Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sialidase testi canlı makrofaj hücre yüzeyinde reseptör düzeyinde iltihabi hastalıklar mikrobik enfeksiyonlar ve katılımı TLR sensörleri yeni moleküler mekanizma (lar) aydınlatmak basit bir teknik yaklaşım.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Amith, S. R., Jayanth, P., Finlay, T., Franchuk, S., Gilmour, A., Abdulkhalek, S., Szewczuk, M. R. Detection of Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation. J. Vis. Exp. (43), e2142, doi:10.3791/2142 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Memeli Toll-like reseptörler (TLR), patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya reseptörlerinin bir aile. Sadece TLR mikrobiyal önemli sensörler (örneğin, virüs, bakteri ve parazit) enfeksiyonları, onlar da muhtemelen otoimmün hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar, enfeksiyon hastalıkları, patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, şiddeti ve süresi, bulaşıcı hastalıklara karşı TLR tepkilerin sıkı kontrol edilmelidir. Bu sensör reseptörler, ligand etkileşimleri ve sinyal bileşenleri yapısal bütünlüğünü anlamak sonraki immünolojik korunması için gerekli olduğunu izler. Ayrıca sensör manipülasyon yoluyla hastalık modifikasyonu için önemli fırsatlar sağlayacaktır. TLR sensörleri sinyal yolakları iyi karakterize olmasına rağmen, parametreler sensörleri ve ligandlar hala yetersiz tanımlanmış kalır arasındaki etkileşimleri kontrol. Biz son zamanlarda, daha önce 1,2 görülmemiştir, doğal ligand TLR aktivasyonu yeni bir mekanizma tespit ettik. Bu ligand bağlı TLR aktivasyon Neu1 sialidase aktivasyonu ile sıkıca kontrol edildiğini göstermektedir. Ayrıca Neu1 sıkıca Neu1 ve matriks metalloproteinaz-9 (MMP-9) reseptörleri 4 karmaşık çapraz konuşma içeren TrkA ve TrkB 3 gibi nörotrofin reseptörleri düzenleyen bildirdin. Sialidase tahlil başlangıçta GPCR Gαi proteinleri ve MMP-9 5 üzerinden makrofajlar, dendritik hücreler ve fibroblast hücreleri hücre yüzeyinde Neu4 sialidase aktivasyonu, bir roman ligand, thymoquinone bulmak için kullanabileceğiniz olmuştur. TLR reseptörleri için, bizim veri Neu1 sialidase zaten, TLR-2, -3 ve -4 reseptörleri ile kompleks ve iki reseptör bağlayıcı ligand üzerine indüklenir göstermektedir. Aktive Neu1 sialidase hidroliz sialyl α-2 TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 karmaşık işe alım, NFkB aktivasyonu ve pro-inflamatuar hücre yanıtlarını sterik hinderance kaldırmak için bağlayıcı ligand uzak ,3-bağlantılı β-galactosyl artıkları. Ortak bir raporda, Neu1 sialidase 6 makrofaj hücreleri fagositoz düzenleyen gösterilmiştir. Birlikte ele alındığında, sialidase testi ligand bağlı reseptör aktivasyonu moleküler mekanizmaları güçlü yorumlarla bize sağlamıştır. Neu1 sialidase ve TLR aktivasyonu arasında kesin bir ilişki, Trk reseptörlerinin henüz tam olarak açıklanamamış olmasına rağmen, hücre düzenleme yollar öncü ya da yeni bir yaklaşımı temsil eder.

Protocol

1. Dondurulmuş Makrofaj Hücreler kurtarılıyor

  1. -80 Donmuş hücreleri diriltmeyi önce ° C derin dondurucu, bir ihtiyacı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mg / plasmocin ml ile desteklenmiş filtrelenmiş steril Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kültür ortamı hazırlamak için. Plasmocin araştırma hücre kültürlerinin mycoplasma kirlenme ortadan kaldırmak ve önlemek için kullanılan bir antibiyotik çözümdür.
  2. Donmuş hücreleri bir flakon için, bir 4 ml, 1 ml steril bir biyolojik tehlike altına kaput 25 cm 2 hücre kültürü şişesi kültürlü ortamın ekler.
  3. -80 ° C derin dondurucu donmuş hücreleri flakon alındığında, çabuk, yaklaşık 2-3 dakika sürer steril davlumbaz, el ısınmanın çözdürülen.
  4. Hücreleri kısa sürede çözülmüş gibi, onlar hızlı bir 1ml steril pipet kullanarak klimalı ortamda içeren balona aktarılır.
  5. Bir doku kültürü inkübatör 37 ° C ve% 5 CO 2 içeren hücreler balon yerleştirilir.
  6. Ters bir mikroskop kullanarak% 75 -% 90 konfluent olana kadar hücreleri günlük bazda büyüme ve bağlılık için kontrol edilmelidir.
  7. Alkol hücre kültürü inkübasyon sırasında, 12 mm yuvarlak cam slaytlar, onları kapsayan biyolojik tehlike altına kabine 1 saat boyunca büyük bir cam petri% 70 etanol ile sterilize edilir, daha sonra kaldırıldı ve reusage için saklanan ve ıslak cam tarafı 24 saat veya kuru kadar, bir UV altında kabin içinde steril-filtreli hava akış maruz bırakılmıştır.

2. Sialidase Testi Kaplama Hücreler

  1. Hücreleri kaplama önce, tek bir steril yuvarlak cam slayt dikkatle paslanmaz çelik forsepsle, tırtıklı, "4, steril bir alev tam kavisli kullanarak iyi bir BD Falcon 24-iyi kapaklı düz alt doku kültürü tedavi polistiren plaka yerleştirilir % 75 birleştiği noktada yer hücrelerinin bir şişesi için, genellikle kültür plaka 12 kuyu kullanır.
  2. Yapışık makrofaj hücreleri için, DMEM klimalı ortamda, steril çevreleme kabin içinde 5 ml steril pipet kullanarak şişeden çıkarılır. Serum içeren herhangi bir ortamda çıkarın ve hücrelerin karşılamak için yeterli pH 7.4 'de tamponlu tuz, kalsiyum-orta ücretsiz (CMF) fosfat 1 ml serum fizyolojik pH 7.4 tamponlu 1x steril Tris yapışık hücreler bir kez yıkayın. Hücrelerin balonuna kaldırın başlayana kadar hücreleri yaklaşık 10 dakika veya 37 ° C inkübatör yerleştirilir. Balon hafifçe sarsan veya kalan yapışık hücrelere gevşetmek için sarsılmış olabilir.
  3. Balonuna asılı hücreleri 1 mL, 3 mL DMEM klimalı ortamda ekleyin. 0.5 mL askıya alınan hücrelerin alın ve onları sterilely 12 mm yuvarlak cam slaytlar içeren doku kültür plaka transfer. Yaklaşık 0.5 x 10 6 hücre yuvarlak cam slaytlara aktarılır.
  4. Doku kültürü plakası içeren hücrelerin 37 inkübe ° C'de% 5 CO 2 hücreleri yuvarlak cam slaytlar uymak için izin vermek için 24 saat.

3. Sialidase Testi

1. Denetim

  1. Çevreleme dolap ya da laboratuvar tezgah ve sırayla aşağıdaki bileşikler karıştırarak ekleyin: (1 sonunda, 1slide, 25 x 75 x 1 mm buzlu): Bir mikroskop lamı yerleştirin 4-MUNANA mcL DAKO 1 + 1 mcL ve son olarak + Tris, 3 mcL tamponlu salin pH 7.4 (TBS).
  2. Hücreleri içeren bir medya çıkardıktan sonra, iyi köşesine 4 "forsepsle ile dairesel cam slayt hafifçe kaldırın. Dikkatlice forsepsle cam slayt kaldırmak ve karışım çözümü üzerine bakan hücreleri ile slayt mikroskop lamı.
  3. Derhal, UV filtresi ve floresan görüntü yakalamak için bir dijital kameraya sahip olan bir epi-floresan mikroskopi microcope slayt alır.
  4. , Sonra floresan modunda geçmek hücrelere kadar, faz kontrast altında mikroskop odaklanın. 1 dakika, 2 dakika, 3 dakika floresan altında hücrelerin fotoğraflar çekin. Faz kontrast altındaki hücreleri tek bir fotoğraf çekin.

2. Pozitif test yapma

  1. 4-MUNANA 1 mcL DAKO + 1 mcL LPS + 2 mcL + 1 mcL TBS: başka bir mikroskop lamı üzerine sırayla aşağıdaki bileşikler Nokta.
  2. Yukarıdaki adımları 3.1.2 3.1.4 tekrarlayın.

3. Nöraminidaz inhibitörü Tamiflu ile birlikte Pozitif test yapma

  1. Başka bir mikroskop lamı üzerine aşağıdaki sırayla aşağıdaki bileşikler Nokta: 4-MUNANA 1μL DAKO + 1μL + LPS 2 mcL + Tamiflu 1 mcL.
  2. Dairesel cam slayt canlı hücreler ile temas halinde bileşiklerin nihai konsantrasyonu 5 seyreltme faktörü olacaktır; Tamiflu konsantrasyonları 1x Tris tamponlu salin pH 7.4 önceden hazırlanmış..
  3. Yukarıdaki adımları 3.1.2 3.1.4 tekrarlayın.

4. İnhibitörü Konsantrasyon belirlenmesi Sialidase Faaliyet% 50 (IC 50) Engelleme için gerekli

  1. Hücreleri çevreleyen floresan ölçmek için, görüntüleri RBG ölçmek için analiz eklentisi ile ImageJ 1.38x kullanılarak analiz edilmektedir. Hücreleri çevreleyen floresan rasgele 50 spot okuma alın ve toplam floresan ortalama hesaplamak.
  2. IC 50, doğrusal olmayan regresyon kullanarak y ekseni üzerinde x-ekseni üzerinde ortalama floresan karşı (örneğin, log ng / ml), günlük birimleri olarak dönüştürülür inhibitör konsantrasyon bir komplo oluşturulur.

5. Başarı sırları

  1. Kültür hücreleri mycoplasma gelen kirlenme olduğundan emin olun. Biz bunun için rutin kontrol etmek için bir kültür ortamında Plasmocin kullanabilirsiniz.
  2. Yapay nöraminidaz substrat, 4-MUNANA, taze hazırlanmış olmalıdır. Hazırlanan zemin sialidase tayini için bir hafta içinde kullanılabilir.
  3. Hücre hattı hücre yüzeyinde düşük reseptör ifade varsa, bir stimülasyon için daha yüksek bir doz ligand kullanabilirsiniz.
  4. Biz de 6 kat fazla geçişli hücreler reseptör fenotip kaybedebilirsiniz yaşadım. Taze, dirilen hücrelerin kültür olmalıdır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Ekli temsilcisi sonuçları ile sialidase testinin animasyonlu protokol Powerpoint dosyası .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Canlı makrofaj hücreleri 2 sialidase faaliyet algılamak için yeni geliştirilen testi kullanılarak, BMC-2 de canlı doza bağlı olarak makrofaj hücreleri DC-2.4 dendritik hücreler canlı ligand bağlı sialidase faaliyet sialidase aktivite tespit etmek için bu teknolojiyi kullandı HEK-TLR4/MD2, HEK293 SP1 meme adenokarsinom hücreleri, insan WT ve 1140F01 ve WG0544 tip I sialidosis fibroblast hücreleri. Tamiflu gibi nöraminidaz inhibitörleri (oseltamivir fosfat) bir IC 50 0,0194 mcM BMC-2 hücreleri için 19,17 mcM nöraminidaz inhibitörü DANA (2-deoksi-2 ,3-dehidro-IC 50 ile karşılaştırıldığında canlı thymoquinone indüklenen sialidase aktivite inhibe DN-acetylneuraminic asit) 5. Ayrıca gibi spesifik anti-Neu1, -2 ve 3 antikorlar gibi diğer uygulamalara canlı BMC-2 ve insan TQ-kaynaklı sialidase aktivite inhibisyonu THP-1 makrofaj hücreleri rapor etmişlerdir ancak anti-Neu4 antikorlar tamamen bu aktiviteyi engellemek. Canlı birincil kemik iliği (BM) ikincil Neu1 eksikliği (NeuI KD) ile bir fareler değil Neu4 nakavt (WT ve hypomorphic katepsin türetilen makrofaj hücreleri tedavi TQ ile ilişkili güçlü bir sialidase aktivite tespit etmek için, sialidase faaliyet bir uygulama yoktur Neu4 KO) farelerde 1,2,5. Buna ek olarak, boğmaca toksini (PTX), G-protein kenetli reseptör (GPCR) ve matriks metalloproteinaz (MMP) galardin ve piperazin geniş inhibitörleri Gαi proteinlerinin spesifik bir inhibitörüdür THP-1 ve birincil, BMC-2 canlı uygulanan BM makrofaj hücreleri tamamen TQ-kaynaklı sialidase aktivite 5 blok. Bu aynı inhibitör etkisi GM1 gangliozid özel kolera toksin altbirim B (CTXB) yanı sıra, CTX, tirozin kinaz inhibitörü K252a ve geniş GPCR inhibitörü suramin gözlenmez. MMP-9 spesifik inhibitörü olan anti-MMP-9 antikor ve Neu4 anti-antikor değil, canlı tamamen MMP-3 blok TQ-kaynaklı sialidase faaliyet spesifik bir inhibitörüdür THP-1 Neu4 ve MMP-9 ifade hücreleri hücre yüzeyi 5.

Birlikte ele alındığında, sialidase tahlil moleküler mekanizmaları, ligand niteliğine bağlı olarak Neu1 veya Neu4 gibi sialidases içeren ligand bağlı reseptör aktivasyonu için güçlü bir anlayış sağlamak için kullanılabilir. Ligand bağlı reseptör aracılı ligand bağlı sialidase aktivite hızla, NGF TrkA, BDNF TrkB ve Toll-benzeri reseptörler gibi glikozile reseptörler, ligand bağlı reseptör moleküler örgütsel platformu içeren hücre yüzey membran sinyal paradigması formu olduğunu göstermektedir Gαi proteinleri, MMP-9 ve Neu1 veya Neu4 sialidase. Ligand bağlayıcı ilgili reseptörler membran Gαi proteinleri ve MMP-9 aktivasyonu ile GPCR sinyal aracılığıyla sialidase faaliyet neden olur. Neu1 veya Neu4 ve MMP-9 hücre yüzeyinde reseptör kompleksi içinde çapraz tartışma sialidase fonksiyonel bir reseptör üreten reseptör derneğe sialik asit-sterik hinderance kaldırmak için hızlı bir aktivasyon sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SRA ve PJ eşit ilk yazar olarak katkıda bulunmuştur.

Acknowledgments

MRS hibe Kısmi destek Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, Nöroloji Araştırma, ARC Harry Botterell Vakfı ve Garfield Kara Kardiyovasküler Araştırma ve Geliştirme Fonu. SRA Kraliçe Üniversitesi Araştırma Ödülü ve Robert J. Wilson Bursu bir alıcı. PJ Kraliçe Lisansüstü Ödülü ve Robert J. Wilson Bursu, bir alıcı. AG ve SA Kraliçe Lisansüstü Ödülü alıcıları. SF Bilim ve Teknoloji (OGSST) Ontario Yüksek Lisans Bursu layık görüldü. AG Kraliçe Franklin Bracken Lisansüstü Bursu almıştır. SA Kraliçe RS McLaughlin Yüksek Lisans Bursu almıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA Biosynth International, Inc
Fetal calf serum Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media Dako S3023 15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate) Hoffmann-La Roche AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
  2. Amith, S. R. Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase. Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).
  3. Woronowicz, A. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase. Glycobiology. 17, 10-24 (2007).
  4. Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling. Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).
  5. Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9. Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).
  6. Seyrantepe, V. Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1. Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics