Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Nanosphären auf Mikrotubuli zu laden, die auf einer mit Kinase beschichteten Oberfläche in Motoren gleiten. Dazu wird zunächst die Oberfläche einer Glasdurchflusszelle mit Kaseinlösung beschichtet. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Kinesin-Motorproteine auf der Oberfläche der Flusszelle zu absorbieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikrotubuli hinzuzufügen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Stepp Haver in Moleküle zu geben, die an die Mikrotubuli binden, und dann die Nanokügelchen hinzuzufügen. Die Nanokügelchen binden sich an die Oberfläche der Flusszelle, wo sie von den Mikrotubuli aufgenommen werden können.

Letztlich kann man mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie beobachten, wie Nanokugeln von Mikrotubuli aufgenommen und über die Oberfläche transportiert werden. Hallo, ich bin Elaine Jen Smith aus dem Labor von Dr. Henry Hess und dem Department of Material Science and Engineering an der University of Florida. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den Inverted Motility Assay.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Verladung von Fracht auf Mikrotubuli und die Bewegung von molekularen Shuttles zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens alle Stammlösungen frisch vor, wie im schriftlichen Teil dieses Videos beschrieben.

Sobald die Stammlösungen hergestellt wurden, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikrotuben, indem Sie 25 Mikroliter Wachstumslösung in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Geben Sie dann 6,25 Mikroliter der Wachstumslösung zu 20 Mikrogramm lyophilisiertem biotinyliertem Tubulin. Wirbeln Sie die Lösung und legen Sie sie 30 Minuten lang in ein Wärmebad bei 37 Grad Celsius, um nach der Inkubation zu polymerisieren, verdünnen Sie die Lösung 100-fach in Taxol-Puffer und ziehen Sie sie vorsichtig vortexen.

Diese Lösung dient der Stabilisierung der Mikrotubuli. Beschriften Sie die Lösung als leer 100 und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Als nächstes verdünnen Sie MT 100 in Anti-Fade-Puffer und kennzeichnen Sie diese Lösung als MT 1000

Bereiten Sie dann die Kinesin-Motoren vor, indem Sie die Kinesinlösung in einem TP-Puffer 20-fach verdünnen. Markieren Sie die Lösung als Kinase in 20 und lagern Sie sie auf Eis. Stellen Sie zum Schluss die Streptavidin- und Nanosphärenlösungen her.

Fügen Sie zuerst Alexa Fluor 5 6 8 markiertes Streptavidin zu einer Konzentration von 100 Nanomolaren in Antifa-Puffer hinzu. Markieren Sie die Lösung als STV 100, verdünnen Sie dann die Nanokügelchen 5.000-fach in Antifa-Puffer und markieren Sie diese Mischung als NS 5.000. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis.

Nach der Lösungsvorbereitung für den Ladungsverladeassay wird eine Durchflusszelle aus einem Deckschieber und einem Glasdeckglas konstruiert, die durch doppelseitiges Klebeband getrennt sind. Kleben Sie zunächst zwei Streifen doppelseitiges Klebeband an die Ränder einer Deckfolie, so dass zwischen den Streifen ein Abstand von etwa einem Zentimeter bleibt. Legen Sie dann ein Deckglas über das Klebeband.

Üben Sie mit der flachen Kante einer Pinzette Druck auf das Deckglas aus, um eine Versiegelung herzustellen. Die konstruierte Durchflusszelle ist etwa zwei Zentimeter lang, einen Zentimeter breit und 100 Mikrometer hoch und hat ein Volumen von etwa 20 Mikrolitern. Um mit der invertierten Assay-Assemblierung zu beginnen.

Platzieren Sie die Spitze der Pipette zwischen dem Deckglas und dem Objektträger. Injizieren Sie dann 0,5 Milligramm pro Milliliter Kaseinlösung in die Durchflusszelle. Diese Beschichtung auf der Durchflusszelle ermöglicht es Kinesin, seine Funktionalität nach der Absorption beizubehalten.

Warten Sie fünf Minuten, bis die Kaseinlösung bedeckt ist. Als nächstes absorbieren Sie Kinesin auf der Durchflusszelle, indem Sie die Kinase in 20 Lösungslösungen einführen, die in die Durchflusszellen eingeführt werden, indem Sie die Spitze der Pipette zwischen dem Deckglas und dem Objektträger platzieren. Dann wird die Lösung von der einen Seite in die Durchflusszelle injiziert, während sie gleichzeitig auf der anderen Seite herausgesaugt wird.

Lassen Sie die Kinase mit Filterpapier fünf Minuten einziehen. Führen Sie anschließend die Mikrotubuli in die Durchflusszelle ein, indem Sie die MT 1000-Lösung in die Durchflusszelle pipettieren. Warten Sie fünf Minuten, bis sich die Mikrotubuli abgesetzt und an die Kinase in Motoren gebunden haben, nachdem die Mikrotuben an die Kinase in Motoren gebunden wurden.

Beschichten Sie die Mikrotubuli mit fluoreszierendem Streptokokken TTR, indem Sie die STV 100-Lösung in die Durchflusszelle einführen. Warten Sie fünf Minuten, bis die Streptokokken-TTR in den Molekülen an die Mikrotubuli gebunden ist. Waschen Sie die überschüssige Streptokokken-TTR aus, indem Sie drei 30-Mikroliter-Waschgänge mit Antifa-Lösung in die Durchflusszelle einführen.

Führen Sie abschließend die biotinylierten Polystyrol-Fluorescein-Nanosphären ein, indem Sie die NS 5.000-Lösung in die Durchflusszelle pipettieren. Die Oberfläche nimmt stationär auf. Nanokügelchen kollidieren mit den sich bewegenden Mikrotubuli und laden sich auf sie.

In diesem Experiment wird ein Eclipse TE 2000 U Fluoreszenzmikroskop verwendet, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv und einer X-Stelle, einer 20er Lampe und einer Exon-E-M-C-C-D-Kamera ausgestattet ist. Tragen Sie zunächst einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv auf. Anschließend montieren Sie die Durchflusszelle mit dem trixy Filterwürfel auf dem Mikroskoptisch.

Bringen Sie die Mikrotubuli in den Fokus und wechseln Sie dann zum fitzy Filterwürfel, um die Nanokügelchen zu betrachten. Öffnen Sie als Nächstes das Exon-Programm und stellen Sie den Erfassungsmodus auf kinetisch ein. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, eine kinetische Serienlänge von 20 und eine kinetische Zykluszeit von sechs Sekunden.

Schalten Sie das Mikroskop vom Okular auf die Kamera um und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Verwenden Sie für die ersten vier Bilder den Trixi-Würfel, um die Mikrotubuli abzubilden. Wechseln Sie für die nächsten 12 Bilder zum Fitz-Filterwürfel, um Bilder der Nanokugeln aufzunehmen.

Wechseln Sie dann wieder auf den trixi Filterwürfel. Für die letzten vier Bilder zur Abbildung der Mikrotubuli werden die Mikrotubuli mit dem Trissy-Filterwürfel beobachtet, der Filterwürfel wird auf fite geschaltet. Um die Nanokügelchen hier sichtbar zu machen, werden Nanokügelchen, die von Mikrotubuli transportiert werden, durch die Pfeile gekennzeichnet. Nicht alle Nanokugeln wurden von Mikrotubuli aufgenommen.

Nun wird 36 Sekunden später die Position der Nanokügelchen gezeigt, was zeigt, dass sich die Nanokügelchen verschoben haben. Wenn die Mikrotubuli erneut abgebildet werden, zeigt sich, dass die Mikrotubuli ebenfalls über das Gesichtsfeld gewandert sind. Diese Bilder zeigen, dass die Nanokugeln durch das Pendeln der Mikroröhren verschoben wurden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Inverted Motility Assay durchführen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Filterwürfel während der Bildaufnahme zu vertauschen, so dass sowohl die Mikrotubuli als auch die Nanokugeln zu sehen sind. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.