Всего записей сотовый от мозга взрослого дрозофилы

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов с использованием стандартных технологий целом клетки. Она включает в себя образы GFP меченых клеток и нейронов рассматриваться во время записи.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248, doi:10.3791/248 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В этом видео мы продемонстрируем процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов. Мы начнем с описания рассекает решение и захвата взрослые самки, используемые в наших исследованиях. Процедура снятия весь мозг неповрежденным, в том числе и оптических долях, проиллюстрировано. Препарирование вышележащих трахеи также показано на рисунке. Изолированных мозг не только малой, но нуждается в особом уходе в обработке на данном этапе, чтобы предотвратить повреждение нейронов, многие из которых близки к внешней поверхности ткани. Мы покажем, как специальный держатель мы разработали для стабилизации мозга в записи камеры. Стандартный электрофизиологии создали используется для записи с отдельных нейронов или пары нейронов. Флуоресцентные изображения, рассматривается через микроскоп записи, от GAL4 линии вождения GFP выражение (GH146) показывает, как проекционных нейронов (PNS) отмечены в живой мозг. Высокая мощность Номарского изображение показывает зрения одного нейрона, которые преследуют за весь записи клетки. Когда мозг успешно удален без повреждения, большинство нейронов спонтанно активных, выпустив потенциалов действия и / или экспонирование спонтанных синаптических входа. Это, в месте подготовки, в котором все записи ячейки определили нейронов в мозг целиком могут быть объединены с генетических и фармакологических манипуляций, является полезной моделью для изучения клеточной физиологии и пластичность во взрослой ЦНС.

Protocol

I. Препарирование мозга от взрослых летать

  1. Нанесите небольшое снижение (~ 100 мкл) рассекает решение в центре 35 мм чашки Петри.
  2. Поймать взрослую самку использовании аспиратора. Под микроскопом рассекает, используйте две иглы шприца обезглавить летать.
  3. Место голову в небольшую каплю рассекает физиологического раствора (папаин с нами) в чашке Петри.
  4. Позиция головы с хоботком перед нижней части блюда.
  5. Держите кутикулы покрытие левого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, просто медиальнее иглы 1.
  6. Держите ротовые с иглой 1 и использования иглы 2, чтобы сделать горизонтальный разрез, который простирается от брюшной поверхности левым глазом в правый глаз, на уровне основания хоботка.
  7. Держите кутикулы покрытие правого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, только медиальной иглы 1.
  8. Повернуть голову так, чтобы ростральной сторона лежит на поверхности чашки Петри. Вставьте иглу 1 между ростральной кутикулы и головного мозга, а также использовать иглу от 2 до следуют тем же путем, что и первый иглу. В идеале, капсула будет кожуру от мозга с обеих оптических долях прилагается так как они имеют важное значение в стабилизации мозга для записи.
  9. Трахеи, воздушные мешки, и других соединительных тканей, тщательно удаляют с помощью двух прекрасных щипцы чаевые.
  10. Всего вскрытие должно 3-10 минут

II. Монтаж ЦНС

  1. Мозг переходит к записи камеры использованием желтого пипетки чаевые.
  2. В записи камеры, мозг стабилизируется путем размещения платины кадр так, что два прекрасных волос крест в контакт с тканью на стыке между оптическими доли и центральной области мозга.
  3. Каждый мозг имеет право отдыхать в записи камеры с непрерывной перфузии с кислородом солевой (95% кислорода и 5% углекислого газа), по крайней мере 10 минут. Перфузии камере с кислородом физиологического раствора продолжалась в течение периода записи. Подготовка визуализируется использованием прямой микроскоп (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Германия) с фиксированной сцене и 40x цель погружения воды (Achroplan; числовой апертурой, 0,8; Zeiss) и Номарского оптики. GFP был просмотрен с БП 505-530 флуоресценции фильтр.

III. Электрофизиология

  1. Пипец в 8-14 МОм используются для записи целого клетка
  2. Текущий зажим и напряжения зажим записи выполняются с помощью Список EPC7 или Axopatch 200B усилитель, DIGIDATA 1322A цифро-аналоговый преобразователь (Molecular Devices, Foster City, CA), Dell Dimension 8200 компьютеров (Dell Computer, Раунд-Рок, штат Техас), и pClamp 9 программное обеспечение (Molecular Devices).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изолированных целом подготовка мозга мы проиллюстрируем в этом видео позволяет оценить сотовой механизмы, лежащие возбудимости и синаптической передачи в выявленных нейронов, в том числе в обонятельных путей обработки, во взрослом мозге дрозофилы (Gu и О Дауд, 2006). Такой подход является дополнительным к изучению активности нейронов в мозге интактных взрослых дрозофил (Wilson и др. все 2004), во многом так же записи пути из нейронов в мозге млекопитающих, ломтик дополняют записи в себя бодрствовать млекопитающих. Существуют два основных преимущества на месте подготовки мозга летать, когда по сравнению с млекопитающих ломтиками. Первый весь мозг летать легко помещается в записи камеры, так что нет необходимости акцизного небольшой кусочек ткани из большего нейронные цепи, происходит при принятии млекопитающих ломтики мозга. Поэтому нейронные схемы в изолированных мозга Drospohila остаются в основном неизменными. Во-вторых, клеточные тела большинства нейронов находятся вблизи поверхности мозга, легко доступной для всей записи ячейки и они остаются функционально активными при непрерывной перфузии с кислородом физиологический раствор в течение нескольких часов.

Использование записи со стеклянным дном камеры также позволяет идентифицировать специфические нейроны на основе их местоположения и / или GFP выражения. В этой подготовке, записи во время перфузии требует стабилизации мозга. Это не совместимо со стандартными процедурами, в том числе стратегически расположенных золотой проволоки или нейлона сетки, которые являются эффективными для тканей, таких как срезах гиппокампа, в связи с небольшим размером всего головного мозга (~ 1 мм). Поэтому мы предназначены держателя с рамкой платины и нейлона перекрестие возможности для контакта мозга только в двух местах, чтобы минимизировать повреждение нейронов, расположенных вблизи поверхности мозга. Это стабилизирует мозга, либо с передней или задней поверхности вверх и противоположной поверхности только слегка опираясь на этаже записи камеры. С помощью этого устройства мы можем регулярно поддерживать стабильные целом записи ячейки на срок до часа, даже от небольших нейронов в том числе Кеньон клеток, при этом фармакологических манипуляций, которые требуют ванны применения конкретных препаратов. Держатель должен также быть полезными в обеспечении другие небольшие образцы ткани для электрофизиологических исследований, таких как спинной ломтиками шнур от новорожденных грызунов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы была предоставлена ​​программа HHMI профессор Грант DKOD.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#5 Foceps Tool Fine Science Tools No. 11251-10 Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain Reagent Worthington Biochemical 3126 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope SMZ-2B Model:C-PS Nikon Instruments Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co 305175 & 309602 Cheap and durable
Upright microscope Axioskop2 FS plus Carl Zeiss, Inc. Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier 200 B Molecular Devices
Digidata D-A converter 1322A Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
  2. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).

Comments

5 Comments

  1. As a fly researcher with no prior experience in electrophysiology, I intend to set-up the necessary facility, gain skill and subsequently implement, in our ongoing Drosophila neuropharmacogenomic modeling work, recording from brains of intact organism as well as from single neurons from isolated brain as described in the present paper. In this backdrop, I would like to know if the materials and devices mentioned in this paper would be sufficient for recording from brains of intact organism. If not, what else will be required? Where from one can obtain them? Kindly also suggest alternative suppliers, if any, for material and devices that have already been successfully used in intact organism and single neuron recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2007 - 6:50 AM
  2. We have not recorded from brains in intact Drosophila with our equipment but I believe the set up we describe in this video is very similar to that used by Rachel Wilson and her colleagues at Harvard who are recording from intact organisms. In our lab we use both the Axon Instruments and List patch clamp amplifiers and they both work well. We have only used the Zeiss upright microscope.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2007 - 8:09 PM
  3. Is it possible to obtain or buy the designed holder (platinum frame and nylon cross hairs)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 14, 2010 - 11:50 PM
  4. We make these in the lab. You just need a short piece of platinum wire. Bend to shape you want. Use nylon hairs glued to wire with super glue. Nylon fibers are from a fine nylon mesh. We make under microscope and the nylon fibers are stretched over frame, taped on either side so they are tight, and then super glue applied to frame over the fiber. Each fiber glued in place allowed to dry before next one put on. Then trim all excess at end.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 15, 2010 - 7:43 PM
  5. What is the diameter of the platinum wire? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2015 - 12:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics