un tampon imbibé d'alcool et une seringue à insuline 28g est insérée, le côté biseauté le haut, dans la veine (voir la vidéo). Si l'aiguille est correctement placée dans la veine, il doit se déplacer librement et sans pression. Injecter lentement le médicament avec une pression uniforme sur les 5-10 secondes. Si une ampoule apparaît sur la queue, arrêter l'injection, car cela indique que l'aiguille n'est pas longueer dans la veine.
  4. Après l'injection, appliquer une légère pression au site d'injection jusqu'à ce que le saignement cesse. Cela prend normalement 30-60 secondes. Surveiller la souris pendant 5-10 minutes après l'injection pour s'assurer qu'il n'ya pas de saignement.

B. Injection intrapéritonéale

  1. Avant de commencer l'injection, le médicament doit être chargée dans une seringue attachée à une aiguille 28g. Assurez-vous qu'il ya un espace dans la seringue pour tirer sur le piston avant l'injection (par exemple, si l'injection de 200 pl, assurez-vous que la capacité de la seringue est 300μL ou plus).
  2. Débranchez la souris de la cage par la queue et placez-le sur une surface texturée, de sorte que la souris a quelque chose à saisir. Un couvercle de la cage est généralement suffisant. Laissez la souris pour étirer son corps et puis en utilisant votre main non dominante, saisir la peau sur le dos de la souris, en prenant soin de pincer la peau légèrement autant que possible entre le pouce et l'index et le majeur(Voir la vidéo). Activer la souris sur l'abdomen de sorte que la souris est tournée vers le haut. Si la souris peut se déplacer librement sa tête, relâcher la poignée et essayez à nouveau, de façon à éviter d'être piqué lors de l'injection.
  3. Avec votre main dominante, prenez la seringue et insérer l'aiguille à un angle de 30 degrés dans le quadrant inférieur gauche de la souris (voir la vidéo). Tenant la souris légèrement inversée aidera à faire avancer les organes en dehors du site d'injection. Pour s'assurer que l'aiguille est dans l'espace intra-péritonéale, tirez sur le piston de la seringue. Si du liquide ou du sang apparaît dans la seringue, puis l'aiguille n'est pas dans l'espace intra-péritonéale et devrait être supprimée. Si aucun fluide est aspiré dans la seringue, puis injecter contenu de la seringue avec une pression encore plus 5.1 secondes, puis relâchez la souris.
  4. Surveiller la souris pour 5-10 minutes après l'injection de sorte que la souris retourne à une activité normale.

C. gavage oral

  1. Before début de l'injection, enregistrer le poids de la souris. Le volume maximum pouvant être délivré par gavage oral est de 10 ml par kg de poids corporel. Par exemple, le volume maximal pour une souris 20g serait 200 pl. Tentative d'injecter des volumes plus importants peuvent entraîner des reflux, ce qui entraînera l'administration de médicaments incomplète. S'il est nécessaire d'administrer des volumes plus importants que ceux indiqués ci-dessus, un maximum de trois doses peuvent être administrées en 24 heures.
  2. Pour éviter de percer l'œsophage, il est important de mesurer la longueur de l'aiguille de gavage pour chaque souris. Tenir une extrémité 18g balle gavage aiguille courbe à la dernière côte de la souris, puis marquez la longueur à l'extrémité de la tête de la souris à l'aide d'un marqueur indélébile (voir la vidéo). Pendant le gavage, cette marque sera un point d'arrêt que vous insérez l'aiguille dans la bouche de la souris.
  3. Restreindre la souris en utilisant la poignée comme pour une injection intrapéritonéale. Insérez l'aiguille gavage dans la bouche, sur la langue, et avance l'aiguille dans le pharynx. Ne pas insérer l'aiguille passé la marque d'arrêt. L'aiguille doit procéder en douceur, sans aucune pression (voir la vidéo). Si vous rencontrez pression, arrêter et retirer l'aiguille pour éviter l'injection de fluide dans les poumons.
  4. Avec l'aiguille en place, appuyer sur le piston au-dessus de 1-5 secondes, puis retirez l'aiguille sous le même angle qu'il a été inséré. Surveiller la souris pendant 5-10 minutes, en accordant une attention particulière aux signes de difficultés respiratoires qui peuvent indiquer que le fluide a pénétré dans les poumons.

2. Livraison locale

Aiguë convection-enhanced delivery

A. Construction de la sonde

Une canule reflux résistant DEC pour les rongeurs n'est pas encore disponible dans le commerce. Ici, nous allons démontrer une méthode pour la construction canule qui a été adapté à partir d'une première méthode décrite par Krauze et al (Krauze 2005).

  • La canule comporte trois parties (
  • Pour obtenir de l'aiguille métallique rigide, utiliser une flamme nue pour faire fondre le plastique sur un cathéter Surflo IV (24g stylet) et l'aide de pinces retirer l'aiguille métallique. Le reste du cathéter peut être mis au rebut. Couper une longueur de tube de silice (DO 0.163mm), légèrement plus longue que l'aiguille métallique, à l'aide d'une lame de rasoir simple arête. Rôle du tube de silice dans une petite goutte de base de cyanoacrylate colle à action rapide (par exemple, Krazy Glue), en prenant soin de ne pas mettre de la colle sur les extrémités du tube. Insérer le tube de silice dans l'aiguille métallique et laisser sécher pendant 5 minutes.
  • Une fois sec, le tube en silice doit être solidement fixé à l'aiguille. Les extrémités de la silice doit être coupée de sorte que 2 mm de tube de silice saillie de l'extrémité pointue de l'aiguille fait saillie de 3 mm et tube de silice de la partie plate (voir vidéo).
  • Coupez une section de tube en téflon 20 cm de longueur. Roulez l'aiguille métallique dans une petite goutte de colle, encore une fois en prenant soin de ne pas mettre de colle sur les extrémités du tube en silice car cela va obstruer la canule. Insérez l'aiguille dans le tube en Téflon à une profondeur de 1 cm. Laisser sécher pendant 1 minute. À l'aide d'un pistolet à colle, appliquer une goutte de colle à chaud à la jonction entre l'aiguille métallique et le tube en Téflon (voir vidéo). Assurez-vous que le joint est entièrement recouvert de tous les côtés et laisser sécher pendant au moins 1 heure. Canules peuvent être faites jusqu'à une semaine à l'avance et conservé à température ambiante.

Procédure de perfusion B.

  • Pour préparer la zone chirurgicale, toutes les surfaces doivent être pulvérisées avec un désinfectant comme une solution de chlorhexidine à 2%. Gants chirurgicaux stériles doivent être portés lors de la procédure. Les surfaces sont ensuite recouverts de rideaux absorbants. Les fournitures suivantes doivent être placés dans la zone chirurgicale:
    • Coussin chauffant pour maintenir le corps de la souris temRature
    • Deux petites boîtes de Pétri: l'un contenant du peroxyde d'hydrogène à 3%, et une base de chlorhexidine à 2%
    • Gaze stérile et des cotons-tiges
    • Scalpels jetables stériles (Numéro 21)
    • Aiguilles stériles 22g
    • Souris stéréotaxique cadre
    • Contrôlée pompe à seringue taux
    • Autoclavé la peau de souris agrafeuse, agrafes et ôte-agrafes
  • Pour mettre en place la canule DEC, fixer une seringue de 1 ml au tube Téflon l'aide d'un jeu d'adaptateurs de seringue en plastique. La canule doit être collée sur le cadre stéréotaxique de sorte qu'il soit perpendiculaire à la surface opératoire (voir vidéo). Pour désinfecter la canule, remplir la seringue de 1 ml d'éthanol à 70% et appuyer sur le piston pour exécuter l'éthanol à travers la canule. Répétez ce processus en utilisant une solution saline stérile, et vérifier s'il ya des fuites autour des articulations canule. Pour désinfecter l'extérieur de la canule, essuyer doucement avec un éthanol à 70% essuyer.
  • Remplissez la canule avec une solution saline stérileet ensuite tirer sur la seringue de sorte que la petite bulle d'air est aspiré dans la canule. Cette bulle d'air se sépare de la solution intraveineuse de la solution saline dans la canule. Puis, backloading votre solution intraveineuse (voir la vidéo). Relier la seringue à la seringue et amorcer la pompe en cours d'exécution par la canule brièvement.
  • Sedate la souris en utilisant un anesthésique injecté et préparer la peau en tamponnant plusieurs fois (pendant 5-10 secondes) avec un morceau de gaze stérile trempée dans la solution de chlorhexidine à 2%. Pommade ophtalmique doit être appliquée sur la souris pour maintenir une humidité suffisante au cours de la procédure. L'aide d'un scalpel stérile, créer une incision sagittale le long du centre du crâne, environ 1,5 cm de long (voir la vidéo). La surface du crâne est ensuite nettoyé à l'aide d'un coton-tige imbibé d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 3%. Prenez soin d'éviter de tomber peroxyde d'hydrogène dans les yeux de la souris. Les lignes de suture du crâne devrait être évident à ce point: si elles ne sont pas visibles, doucement tamponner le crâne avec une fresh coton-tige imbibé d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 3%.
  • Identifier le bregma (Figure 2), puis de mesurer 2 mm à la partie postérieure droite et 1mm de cette structure pour localiser le site de perfusion. Utilisation de l'aiguille stérile 22g, doucement créer un trou dans le crâne à ce point en tournant l'aiguille contre le crâne (voir la vidéo). Éviter de forcer l'aiguille vers le bas contre le crâne.
  • À ce stade, la souris doit être placée dans le cadre stéréotaxique et commencer à recevoir par inhalation anesthésie (voir la vidéo). Administrer l'anesthésique à un niveau faible (1%), et surveiller attentivement la souris pour les changements de la fréquence respiratoire, le réglage de l'anesthésie en conséquence.
  • Placer la canule sur le trou du crâne puis abaissez 3 mm sous la surface du crâne. Commencer la perfusion, en utilisant les taux et les durées suivantes:
    0,1 pl / min pendant 5 minutes "Volume
    0,2 ul / min pendant 5 minutes
    0,5 ul / min pendant 5 minutes
    0,8 ul / min pendant 7,5 minutes
    OFF pendant 1 minute
  • A la fin de la perfusion, retirer lentement la canule et nettoyer le crâne avec du peroxyde d'hydrogène à 3%. Appliquez la cire à os stérile pour le trou (voir la vidéo). En utilisant des pinces, tirer la peau en même temps sur le crâne et l'agrafer pour fermer. La buprénorphine doit être administré pour soulager la douleur post-opératoire.
  • Surveiller la souris en post-opératoire jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience et de mobilité. En raison de la longueur de la procédure, il peut prendre jusqu'à une heure pour la souris de retrouver une activité complète. Au cours de cet endroit fois que la cage de la souris sur un coussin chauffant pour éviter l'hypothermie, et ne pas abriter la souris récupérer avec d'autres souris actives.
  • Agrafes cutanées devrait être retiranted une semaine après la chirurgie.

C. L'imagerie in vivo

Infusate marqués à la fluorescence peut être imagé suivant l'administration de DEC, et peut être surveillés pour des changements dans l'intensité du signal ainsi que l'emplacement du signal. En règle générale, il est préférable d'attendre 2-3 heures après la perfusion de l'image, de façon à permettre la souris pour récupérer à partir de la perfusion.

  • Pour l'anesthésie lors de l'imagerie, utilisez un bas niveau d'une inhalation anesthésique. La position de la souris, jusqu'à la face dorsale, dans une station d'imagerie (par exemple, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). L'utilisation d'un réglage de filtre approprié pour le fluor qui est imagée, acquérir une image. Pour DEC, une perfusion de succès devrait montrer plus de la matière dans le cerveau près du site de perfusion (figure 3).

3. Les résultats représentatifs

Un manque de réaction indésirable à l'administration de la thérapie est un indicateur important de successful injection. Par exemple, suite à l'injection dans la veine caudale devrait y avoir aucun changement dans l'apparence (par exemple, taille, couleur) de la queue. Une bulle ou boursouflure après l'injection veine de la queue indique sous-cutanée plutôt que par voie intraveineuse, l'administration du traitement. Pour les injections intra-péritonéales, une bosse sur la peau ou une décoloration de l'abdomen peut indiquer injection sous-cutanée ou des dommages aux structures internes. En gavage oral, une souris avec une respiration difficile ou toux peut indiquer que le fluide a été injecté dans les poumons, plutôt que dans l'estomac.

Pour DEC, la fonction neurologique est importante pour évaluer l'administration d'une thérapie réussie. Une souris qui expose des convulsions ou une hémiparésie peut-être reçu une perfusion inadéquate. Si une solution intraveineuse fluorescent est utilisé, l'imagerie in vivo peuvent être appliquées pour évaluer l'administration de succès (Figure 3). Si la solution intraveineuse n'est pas localisée au site d'injection, la perfusion n'est pas successful.

Figure 1
Figure 1: Canule chirurgicale DEC et Set-up. Les éléments de base de la livraison convection-enhanced chirurgicale set-up sont affichés. Pompe à microperfusion (A) est fixée à la canule de perfusion (B, à un grossissement de haut). Un cadre stéréotaxique (C) est utilisé pour positionner la sonde. Cette image ne comprend pas le chauffage et l'équipement d'anesthésie également utilisé lors de la procédure.

Figure 2
Figure 2: Lignes de souris Crâne de suture. Le site d'injection DEC (étoile rouge) peuvent être localisés en identifiant l'intersection des sutures sagittale et coronale (bregma), puis en mesurant 2mm postérieure latérale et 1 mm du bregma.

Figure 3
Figure 3: Les résultats représentatifs de DEC réussie. Liposomes marquées avec un colorant fluorescent rouge lointain ont été perfusés dans le cerveau de souris par DEC et imagée à la fois in vivo et ex vivo. L'infusion de succès montre un signal fluorescent localisée au site d'injection in vivo (A) et ex vivo (B). Le signal doit être localisé dans l'hémisphère infusé sans fuite dans l'hémisphère controlatéral.

Figure 4
Figure 4: Image représentant de DEC réussie dans le tronc cérébral de rat. Liposomes marqués par fluorescence ont été perfusés dans le tronc cérébral de rat. Chez le rat, autant que 20 pi peut être perfusé. L'épaisseur accrue du crâne chez le rat et la profondeur de l'injection interdit l'imagerie in vivo, mais l'emplacement perfusion correcte n'a pu être vérifiée par imagerie in vivo du cerveau ex disséqués.

Discussion

L'évaluation préclinique de l'efficacité d'un agent thérapeutique doit tenir compte des propriétés pharmacologiques de l'agent et le tissu cible d'intérêt. Bien que les méthodes systémiques de l'administration sont en général plus facile et mieux toléré par les patients, la sélectivité de la barrière hémato-encéphalique nécessite souvent la livraison locale de la thérapie pour le traitement de maladies du SNC. Ici, nous avons démontré une méthode de livraison directe au cerveau: DEC. D'autres formes d'administration locale au cerveau comprennent l'administration directe au liquide céphalo-rachidien, injection d'un bolus intra-tumorale, et l'injection ventriculaire. Pour ces méthodes, diffusibilité thérapeutique est d'une importance capitale, avec une mauvaise diffusion limitant la région de la couverture de quelques millimètres à partir du site d'injection (Jain 1989, Bobo 1994). En revanche, le DEC utilise la pression positive afin d'augmenter la zone de distribution de médicaments (Bobo 1994), tout en permettant le ciblage thérapeutique à neuroanatomique strumages. Dans notre laboratoire, nous avons réussi DEC effectué dans le tronc cérébral ainsi que dans le putamen caudé chez les rongeurs (figure 4).

La capacité de mener des CED dans des modèles de rongeurs est devenu de plus en plus importante en association avec un intérêt croissant pour maximiser l'efficacité thérapeutique dans le traitement de divers types de maladies du SNC. DEC peut être utilisée pour fournir une variété d'agents, y compris les protéines purifiées, les médicaments à petites molécules, et les virus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). La gamme de maladies qui peuvent être traitées avec DEC comprend les cancers du système nerveux central (Yamashita 2007) ainsi que les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (Gill, 2003). Comme la recherche CED continue à se développer, la nécessité pour l'imagerie in vivo de la thérapie administrée CED est même en augmentation. Alors que l'imagerie de fluorescence démontré ici ne serait probablement pas visible à travers le crâne humain, employant d'autres méthodes de co-injection de produits de contraste IRM (Dickinson 2008) suscitent un intérêt pour évaluer l'applicabilité de surveillance infusions chez les patients ayant une maladie du système nerveux central.

Disclosures

Toutes les procédures ont démontré ici ont été approuvés par les soins des animaux UCSF Comité institutionnel et l'utilisation.

Acknowledgments

NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01426
Nous tenons à remercier Raquel Santos pour l'assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Chlorhexidine Fisher Scientific NC9756995 AKA Nolvasan”
20g Needle BD Biosciences 305175
28g Needle (with syringe) Fisher Scientific 22-004-270 AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H312P-4 Store away from light
Cotton Swabs Fisher Scientific 23-400-100 Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive Fisher Scientific NC9592632 AKA Krazy Glue”
Disposable Scalpels Feather Safety Razor Co, Ltd. 2975 No. 21
Gauze Fisher Scientific 22028563 Autoclave before use
Heating Pad Dunlap HP950
I.V. Catheter Fisher Scientific 14-841-20
Infusion Pump BASi MD-1000, MD-1001
Living Image Software Caliper Life Sciences Contact for Quote
Ophthalmic Ointment Cardinal Health 1272830 AKA Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors Upchurch Scientific P-604, P-200NX, P-215X, P-630 Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing Polymicro Technologies 2000020
Skin Stapler, Staples, Remover Stoelting Co. 59020
Stereotaxic Frame Stoelting Co. 51725
Teflon Tubing Upchurch Scientific 1520
Xenogen Lumina Caliper Life Sciences Contact for Quote

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References

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