Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

Biology
 

Summary

Eine Phagen-Display-Bibliothek verwendet wurde, um Peptidsequenzen, die auf Knochen zu identifizieren. Das Ziel war, die Wirkung dieser Peptide auf mesenchymale Zelldifferenzierung zu untersuchen und ihre Wirkung auf die Knochenregeneration zu bestimmen.

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Balian, G., Beck, G., Madhu, V., Sikes, R., Cui, Q., Liang, H., Bush, J. Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects. J. Vis. Exp. (46), e2362, doi:10.3791/2362 (2010).

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Abstract

Zwei neuartige synthetische Peptide beschleunigen Knochenbildung und können mithilfe einer Kollagen-Matrix. Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen auf die Knochenheilung in einem unikortikale Defekt-Modell zu untersuchen. Behandlung von mesenchymalen Zellen führte zu einer Zunahme der alkalischen Phosphatase-Aktivität zeigte Knöllchenbildung von den Zellen und erhöht die Expression von Genen für RUNX2, osterix, Bonesialoprotein und Osteocalcin. Ein Kollagenschwamm mit Peptid gefördert Reparatur von Knochendefekten getränkt, während die Kontrolle war weniger wirksam. Die Ergebnisse aus dieser Studie zeigten, dass mesenchymale Zellen mit Peptid in vitro behandelt Richtung Osteogenese zu unterscheiden, und, dass Peptide in vivo geliefert mit einem Kollagenschwamm die Reparatur von unikortikale Mängel zu fördern.

Protocol

1. In vivo Biopanning zu Phage isolieren, die Ziel langen Knochen

Phagen-DNA wurde sequenziert und Peptide, die mit einer entsprechenden Sequenz synthetisiert. Die Peptide wurden mit Gly-Gly-Gly-Ser-Lysin-Linker (der Linker zu koppeln fluoreszierende Chromophore, die Track / Spur der Peptide Hilfe benötigt) synthetisiert.

  1. Ein 10 Wochen alte Balb / c-Maus betäubt wurde, war Herz ausgesetzt.
  2. Die Ph.D-12 Phagen-Display-Peptid-Bibliothek Kit (New England Biolabs, Beverly, MA) wurde für in vivo Biopanning, 10 x 1010 pfu verwendet, und in die Herzen.
  3. Nach ca. 5 Minuten wurde die Maus getötet. Die Oberschenkel wurden freigelegt und präpariert, die Enden der Femora wurden abgeschnitten, und das Knochenmark entfernt wurde.
  4. Die Innen-und Außenseite des linken Oberschenkels 10-mal mit PBS gespült, und das Femur wurde ER2537 Bakterien hinzugefügt (so genannte Non-eluierten Phagen, fahren Sie mit Schritt 6).
  5. Der Markraum des rechten Oberschenkelknochens wurde mit 2%-Trockenmagermilch in eine Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel zehnmal gespült, um nicht-gebundene Phagen zu entfernen. Gebundene Phagen wurde aus dem Markraum mit HCl-Glycin-Puffer pH 2,2, neutralisiert mit 1M Tris eluiert, ergänzt ER2537 Bakterien und kultivierten 4,5 Stunden, um die Phagen (bezeichnet als eluiert) zu verstärken.
  6. Die Bakterien wurden durch Zentrifugalsedimentation für 10 min bei 4 ° C, und Phagen über Nacht bei 4 ° C gefällt wurde durch die Zugabe von PEG / NaCl-Lösung entfernt. Der Phage wurde durch Zentrifugation gesammelt und aufgehängt und ausgefallene zweimal durch Zugabe von 1 / 6 Volumen PEG / NaCl. Das endgültige Pellet wurde in TBS mit 0,02% NaN3 resuspendiert.
  7. Das verstärkte Eluaten aus der eluierten und nicht eluierten Phagen wurden in getrennte Mäusen injiziert, und Phagen wurde wie oben isoliert. Nur der linke Oberschenkelknochen war von der Maus, die mit dem Nicht-eluierten Phagen injiziert wurde, und die Oberschenkel gelegt direkt in die Bakterien (siehe Schritt 4 oben) entfernt. Die eluierten Phagen Maus wurde nur aus dem rechten Oberschenkel und die Phagen durch HCl-Glycin-Puffer vor der Zugabe zu den Bakterien freigesetzt (siehe Schritt 5 oben) isoliert.
  8. Diese in vivo Biopanning Verfahren wurde dreimal vor Sequenzierung von DNA mit-98-Primer (mit dem Phagen-Display-Kit) wiederholt.
  9. Pooled Phagen wurden in Bakterienkulturen verstärkt, gereinigt, quantifiziert und wurden dann in einem vierten Maus injiziert. Die Sequenzierung wurde wiederholt.
  10. Um zu demonstrieren, Peptid-Spezifität an Knochen und Knochenmark, Nieren-Phagen aus eluiert und Leber wurden wie oben beschrieben analysiert. In allen vier Runden gab es kleinere Menge von Phagen in diesen Organen (weniger als 10%) liegt.
  11. Die Peptide wurden mit einem Gly-Gly-Gly-Ser-Lys-Sequenz synthetisiert, mit und ohne Biotin für Zell-und Gewebe-Färbung verwendet werden, sowie für die in vivo zu arbeiten.

2. Mesenchymale Cell Culture für osteogene Zelldifferenzierung Experimente

  1. Eine geklonte Maus pluripotente Knochenmark Stromazellen (D1)-Zelllinie in unserem Labor 1 isoliert wurde für in vitro-Experimenten verwendet. Die Zellen wurden in modifizierter wesentliche Dulbecco Medium, DMEM, niedrige Glukose (Gibco cat # 11885-084) mit 10% fötalem Rinderserum (Gibco cat # 16000-044), fünfzig Milligramm Natriumascorbat pro Milliliter (supplementiert Sigma cat # A7631 ) und 100 U / ml Penicillin G und 100 mg / ml Streptomycin (Gibco Katze # 15140-122).
  2. Die Kulturen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 wasserummantelten Inkubatoren und subkultiviert, bis die Zellen wurden ca. 90% konfluent.
  3. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, zentrifugiert, um Pellets, gezählt und ausgesät in einer Konzentration von 5x10 3 Zellen / cm 2 in Gewebekultur behandelt Kunststoffprodukte.

3. Peptide Färbung für kultivierten Zellen und Geweben

  1. D1-oder Knochenmark-Zellen wurden auf Fibronektin-oder Gelatine-beschichtete Kammer plated auch Folien mit DMEM und 10% fötalem Rinderserum für 24 Stunden.
  2. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Zellen / Gewebe wurden mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten fixiert
  3. Überschüssiges Aldehyd blockiert wurden mit 0,5 M Glycin (pH 7,5) für 10 Minuten.
  4. Endogene Avidin und Biotin-Rezeptoren auf der Zelloberfläche durch die Zugabe von 5% BSA + Avidin blockiert Lösung wurde für 1 Stunde gesperrt, gespült einmal mit PBS für 5 Minuten, dann mit 5% BSA + Biotin Blocking-Lösung für 1 Stunde gesperrt.
  5. Dann wurden 100 pM biotinyliertem L7 und R1 Peptide wurden in die Vertiefungen für 30 Minuten zugegeben.
  6. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, 5 min jeweils und 1:1000 Verdünnung von Alexa Flour Streptavidin zugegeben und im Dunkeln inkubiert für 30 Minuten.
  7. Die Zellen wurden gewaschen und die Deckgläser mit Vectashield Eindeckmittel montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Aktivität der alkalischen Phosphatase Assay

  1. Die alkalische Phosphatase colorimetric Assay wurde auf Monoschichten mit einer alkalischen Phosphatase-Kit (BioRad), wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt.
  2. D1-Zellen bei einer Dichte 5 x 10 3 Zellen / cm 2 auf 6-well-Platten ausplattiert und mit R1-Peptid wurde ALP-Aktivität an den Tagen 4, 8, 12, 16 und 20 quantifiziert.
  3. Zur Vorbereitung der Zelllysate, Zellschichten wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und dann kratzte in PBS gefolgt von Beschallung und Zentrifugation zu Zelltrümmer zu entfernen.
  4. Gleiche Volumina von Lysat (100 mL) wurde dann mit 100 ul der frisch zubereiteten kolorimetrischen Substrat para-Nitrophenylphosphat gemischt und bei 37 ° C für 30 Minuten.
  5. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ul 0,2 N NaOH-Lösungen gestoppt. ALP-Aktivität wurde bei 405 nm mittels ELISA-Reader (Bio-Rad) gemessen.
  6. Die Proteinkonzentration der Zelllysate wurde mit einem BioRad Protein Assay Kit gemessen, und die AP-Aktivität wurde dann als para-Nitrophenol in nmol / min / mg Protein produziert ausgedrückt.
  7. ALP-Aktivität wurde gemäß den Angaben des Herstellers (Sigma, Inc.) berechnet.
  8. Einheiten der ALP-Aktivität wurden in Milligramm des gesamten Proteingehalts mit BCA-Assay (Pierce, Rockford, IL) der Zelllysat normalisiert.

5. Mesenchymale Zelldifferenzierung mit L7 und R1

  1. Subkonfluente mesenchymalen (D1)-Zellen wurden auf ca. 90% Konfluenz gezüchtet und mit 5nm L7 und R1-Peptid.
  2. Die Zellen wurden bei 0,5, 2, 6, 24 und 48 Stunden geerntet und die RNA wurde unter Verwendung des Qiagen RNeasy-Kit mit den Anweisungen des Herstellers.
  3. Reverse Transkriptase (RT)-Reaktionen wurden geglüht (37 ° C, 10 Minuten), gefolgt von der ersten cDNA-Synthese (42 ° C, 30 Minuten) und Hitzeinaktivierung (95 ° C für 5 Minuten). Die erhaltene cDNA wurde eingefroren (-70 ° C), bis sie von real-time PCR untersucht.
  4. Real Time PCR wurde unter Verwendung der QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen). Die Reaktionen wurden mit 25 ul der SYBR Green Kit Master-Mix und Forward-und Reverse-Primer (300 nmol / L) von Knochen spezifische Gene für zB RUNX2, Osterix, Osteocalcin, Bonesialoprotein und Wnt-Signalwegs Gene wie b-Catenin durchgeführt, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 und OPG und RANKL (siehe Tabelle 1).
  5. Die 3 ul der cDNA Probe wurde die endgültige Reaktionsmischung aus der RT-Reaktion unverdünnt zugegeben. Der 96-Loch-real-time PCR-Format umfasste sechs 10-fache Verdünnungen in Doppelbestimmung der Plasmid-DNA-Standards. Die Vertiefungen der Platte wurden mit optischen Klebstoff bedeckt (BioRad) versiegelt und zentrifugiert bei geringer Geschwindigkeit (300 g, 5 Minuten), um sicherzustellen, vollständige Durchmischung.
  6. Jede Probe wurde mindestens in zweifacher Ausfertigung mit der iCycler Instrument (BioRad Laboratories, Hercules, CA) analysiert.
  7. Die PCR-Protokolle verwendet beteiligt Aktivierung von AmpliTaq Gold DNA Polymerase durch 40 Zyklen von Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden, jeweils Glühtemperatur für 30 Sekunden und Extension bei 72 ° C für 30 Sekunden. Die PCR Schwelle Taktzahl (CT) für jede Probe wurde an der Stelle, wo die Fluoreszenz über dem Grenzwert berechnet. Der Grenzwert wurde entlang der linearen logarithmischen Phase der Fluoreszenz-Kurven bei 10 bis 20 Standardabweichungen (SDs) über dem Durchschnitt Hintergrundfluoreszenz fixiert. Standardkurve Gleichungen wurden durch Regressionsanalyse der durchschnittliche CT gegenüber dem log10 der cDNA bezogen auf die gesamte RNA anwesend berechnet. Relativen Expression der Zielgene wurde 18S für Knochen-spezifische Gene normalisiert und b-Aktin wurde für Wnt-Signalweg-Gen verwendet.

6. In-vivo-Vorbereitung Gelfoam Composite-

  1. Mit aseptische Routinen wurden Gelschaum Zylinder (Pharmacia & Upjohn cat # 09-0353-01), 3 mm im Durchmesser von 8 mm in der Länge, erstellt mit selbst entworfenen Instrument.
  2. Vierundzwanzig Stunden vor der Operation wurden die Gelschaum Zylinder tränken beladene entweder mit L7 oder R1-Peptid (20 nM in PBS) oder PBS-Puffer ohne Peptid. Die Gelschaum Zylinder wurden in sterile 12-Well-Kulturschalen übertragen und über Nacht bei -4 ° C gelagert
  3. Zum Zeitpunkt der Operation wurden die Gelschaum Composite in Kulturschalen aus dem Kühlschrank verschoben und auf Eis gelegt, bis der Operation.

7. Knochendefekten

  1. Alle tierischen Verfahren wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Health System an der Universität von Virginia, bevor sie ausgeführt genehmigt. Zehn 9 Monate alten Erwachsenen syngenen männlichen Fischer 344-Ratten (350-400 g) wurden anästhesiert intraperitoneal mit einer Mischung aus Ketamin (50 g pro Gramm Körpergewicht) und Xylazin (5 g pro Gramm Körpergewicht).
  2. Ein bilaterales chirurgischen Ansatz war es, die ventromedial Tibia gemacht. Ratten in diesem Alter oder älter zeigen unbedeutende Zunahme der Querschnittsfläche, kortikalen Knochen Bereich, Knochenmasse, Knochendichte und axiale Länge des anteromedial Aspekt der Tibia. Eine große, längliche unikortikale Defekt wurde geschaffen, gemessen 3 mm breit und 8 mm lang mit einem pneumatischen Grat (Hall High Speed ​​Drill; Zimmer) unter Kochsalzlösung Bewässerung.
  3. Der Knochendefekt wurde mit Gelschaum entweder mit oder ohne Peptiden behandelt. Alle implantierten Gerüste, Mess-3 mm Breite von 8 mm Länge mit 1,5 mm Tiefe, wurden durch leichtes Klopfen eingefügt. Keine externe oder interne Gliedmaßen Fixierungsvorrichtungen wurden postoperativ eingesetzt und Tiere dürfen ohne Einschränkung ambulate unmittelbar nach der Operation.

8. Histologie und Morphometrie

Knochenregeneration wurde durch grobe Morphologie und digitale Bilder aufgenommen ausgewertet.

  1. Die Ratten wurden getötet und die Gebeine wurden bei 3 gesammelt, 5 und 12 Wochen in Höhe von neuem Knochen in Reaktion auf eine Verletzung erzeugt quantifizieren.
  2. Nach der Überprüfung der Knochendefekt sorgfältig wurden die geernteten Tibia in 10% neutral gepuffertem Formalin, entkalkt in RDO schnelle Entkalker für 72 Stunden, dann routinemäßig und verarbeitet in Paraffin eingebettet und geschnitten längs.
  3. Knochenregeneration wurde von Brutto-und lichtmikroskopische Untersuchung ausgewertet.
  4. Zehn Tiere wurden für jede Bedingung (dh leer Defekt Gelschaum allein, und Gelschaum sowie R1-Peptid) eingesetzt. Die 8mm unikortikale Defekt wurde auf ~ 40 Gewebeschnitte, die jeweils 8 um dicke vertreten war. Von diesen 40 Abschnitten haben wir ein Minimum von 6 Abschnitte, um die Menge an neuen Knochen zu quantifizieren.
  5. Alle Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin / Eosin (H & E), die Osteoid-Matrix-Etiketten gefärbt.
  6. Alle Folien wurden mikroskopisch ausgewertet.

9. Knochenreparatur

Überblick

Knochenheilung ist eindeutig ein sehr wichtiger Bereich der Betrachtung auf dem Gebiet der muskuloskeletalen Regeneration von Gewebe. Die Peptide, die auf Knochen erheblichen Nutzen in der Praxis für Orthopädische Chirurgie haben könnte, vor allem in der Verwendung von Prothesen, die über Jahre wenn nicht Jahrzehnte werden können Einwohnung. Die biomimetische Eigenschaften des Knochens tropic Faktoren könnten eine technologische Fortschritt auf dem Gebiet des Tissue Engineering, sowie für die prothetische Chirurgie der Knochen. Einbeziehung von Knochen Faktoren zielen in synthetische oder natürliche Polymere können helfen Spezifität Zelladhärenz, damit Aufräumen körpereigenen Zellen im Gewebe, die in Reparatur und Regeneration sind. Ein weiteres Ziel war es, festzustellen, ob unsere einzigartige Knochen Targeting-Peptide identifiziert durch in vivo Biopanning einer Phagen-Display-Bibliothek, um Zellen aus Knochen und Knochenmark isoliert binden würde, und haben das Potenzial zu modulieren Osteogenese in vitro-und Knochenregeneration in vivo.

In unseren Experimenten konnten wir die Peptide in femoralen Defekte in Ratten mit natürlichen und synthetischen Polymer-Matrices und Knochenregeneration durch Histologie, Biochemie, Genexpression, micro-CT und Biomechanik untersucht, um Details des Peptid-Aktivität auf die Knochenregeneration aufzuklären. Die Weiterentwicklung dieses Ansatzes kann sich der Entdeckung und Entwicklung von biologisch aktiven Verbindungen, die auf Knochen führen und potenzieren Reparatur durch Mechanismen, die gut charakterisiert sind biologisch auf zellulärer und molekularer Ebene.

Die Färbung

Die Peptide wurden mit Biotin-Etiketten synthetisiert, um verbindliche und Lokalisierung zu mesenchymalen Zellen zu bestimmen. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem Avidin verwendet wurde, um mikroskopisch lokalisieren die Bindung von Peptiden an Zellen in vitro gezüchtet. Die Peptide binden an mesenchymalen Zellen in Kultur als auch auf Knochen und Knochenmark in Maus Rippe Gewebeschnitten in vitro (Abbildung 1).

Von Kossa Färbung

Ein mesenchymalen Zellen (D1) wurde aus dem Knochenmark kloniert und verwendet, um die osteogene Wirkung von Peptiden auf Zellen in vitro zu bestimmen. Die Zellen wurden mit Peptiden L7 und R1 behandelt werden, um Veränderungen in der Zellmorphologie und der Genexpression zu bestimmen. Am Tag 4 waren die Zellen zu aggregieren begonnen, und die Aggregate mit der Zeit zu Knoten, eine Zelle Verhaltensmuster ähnlich Knochenzellen in Kultur (Abbildung 2) Form erweitert.

Die Zugabe von Peptid L7 oder R1 zu den Zellen verbessert Färbung der Kulturen mit von Kossa. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen von Peptid L7 oder R1 für bis zu 16 Tagen in Kultur behandelt. Es wurde festgestellt, dass 5 nM Peptid am effektivsten in vitro wurde. Alkaline Phosphatase-Aktivität in den Kulturen, die mit dem Peptid behandelt wurden, erhöhte sich von 2 bis 3,5-fache. Die Zunahme beruhte auf der Konzentration des Peptids und der Zeitpunkt der Behandlung in der Kultur.

Real-time PCR

Zellen mit L7 behandelt und R1 Peptide wurden mittels Real-Time PCR für die Genexpression von zwei bekannten Knochenzellen Transkriptionsfaktoren (Osterix und RUNX2) und drei Knochenmatrixproteine ​​(Bonesialoprotein, Osteocalcin und Kollagen Typ I). Die Behandlung mit R1 zeigten steigt in Osterix und RUNX2 Genexpression. Collagen Typ-1-Gen-Expression unverändert blieb. Die Behandlung mit L7 zeigten einen Anstieg der BSP und Osteocalcin Genexpression als auch die Expression des Typ I-Kollagen-Gen. Dies zeigt, dass beide Peptide eine Wirkung auf Gene, die zur Entstehung und Progression von Osteogenese in mesenchymalen Zellkulturen in Zusammenhang stehen.

Die Behandlung von In-vitro-Zellkulturen, die mit den Peptiden R1 und L7 hat eine anabole Wirkung in Bezug auf die Knochenbildung mit mesenchymalen Zellen ergab. Eine Erhöhung des Verhältnisses von Osteoprotegerin zu RANKL zeigt eine Abnahme in der Rekrutierung von den Knochen resorbierenden Zellen, die als Osteoklasten bekannt sind. Die Behandlung der Zellen mit den Peptiden führt auch zu einer Erhöhung der Expression von Genen, die mit Knochenbildung assoziiert sind und vermindert die Faktoren, die Osteogenese zu hemmen.

Histologie

Zur Bestimmung der Menge an Knochen, setzten wir die Scheiben der Knochen μLtraviolet Licht wodurch Autofluoreszenz. Dies sorgt für mehr Kontrast zwischen Knochen und Nicht-Knochengewebe zum Zweck der Quantifizierung 2. Die Schnitte wurden photographiert sowohl mit Hellfeld-und UV-Licht (Abbildung 3) eine Nikon und UV-Licht durch eine Nikon Digital-Imaging-System bei gleicher Vergrößerung (x10 Ziel). Die daraus resultierenden digitalen Bilder wurden mit Metavue Imaging-Software (Molecular Devices) analysiert. Wir entschieden uns für einen festen, rechteckigen region of interest (ROI), dass die 8 mm unikortikale Mangels enthalten. Die verletzte Stelle war immer in diesem ROI durch manuelle Platzierung der Box in die richtige Position auf jedem Bild vertreten. Die H & E-positive Pixel wurden teilweise automatisiert mit dem Zauberstab-Werkzeug-Set, um eine Farbe Toleranz. Diese Toleranz-Einstellung in markierten Pixel mit einer Reihe von Grün, das genau mit dem histologischen Erscheinungsbild des Knochengewebes in der H & E-gefärbten Schnitten entsprach geführt. Die Gesamtzahl der H & E-positive Pixel für jeden Abschnitt aufgenommen wurde. Die Pixelzahl aus einzelnen Abschnitten wurden für jede Tibia Probe gemittelt und die Unterschiede innerhalb und zwischen den Behandlungsgruppen wurden auf der Grundlage dieser Mittel berechnet. Die Bereiche, für alle Proben wurden dann auf die Höhe der neuen kortikalen Knochen (Abbildung 4) verglichen wird.

Das Vorhandensein von Knochen in den Abschnitten wurde quantifiziert, um Knochen zu reparieren in die Defekte mit Gelschaum + Peptid im Vergleich zu allein Gelschaum behandelt zu bestimmen. Mängel, die mit Gelschaum + R1 Peptid gefüllt wurden, zeigten den größten Anteil der kortikalen Reparatur mit einem 10, 7 und 2-fachen Anstieg bei 3, 5, 12 Wochen jeweils. Die Unterschiede in kortikalen Knochen Reparatur in der Gelschaum + Peptid mit Gelschaum allein verglichen wurden am deutlichsten bei 3 und 5 Wochen zeigen, dass das Peptid kortikalen Knochenregeneration (Abbildung 5) fördert.

10. Anabole Wirkung osteogene Peptide

Die OPG / RANKL-Verhältnis größer als das RANKL / OPG-Verhältnis, was bedeutet, dass die Peptide können eine direkte Wirkung auf Osteoblasten haben und zu regulieren Knochenresorption schlägt.

Synthetische Peptide können Vorteile gegenüber größeren Molekülen wie Geschwindigkeit der Vorbereitung, der molekularen Stabilität, lange Haltbarkeit und potenziell therapeutische Anwendungen. Bedeutende Fortschritte wurden in Versuche gemacht worden, zu modulieren Knochenverlust und Regeneration durch die Kontrolle Zytokine und Wachstumsfaktoren. Diese osteotrope Peptide können attraktive Alternativen zu den bestehenden Therapien, die Knochen Anabolismus und Knochenregeneration zu stimulieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Peptide die Bindung an Knochenmark und Knochen in der Maus Rippe Gewebeschnitt in vitro.

Abbildung 2
Abbildung 2. Mesenchymale Zellen (D1) bilden Knötchen nach Peptid-Behandlung.

Abbildung 3
Abbildung 3. Histologie der Knochenheilung durch osteogene Peptide, L7 und R1.

Abbildung 4
Abbildung 4. Knochenteile mit H & E unter UV-Licht, die Autofluoreszenz Ursachen gefärbt. Dies sorgt für mehr Kontrast zwischen Knochen und Nicht-Knochengewebe zur Quantifizierung Zwecke.

Abbildung 5
Abbildung 5. Quantifizierung der Knochen in der Histologie Abschnitte zeigten den größten Anteil der kortikalen Reparatur wurde in 5 Wochen miteine 10-fache Veränderung, 7 und 2-fach bei 3 und 5 Wochen zeigen, dass das Peptid kortikalen Knochen Regeneration fördert.

Disclosures

Die Produktion dieses Video wurde von New England Biolabs, Inc., die einige der Reagenzien in diesem Artikel verwendet produziert gesponsert.

Acknowledgements

National Institutes of Health, AR53579, Osteogenesis: Eine Verstärkung mit Bone Tropic Peptides
National Institutes of Health, AR056422, anabole Wirkung osteogene Peptide
National Institutes of Health, T32 AR050960, Muskel-Skelett-Tissue Repair and Regeneration
DOD, PC051219 Nucleolin: A Novel Mediator des Prostate Cancer and Bone Marrow Endothelial Cell Adhesion
Department of Defense, PC061508, Prostatakrebs Metastasen Cell-Bone Marrow Haftvermittler

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12 New England Biolabs E8110S

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References

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Comments

1 Comment

  1. I am researching a defect in the Alps ²0 model, lower extremity sleeve. My client was weaing it when the bolt and locking mechanism gave way. The bolt stayed connected to the artificial limb, which disconnected from my client's stump. He took a nasty fall and was seriously injured. A few weeks later, he was wearing another Alps ²0 (not the same one that had failed, but the same model) and the same thing happened. DŒs anyone have any information about this or experienced the same or similiar problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2011 - 3:36 PM

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