एक रिवर्स जेनेटिक Embryogenesis दौरान दृष्टिकोण कार्यात्मक अतिरेक टेस्ट

Biology

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Summary

जीन समारोह के नुकसान के समारोह प्रयोगों में छिप जा सकता है अगर वहाँ एक और जीन द्वारा मुआवजा है. zebrafish मॉडल एक अपेक्षाकृत उच्च throughput भ्रूण में रहने वाले ऐसे कार्यात्मक अतिरेक प्रकट का मतलब प्रदान करता है.

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Rikin, A., Rosenfeld, G. E., McCartin, K., Evans, T. A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020, doi:10.3791/2020 (2010).

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Abstract

Embryogenesis दौरान जीन समारोह आम तौर पर नुकसान के समारोह के प्रयोगों द्वारा परिभाषित किया गया है, माउस में लक्षित mutagenesis (पीटा) के द्वारा उदाहरण के लिए,. Zebrafish मॉडल में, प्रभावी रिवर्स आनुवंशिक तकनीक जीन विशिष्ट antisense morpholinos के microinjection का उपयोग कर विकसित किया गया है. Morpholinos विशिष्ट आधार बाँधना और ब्लॉक जीन समारोह के माध्यम से एक mRNA transiently लक्ष्य बाधा अनुवाद या embryogenesis (पछाड़ना) के दौरान कई दिनों के लिए splicing के द्वारा. हालांकि, माउस या zebrafish जैसे रीढ़ में, कुछ जीन कार्यों इन एक और जीन है कि नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति की उपस्थिति के कारण दृष्टिकोण से छिप जा सकता है. यह जीन कर रहे हैं कि एक ही विकासशील ऊतकों में सह व्यक्त बहन जीन युक्त परिवारों के लिए विशेष रूप से सच है. Zebrafish में, कार्यात्मक मुआवजा एक अपेक्षाकृत उच्च throughput तरीके से परीक्षण किया जा सकता है है morpholinos सह इंजेक्शन द्वारा, कि दोनों जीनों के एक साथ लक्ष्य पछाड़ना. इसी तरह, का उपयोग morpholinos, किसी भी दो जीन के बीच एक आनुवंशिक बातचीत दोनों जीनों के पछाड़ना के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है एक साथ उप दहलीज स्तरों पर. उदाहरण के लिए, morpholinos ऐसी है कि न तो व्यक्ति पछाड़ना phenotype उत्पन्न titrated किया जा सकता है. यदि इन शर्तों के तहत, दोनों morpholinos सह इंजेक्शन phenotype का कारण बनता है, एक आनुवंशिक बातचीत से पता चला है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे दो संबंधित GATA प्रतिलेखन कारकों के संदर्भ में कार्यात्मक अतिरेक दिखाने के लिए. GATA कारकों हृदय progenitors के विनिर्देशन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह दोनों Gata5 और Gata6 के नुकसान से ही पता चला है. हम बताते हैं कैसे बाहर microinjection प्रयोगों ले, morpholinos मान्य है, और cardiogenesis के लिए मुआवजा phenotype मूल्यांकन.

Protocol

हमारे यहाँ लक्ष्य cardiomyocyte progenitors के विनिर्देशन के लिए दो प्रतिलेखन कारकों के कार्यात्मक अतिरेक परीक्षण है. कारकों दो संबंधित gata5 और gata6 जीन द्वारा इनकोडिंग रहे हैं और हम zebrafish मॉडल का उपयोग कर रहे हैं उनके रिश्तेदार कार्य समझ 1 . हमारी रणनीति के लिए जीन समारोह का उपयोग कर 2 morpholinos ब्लॉक है. हम एक या एक निषेचित अंडे में अन्य जीन के लिए morpholinos इंजेक्षन जाएगा और दोनों morpholinos के साथ एक साथ इंजेक्शन अंडे से प्राप्त भ्रूण भ्रूण phenotype के साथ तुलना. Phenotypes के मूल्यांकन को आसान बनाने के लिए, हम मछली से व्युत्पन्न अंडे है कि एक transgene है कि cardiomyocytes में GFP व्यक्त ले का उपयोग करें.

चरण 1. Microinjection के लिए तैयारी.

ए) स्थापना मछली के प्रजनन जोड़े

शाम इंजेक्शन के लिए पहले, एक पुरुष और एक महिला वयस्क मछली (उम्र के 3-18 महीने) जोड़े में ब्रीडर अगली सुबह तक एक विभक्त द्वारा अलग टैंक में रखा जाता है. हम आम तौर पर स्थापित मछली की 10-20 जोड़े, और इन सप्ताह में एक बार mated रहे हैं, की परवाह किए बिना कि क्या अंडे इस्तेमाल किया जाएगा, उपजाऊपन को बनाए रखने. इस प्रयोग के लिए हम एक पत्रकार के तनाव का उपयोग कर रहे हैं cmlc2 के लिए ट्रांसजेनिक: EGFP, क्योंकि यह फर्क cardiomyocytes की पहचान के लिए एक सरल readout प्रदान करता है. अगली सुबह, एक बार रोशनी, पानी बदल जाता है पर बदल रहे हैं, और डिवाइडर मछली जोड़े दोस्त और अंडे का उत्पादन करने की अनुमति टैंक से खींच रहे हैं. अंडों का उत्पादन, नजर रखी जा सकता है और तुरंत आरंभ कर सकते हैं, या एक घंटे या अधिक की अवधि के बाद, मछली पर निर्भर करता है. आमतौर पर, लगभग निर्बाध संभोग के 20 मिनट के बाद, अंडे एक विंदुक या झरनी का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं और 100 मिमी पेट्री प्रणाली पानी युक्त व्यंजन में डाला. अंडा उत्पादन की निगरानी करने में विश्वास दिलाता हूं कि भ्रूण 1-4 सेल मंच के बीच में इंजेक्ट कर रहे हैं यह महत्वपूर्ण है. एक समय में कई जोड़े को रिहा करके, यह संभव है अंडा उत्पादन डगमगाते और इस तरह है कि एक प्रारंभिक विकास चरण में इंजेक्ट किया जा सकता अंडे की राशि को अधिकतम. मछली की एक अच्छी जोड़ी 200 से अधिक भ्रूण उत्पन्न हो सकता है, और यह कोई व्यावहारिक समझ में आता है एक ही समय में अंडे के हजारों एकत्र है, के बाद से एक एकल अन्वेषक उन्हें जल्दी पर्याप्त इंजेक्षन करने में सक्षम नहीं हो सकता है इससे पहले कि वे 4 सेल चरण परे विकसित होगा . मछली प्रकाश चक्र पर नस्ल के लिए प्रेरित कर रहे हैं, तो यह एक प्रयोग है कि एक जल्दी शुरू करने की आवश्यकता है, और अंडे आमतौर पर दोपहर के बाद नहीं प्राप्त कर रहे हैं.

बी) सुइयों की तैयारी

  1. एक micropipette डांड़ी और एक 3.5 "गिलास केशिका ट्यूब का प्रयोग निम्न शर्त का उपयोग करने के लिए दो सुइयों उत्पन्न: हीट = 626 = 60, 60 = वेग, और = समय 250 खींचो हम खुले कोर सुइयों है कि एक रेशा शामिल नहीं है का उपयोग करें, क्योंकि. हम उन्हें चूषण के साथ सामने भरने.
  2. प्रत्येक सुई की नोक फिर धीरे से एक साफ रेजर ब्लेड या संदंश का उपयोग टूटी हुई, और बाद में एक 30 डिग्री के कोण के बारे में 20 सेकंड के लिए पर beveled एक सूक्ष्म ईजी-4 चक्की का उपयोग कर. यह टिप sharpens और महत्वपूर्ण है अगर आप chorion के माध्यम से इंजेक्षन है.
  3. यह एक सुसंगत सुई के बारे में 15 माइक्रोन का व्यास टिप आकार (4 gridded खुर्दबीन ऐपिस, एक 1-2 nl इंजेक्शन की मात्रा जांच करने में सक्षम होने का उपयोग इकाइयों के रूप में कैलिब्रेटेड) प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. सुई अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए, सुरक्षित एक सुरक्षित स्थान में संग्रहीत है, और प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से इंजेक्शन शुरू लगातार इंजेक्शन की मात्रा आश्वासन (विवरण के लिए देखें अनुभाग डी) बस पहले कैलिब्रेटेड. अगर आप भाग्यशाली हैं, आप एक पूरे प्रयोग के लिए एक सुई का उपयोग करने में सक्षम हो सकता है. हालांकि, एक सुई आसानी एक प्रयोग के बीच में तोड़ कर सकते हैं, और आप उस समय का उपयोग करने के लिए नए सुई खींच नहीं करना चाहती.

सी) इंजेक्शन प्लेटें बनाना

  1. सिस्टम पानी में एक 2% agarose समाधान के 100 मिलीलीटर, एक माइक्रोवेव ओवन में उबलते द्वारा तैयार करें.
  2. को छूने के लिए अच्छा है, और एक 100mm पेट्री डिश के उल्टे ढक्कन में 12ml के बारे में डालना.
  3. 2 खुर्दबीन स्लाइड, लगभग 45 डिग्री के कोण पर slanted ढक्कन के दो पक्षों में सम्मिलित करें. एक बार agarose जम गया है, धीरे से दो स्लाइड्स ढक्कन से दूर खींच.
  4. यह troughs जहां भ्रूण और बाद में रखा जाएगा इंजेक्शन बनाता है. एकाधिक प्लेटें समय से आगे तैयार किया जा सकता है. वे 4 ° C पर अनिश्चित काल के संग्रहीत कर सकते हैं 70% इथेनॉल की एक परत जोड़ने के बाद, मूल की थाली के नीचे जोड़ने, और parafilm साथ सील. उपयोग करने से पहले अच्छी तरह धो याद रखें.

डी) Microinjection स्टेशन और सुई अंशांकन

  1. संकुचित नाइट्रोजन स्रोत और पीएलआई-100 microinjector पर मुड़ें. इंजेक्टर 18 साई के एक निरंतर प्रवाह दबाव के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  2. एक सुई डालने से पहले आश्वासन, कि micromanipulator आंदोलन की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति के लिए एक उचित स्थिति में है, और है कि एक सुई डाला तालिका नहीं हड़ताल करेंगे. से एक सम्मिलित करेंसुई पहले micromanipulator में यकीन है कि वहाँ एक तंग सील है (देखें अनुभाग सी) तैयार है. सुई को नहीं तोड़ करने के लिए सावधान रहें.
  3. निरीक्षण खुर्दबीन के नीचे सुई टिप को यकीन है कि यह अंशांकन के लिए आगे बढ़ने से पहले नहीं भरा हुआ है.
  4. इंजेक्शन समाधान या DDH 2 हे (2-3 μl) parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा पर ड्रॉप प्लेस और यह सुई में खींच भरने के लिए बटन का उपयोग कर के बारे में 1.5 μl को भरने. सुनिश्चित करें कि आप पूरी तरह से समाधान में सुई टिप है, और माइक्रोस्कोप के माध्यम से तरल चूषण का निरीक्षण करने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले में ड्राइंग से बचने के.
  5. एक micrometer ग्रिड पर खनिज तेल की एक बूंद प्लेस.
  6. इंजेक्शन के समय यह सुनिश्चित करने के लिए है कि ड्रॉप आकार व्यास में लगभग 1.5 माइक्रोन empirically समायोजित. यह ~ nl 1.8 का एक इंजेक्शन की मात्रा में वितरित कर देगा. अपनी पसंद के लिए वास्तविक मात्रा समायोजित किया जा सकता है, लेकिन एक व्यावहारिक अर्थों में यह मुश्किल है 1 nl नीचे करने के लिए सही मात्रा जांचना, और भ्रूण मात्रा 2 nl ऊपर बर्दाश्त नहीं कर सकते. मात्रा आकार के बावजूद आप चुनते हैं, तो यह नियंत्रण सहित आपके सभी इंजेक्शन के लिए एक ही रखने के लिए, और अपने समाधान सांद्रता (बजाय इंजेक्शन की मात्रा) को समायोजित करने के लिए इंजेक्शन morpholino की राशि टाइट्रेट.
  7. Recalibration आवश्यक हर बार एक सुई की जगह है, के बाद से सुई टिप आकार अलग अलग होंगे.

चरण 2. दो अलग जीन लक्ष्यीकरण morpholinos के मान्यकरण

Morpholinos अनुवाद दीक्षा साइट ब्याह या एक लक्ष्य mRNA की जिससे प्रोटीन संश्लेषण या उचित mRNA प्रसंस्करण को अवरुद्ध साइटों को लक्षित करने के लिए डिजाइन किए हैं. जब पहली बार के लिए एक जीन का विश्लेषण, हम morpholinos के दोनों प्रकार का उपयोग करने के लिए परीक्षण अगर वे एक ही phenotype उत्पन्न एक विशिष्ट पछाड़ना का संकेत है. ब्याह अवरोधक का एक लाभ यह है कि आप RT-पीसीआर, जो विशेष रूप से उपयोगी है यदि लक्ष्य जीन के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं द्वारा सामान्य प्रतिलिपि के पछाड़ना सत्यापित कर सकते हैं हैं. हम उदाहरण देकर स्पष्ट करना होगा कि कैसे एक सुसंगत हृदय phenotype gata5 और gata6 morpholinos (gata5 5'UTR एमओ अनुक्रम का उपयोग कर जीनों के लिए हासिल की है: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 ', gata5 ब्याह साइट एमओ अनुक्रम 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3' , 5 gata6 'UTR एमओ अनुक्रम 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

  1. Morpholinos जीन उपकरण, LLC (Philomath, या) से प्राप्त कर रहे हैं. जीन उपकरण आप का सबसे अच्छा लक्ष्य अनुक्रम का चयन मदद, अगर आप उनके समर्थन स्टाफ से पूछना होगा. आप केवल उन्हें परिग्रहण संख्या भेजने के लिए, और वे सलाह देंगे की जरूरत है. हालांकि, वहाँ कोई गारंटी नहीं है कि morpholino काम करेंगे, जो तुम क्यों गतिविधि को मान्य करने के लिए तैयार रहने की जरूरत है. आप भी अगर morpholino OpenBiosystems से उपलब्ध है की जाँच कर सकते हैं. जीन उपकरण OpenBiosystems संश्लेषित morpholinos के शेयरों प्रदान करता है. है जबकि वहाँ फिर कोई गारंटी नहीं है यह काम करेगा, वे एक कम कीमत पर छोटी मात्रा बेचते हैं, जो नए लक्ष्य के परीक्षण के लिए चुकाना लागत में मदद मिल सकती है. Transcriptome के खिलाफ अपने morpholino ब्लास्ट यकीन है, हम UCSC zebrafish जीनोम ब्राउज़र (genome.ucsc.edu) पर BLAT सुविधा का उपयोग करें. बेशक, अगर एक morpholino साहित्य में मान्य किया गया है (कड़ाई से), यह सिफारिश की है कि आपको लगता है कि उसी क्रम खरीद.
  2. morpholino बाँझ DDH 2 0 में 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता को भंग कर रहा है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत. Morpholino समाधान रुक, किसी कारण के लिए कम तापमान के रूप में कभी कभी उन्हें समग्र और वेग के लिए पैदा कर सकता है नहीं. Morpholinos proteases या न्युक्लिअसिज़ के लिए असंवेदनशील हैं, तो के रूप में लंबे समय के पानी के रूप में आप जोड़ने के बाँझ है, वे कमरे के तापमान पर काफी सुरक्षित किया जाना चाहिए.
  3. इंजेक्शन लगाने से पहले, 65 morpholino सेते ° C के लिए 5 मिनट के लिए यह विश्वास दिलाता हूं पूरी तरह भंग कर रहा है और कमरे के तापमान शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. बर्फ पर नमूना जगह नहीं है. Morpholino इंजेक्शन जब तक कमरे के तापमान पर रखें.
  4. एक morpholino टाइट्रेट करने के लिए, हम आम तौर पर 2 0 DDH में शेयर एकाग्रता के धारावाहिक dilutions तैयार करने के लिए 1 मिमी का काम कर रहे सांद्रता उपज, 0.5 मिमी, .25 मिमी, और 0.125mM. अनुक्रम पर निर्भर करता है, इंजेक्शन की मात्रा के nl 1.8 का उपयोग कर, यह लगभग 20ng, 10ng, 5ng, और 2.5ng इंजेक्शन प्रति morpholino के प्रतिनिधित्व करता है. यह सिर्फ एक प्रारंभिक बिंदु है, क्योंकि सहिष्णुता और प्रत्येक morpholino की प्रभावकारिता अलग अलग होंगे और भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है. ज्यादातर morpholinos 20 एनजी ऊपर ज्यादा बर्दाश्त नहीं किया जाएगा, लेकिन कुछ अच्छी तरह से 1 एनजी नीचे खुराक पर प्रभावी किया जा सकता है है. हमारा दृष्टिकोण जिस पर phenotype "पठारों" एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए है. दूसरे शब्दों में, यदि एक परिभाषित phenotype 2.5 एनजी का उपयोग कर नहीं देखा है, लेकिन समान है पर या 5 एनजी के ऊपर किसी भी राशि का उपयोग, हम एक सीमा राशि के रूप में 5 एनजी चुनना होगा. बेशक, यह एनजी 2.5 और 5.0 एनजी के बीच अगले टाइट्रेट के लिए उपयोगी हो सकता है, करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप reproducibly सीमा से परे काम कर रहे हैं, बजाय सही "सीमा पर" हो सकता है.
  5. संलग्न और कैलिब्रेटेड सुई भरेंसबसे कम काम कर रहे (पतला सबसे) एकाग्रता morpholino समाधान के साथ (ऊपर देखें). बचें सुई पर भरने के रूप में यह केवल सामग्री बर्बाद होगा. यदि आप केवल 1 μl भरने, 500 इंजेक्शन के लिए पर्याप्त समाधान है.
  6. एक डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग, microinjection थाली के troughs में एक सेल भ्रूण निषेचित हस्तांतरण. करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण इंजेक्शन नली के नीचे गिर करने के लिए अतिरिक्त पानी निकालें. वे नाव, लेकिन नहीं बल्कि agarose बिस्तर का पालन करना चाहिए.
  7. इंजेक्शन थाली स्थिति इतनी है कि micromanipulator chorion के माध्यम से और इंजेक्शन के लिए जर्दी में सुई टिप उतर सकते हैं. व्यक्तिगत भ्रूण की स्थिति के लिए, इंजेक्शन की थाली है कि इस तरह के इंजेक्शन सुई की नोक धक्का या उचित स्थिति के लिए भ्रूण खींचती हेरफेर. सावधान रहो, सुई टिप या नुकसान भ्रूण नहीं तोड़! यह कुछ अभ्यास लेता है, लेकिन एक नियम के रूप में आप micromanipulator बस का उपयोग भ्रूण में इंजेक्शन की सुई चाल और फिर इंजेक्शन के बाद, बल्कि जल्दी और सफाई से बाहर है. भ्रूण चलती थाली अपने मुक्त हाथ (हाथ छोड़ दिया अगर तुम अपने दाहिने हाथ के साथ इंजेक्षन है) का उपयोग कर से इंजेक्शन की स्थिति में लाया जाता है. एक नया सीखने के लिए, यह क्रम में इंजेक्शन समाधान कल्पना एक 0.25% phenol लाल युक्त समाधान का उपयोग अभ्यास के लिए उपयोगी है. कि समाधान की पुष्टि भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था, अंतर - chorion अंतरिक्ष बजाय; विश्वास भी एक फ्लोरोसेंट टैग (एफ 8794 आण्विक जांच) microspheres युक्त समाधान इंजेक्शन लगाने के द्वारा प्राप्त की है हालांकि, अभ्यास के कुछ राउंड के बाद, इन एड्स आमतौर पर अब जरूरी नहीं रह रहे हैं. यह एक अच्छा विचार है कभी कभी हवा में इंजेक्षन है, बस की पुष्टि करने के लिए है कि सुई भरा और इंजेक्शन की मात्रा जा रहा है उचित प्रतीत होता है कि नहीं है.
  8. इंजेक्ट भ्रूण प्रणाली पानी के साथ एक 100mm पेट्री डिश के लिए वापस स्थानांतरित कर रहे हैं और 28.5C पर सुसंस्कृत. सबसे कम काम कर रहे एकाग्रता के इंजेक्शन के बाद, किसी भी शेष समाधान और निष्कासित किया जा सकता है अगले सर्वोच्च morpholino के काम एकाग्रता सुई को भरने के लिए इस्तेमाल किया. Morpholino में से प्रत्येक एकाग्रता के लिए दोहराएँ. हालांकि यह संभव है करने के लिए सुई का उपयोग कर पानी कुल्ला, जब एक विशिष्ट morpholino परीक्षण, हम करने के लिए सुइयों को बदलने और recalibrate पसंद करते हैं. Uninjected भ्रूण की एक पलटन है कि भ्रूण की विशिष्ट बैच स्वस्थ और सामान्य था सत्यापित करने के लिए रखना सुनिश्चित करें.

चरण 3. व्यक्तिगत दहलीज खुराक पर morpholinos के सह - इंजेक्शन

ऊपर बाहर ले अनुमापन के लक्ष्य के लिए प्रत्येक morpholino के लिए एक सीमा खुराक को परिभाषित करने के लिए गया था. सर्वश्रेष्ठ मामले परिदृश्य में, morphants का अनिवार्य रूप से 100% एक परिभाषित phenotype प्रदर्शित करने के लिए, अगर लक्षित जीन एक आवश्यक कार्य है. हालांकि, आप कुछ परिवर्तनशीलता गलत इंजेक्शन कलाकृतियों की वजह से उम्मीद कर सकते हैं. अभ्यास के साथ, यह 10% अधिक नहीं होनी चाहिए. भ्रूण (uninjected नियंत्रण सहित) के कुछ बैचों को अच्छी तरह से बच नहीं, जो मामले में प्रयोग करने के लिए रियायती हो ज़रूरत हो सकती है. इस बीच, वहाँ भी जैविक परिवर्तनशीलता है, के बाद से व्यक्तिगत भ्रूण अधिक या कम पछाड़ना के लिए सहिष्णु हो सकता है. अंत में, कुछ morpholinos काफी कुशल एक मजबूत पछाड़ना (व्याप्ति) हासिल नहीं हो सकता है. यदि एक phenotype भ्रूण की एक कम प्रतिशत में उत्पन्न होता है, लेकिन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, यह एक अलग morpholino परीक्षण के लायक हो सकता है. यह अगले प्रयोग के लक्ष्य निर्धारित करने के लिए अगर एक पूरी तरह से नया phenotype है जब दोनों जीनों एक साथ लक्षित कर रहे हैं देखा है. हम भ्रूण है कि एक morphant phenotype है के प्रतिशत में वृद्धि के लिए बस नहीं देख रहे हैं, बल्कि एक अलग phenotype कि दहलीज स्तर पर या ऊपर नहीं देखा है की पीढ़ी के लिए जब व्यक्तिगत जीनों का भी परीक्षण.

  1. पहले प्रत्येक व्यक्ति morpholino है कि एक परिभाषित phenotype उत्पन्न की दहलीज एकाग्रता पर, परीक्षण morpholinos के संयोजन का एक मिश्रण तैयार करो. उदाहरण के लिए, यदि प्रत्येक जीन के लिए दहलीज 5 एनजी था, एक काम समाधान है कि प्रत्येक के 5 एनजी + 5 एनजी (10 एनजी कुल) शामिल होंगे तैयार. चूंकि भ्रूण 20 एनजी कुल morpholino की तुलना में ज्यादा बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है, पिछले प्रयोगों के आधार पर, प्रत्येक के कम से कम राशि है कि कुशलता से प्रत्येक जीन लक्ष्य के लिए पर्याप्त है का उपयोग करें.
  2. नियंत्रण एक ही एकाग्रता है कि संयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रत्येक व्यक्ति morpholino अकेले के साथ इंजेक्शन भ्रूण के सेट शामिल करना चाहिए. इंजेक्शन समाधान के वॉल्यूम लगातार रखा जाना चाहिए (जैसे 1.8 nl). एक पत्रकार के तनाव का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ यह है कि आप किसी भी समय phenotype (उदाहरण के लिए cardiomyocyte भेदभाव) का मूल्यांकन, कर सकते हैं और बार बार. यदि भ्रूण जीन अभिव्यक्ति के लिए स्वस्थानी संकरण में मूल्यांकन किया जाना है, मंच से मिलान भ्रूण और नियंत्रण विभिन्न इंजेक्शन के बाद समय पर तय किया जा सकता है. हमारी प्रयोग के लिए, हम cardiomyocyte भेदभाव के लिए एक किराए के रूप में लगभग 24 HPF GFP अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए जा रहे हैं.

चरण 4. ईphenotypes का मूल्यांकन

  1. इंजेक्ट भ्रूण सिर्फ इंजेक्शन के बाद हो सकता है, निगरानी करनी चाहिए, और दिन के दौरान कई बार, किसी भी मृत या मर भ्रूण को हटाने के लिए, के बाद से इन शेष morphants की व्यवहार्यता समझौता कर सकते हैं. रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, भ्रूण एक विदारक प्रतिदीप्ति क्षमता के साथ outfitted सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के लिए जांच कर रहे हैं. हम एक 1X या 1.6X उद्देश्य और 0.75x से 11.25x बढ़ाई के एक सीमा के साथ एक Nikon SMZ1500 माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. जब एक फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग करते हुए, के लिए पूरी तरह से खुला स्थापित करने के लिए डायाफ्राम खोलने के लिए प्रकाश की तीव्रता को अधिकतम करने के लिए सुनिश्चित हो. इसके अलावा करने के लिए सही फिल्टर का उपयोग करने के लिए, रिपोर्टर जीन (GFP, आरएफपी, आदि) पर निर्भर करता है सुनिश्चित करें.
  2. भ्रूण tricaine methanesulfonate के 4mg/ml स्टॉक की व्यवस्था पानी में आम तौर पर एक कमजोर पड़ने 1 / 20 का उपयोग कर बेहोश कर रहे हैं. शेयरों-20C पर जमे हुए संग्रहीत हैं. वैकल्पिक रूप से, भ्रूण 20x tricaine स्टॉक का उपयोग कर euthanized किया जा सकता है है. भ्रूण आम तौर पर भी अगर वे chorion में अभी भी जांच जा सकता है. हालांकि, खासकर अगर वे फोटो खिंचवाने हो जाएगा, यह तेज संदंश का उपयोग chorions हटाने के लिए एक अच्छा विचार है. भ्रूण tricaine समाधान में अवसाद स्लाइड्स में रखकर, या उन्हें बेहतर फोटोग्राफी के लिए 3% methylcellulose के एक छोटे से ड्रॉप में रखा स्थिर करने के बाद देखा जा सकता है है.
  3. Morpholinos के एकल morphants की तुलना में संयोजन के साथ इंजेक्शन उन में भ्रूण phenotypes देखो. यहाँ हम मौलिक हृदय ट्यूब में GFP अभिव्यक्ति के पैटर्न के लिए देख रहे हैं. इस संवाददाता तनाव GFP में विशेष रूप से cmlc2 प्रमोटर, जो हृदय विनिर्देश और हृदय ट्यूब morphogenesis के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है के माध्यम से cardiomyocytes में व्यक्त किया है.

प्रतिनिधि परिणाम

हमारे प्रयोग में, दोनों gata5 और gata6 एकल morphants प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हृदय phenotypes दिखाने के लिए जब दहलीज स्तरों के साथ इंजेक्शन है, यद्यपि वहाँ काफी जैविक परिवर्तनशीलता 3,4 है. उदाहरण के लिए, gata5 morphants सबसे GFP दो क्षेत्रों में स्थित अभिव्यक्ति के साथ एक दो शाखाओंवाला दिल, उत्पन्न. यह तब होता है क्योंकि हृदय progenitors विस्थापित करने के लिए ठीक से विफल करने के लिए हृदय ट्यूब के गठन के दौरान midline पर फ्यूज. हालांकि, gata5 morphants कुछ एक दोषपूर्ण दिल ट्यूब उत्पन्न करते हैं, और एक छोटी संख्या (5%) में GFP + कोशिकाओं की राशि में एक महत्वपूर्ण कमी है. हम मानते हैं कि यह जैविक परिवर्तनशीलता को दर्शाता है, लेकिन यह भी तथ्य यह है कि morpholinos एक "अशक्त" उत्परिवर्तन के बराबर नहीं हैं के कारण हो सकता है.

इसी तरह, gata6 morphants सब एक हृदय phenotype दिखाने के लिए, लेकिन वहाँ दो शाखाओंवाला की एक छोटी संख्या तपता सहित phenotypes की एक सीमा है, और दिल है कि रूपात्मक हैं uninjected नियंत्रण भ्रूण की तुलना में परेशान . इस परिवर्तनशीलता एक हृदय morphogenetic phenotype के लिए असामान्य नहीं है, क्योंकि दिल गठन एक गतिशील प्रक्रिया है और कम से कम कुछ दिल phenotype के कारण भ्रूण morphogenetic दोष से परोक्ष रूप से किया जा सकता है. बहरहाल, महत्वपूर्ण बात, दोनों gata5 और gata6 morphants के लिए हृदय morphogenetic दोष की सीमा सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और सबसे अधिक भाग के लिए भ्रूण पर्याप्त GFP cardiomyocytes + उत्पन्न.

Gata5 और gata6 एकल morphants विपरीत में, दोनों कारकों के समाप्त भ्रूण GFP अभिव्यक्ति, cardiomyocytes की एक हानि के साथ संगत का एक पूरा नुकसान दिखा. इस प्रकार, gata5 और gata6 प्रत्येक हृदय morphogenesis के लिए गैर अनावश्यक कार्य है, लेकिन दो जीन कार्यात्मक विभेदित cardiomyocytes की पीढ़ी के लिए एक आवश्यकता में बेमानी हैं . हमारा पिछले अध्ययनों में भी जल्द से जल्द nkx2.5 सहित cardiomyocyte मार्करों, नुकसान दिखाया है, सुझाव है cardiomyocyte 3 विनिर्देशन के लिए एक आवश्यकता है.

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Discussion

में प्रयोग यहाँ वर्णित है, हम दो morpholinos, प्रत्येक जिनमें से अकेले phenotypes की एक अलग श्रृंखला उत्पन्न संयुक्त, और एक पूरी तरह से अलग phenotype है जब वे एक साथ थे सह इंजेक्शन मिला. बेशक, हम पहली जगह में इस प्रयोग करने के लिए एक औचित्य की जरूरत है. हमें संदेह है कि इस मामले हृदय विनिर्देशन में पहले के एक समारोह के लिए दो जीन एक दूसरे को क्षतिपूर्ति हो सकता है. यह है क्योंकि जीन अत्यधिक (और एक ही डीएनए दृश्यों के लिए बाध्य करने में सक्षम) से संबंधित हैं और 5 embryogenesis दौरान पैटर्न अतिव्यापी में व्यक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, ड्रोसोफिला में आनुवंशिक प्रयोगों ने संकेत दिया कि GATA प्रतिलेखन कारकों हृदय 6 विनिर्देशन के लिए आवश्यक होना चाहिए.

हालांकि, वहाँ अन्य स्थितियों है कि इस रणनीति कार्यात्मक या आनुवंशिक बातचीत के लिए और अधिक आम तौर पर अतिरेक के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहला, एक या दोनों जीनों के पछाड़ना कोई स्पष्ट phenotype उत्पन्न नहीं हो सकता है. इस मामले में, वहाँ कोई परिभाषित प्रत्येक जीन के लिए दहलीज स्तर है, और morpholino की राशि का उपयोग करने के लिए empirically परिभाषित किया जाएगा, कितनी अच्छी तरह वे भ्रूण द्वारा बर्दाश्त कर रहे हैं द्वारा सीमित है. फिर से, परीक्षण के मुआवजे के लिए तर्क की संभावना हो सकता है कि जीन अत्यधिक सह अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि से संबंधित हैं जाएगा. दूसरा, आनुवंशिक बातचीत किसी भी जीन उप दहलीज morpholinos की मात्रा का उपयोग जोड़ी के लिए परीक्षण किया जा सकता है. इस रणनीति में, अधिकतम राशि है कि एक phenotype नहीं उत्पन्न करता है प्रत्येक morpholino के लिए प्रयोग किया जाता है. यदि morpholinos दोनों के संयोजन phenotype उत्पन्न, यह एक आनुवंशिक बातचीत के लिए मजबूत सबूत प्रदान करता है, हालांकि यह काफी अप्रत्यक्ष या यहां तक ​​कि समानांतर रास्ते का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. तीसरा, एक दूसरे morpholino के सह इंजेक्शन पहले की phenotype बचाव, अगर दो जीन एक विरोधी तरीके से (जो फिर से अप्रत्यक्ष रूप से किया जा सकता है) में बातचीत कर सकते हैं. जबकि वहाँ कोई परिभाषित सीमा कितने विभिन्न जीनों को लक्षित किया जा सकता है, एक व्यावहारिक अर्थ में यह शायद 3-4 जीन प्रत्येक morpholino की राशि है कि एक सीमा प्रतिक्रिया के लिए की जरूरत है पर निर्भर करता है.

जबकि रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग करने के लिए नए जीन कार्यों प्रकट के इस सामान्य दृष्टिकोण अपेक्षाकृत उच्च throughput है, वहाँ निरंतर का एक संख्या morpholinos के बारे में विचार कर रहे हैं. Morpholinos के संयोजन से पहले, काफी प्रयास करने के लिए अलग - अलग अभिकर्मकों मान्य की जरूरत है, अगर यह पहले से ही पूरा नहीं किया गया है. कोई एकल morpholino समारोह, नहीं है जबकि दूसरों को उत्पन्न कर सकते हैं हो सकता है बंद - लक्ष्यीकरण "विरूपण साक्ष्य" phenotypes विशेष रूप से व्यापक apoptosis के सक्रियण के साथ जुड़े. अभिकर्मकों सस्ती नहीं हैं, और यदि दो या अधिक morpholinos प्रत्येक जीन को मान्य करने की जरूरत है, इस निवेश महत्वपूर्ण हो सकता है.

कई विचार प्रयोगात्मक रणनीति गाइड सकता है.

i) वहाँ एक ज्ञात उत्परिवर्ती phenotype है? यदि हां, तो एक एकल pheno नकल morpholino लिए पर्याप्त होना चाहिए.

ii) वहाँ एक उपलब्ध एंटीबॉडी है? यदि हां, तो अनुवाद ब्लॉकर, पसंद किया जा सकता है, और यदि नहीं, यह महत्वपूर्ण दस्तावेज़ है कि एक ब्याह अवरोधक प्रभावी ढंग से लक्ष्य पूर्व mRNA -.

iii) आप mRNA की इंजेक्शन द्वारा morphant बचाव कर सकते हैं? यदि यह काम करता है, यह morpholino विशिष्टता के लिए उत्कृष्ट सबूत उपलब्ध कराता है. तथापि, यह अक्सर के कारण काम नहीं हो सकता इंजेक्शन mRNA की गलत लक्ष्यीकरण. बचाव भी transposon-आधारित transgenesis का उपयोग परीक्षण किया जा सकता है, क्योंकि यह लक्षित जीन की अभिव्यक्ति पर कड़ी स्थानिक और लौकिक नियंत्रण अनुमति दे सकता है. या तो मामले में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि बचाव जीन morpholino द्वारा लक्षित नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इस प्रस्तुति तैयार करने में उनकी मदद के लिए इवांस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. यहां इस्तेमाल किया morpholinos मूल रूप से डॉ. ऑड्रे Holtzinger द्वारा मान्य किया गया. ते स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (HL064282 और HL056182) से अनुदान द्वारा समर्थित है. जानवरों पर प्रयोग वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज के दिशा निर्देशों और नियमों पशु देखभाल और उपयोग समिति के लिए संस्थान द्वारा निर्धारित है, के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish breeder tanks and dividers Aquatic Habitats
Fish nets Aquatic Habitats
System water 60mg Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes BD Biosciences 351029
Micropipette needle puller Sutter Instrument Co. P-97 Flaming/Brown
3.5" glass capillaries Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Razor blade Personna Medical Care 94-120-71
Micro grinder Narishige International EG-4
Gridded microscope eyepiece Premiere MF-02
Micrometer WARD’s Natural Science 94 W 9910
Ultrapure agarose Invitrogen 15510-027
Spatula Fisher Scientific 14-357Q
Scale Mettler Toledo AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes Fisher Scientific 2-202-B
Conventional microwave GE Healthcare
Erlenmeyer flask Corning 4980
Microscope slides Fisher Scientific 12-552
Graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6D
Automatic pipette man BrandTech 2026333
70% ethanol wash solution Tarr 801VWR
N2 tank Tech Air
Microinjector Harvard Apparatus PLI-100
Micromanipulator Micro Instruments LTD
Dissecting microscope Nikon Instruments SMZ1500
Parafilm American National Can PM-992
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34155
gata5 splice site morpholino Genetools, LLC 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
gata5 ATG Blocker Genetools, LLC 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
gata6 Long Isoform ATG Blocker Genetools, LLC 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
Disposable Pasteur Pipette Fisher Scientific 13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate Argent Labs MS-222
Methycellulose ICN Biomedicals 155495
Heat Block Fisher Scientific 11-718-4
Sharp forceps Dumont Size 55
Depression Microslides VWR international 48339-009

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References

  1. Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
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  5. Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
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