Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu video standart tüm hücre teknolojisini kullanarak tek nöronlar kayıt için hazırlık yetişkin Drosophila tüm beyinleri izole etmek için prosedürü göstermektedir. Bu kayıt sırasında görüntülenen GFP etiketli hücreleri ve nöronlar görüntülerini içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248, doi:10.3791/248 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video, tek bir nöron kayıt için hazırlık yetişkin Drosophila tüm beyinleri izole etmek için prosedürü göstermektedir. Biz diseksiyon çözüm ve çalışmalarda kullanılan yetişkin dişiler yakalama anlatarak başlar. , Hem de optik loblar da dahil olmak üzere, bütün beyin sağlam kaldırarak için prosedür gösterilmiştir. Üstteki trakea Diseksiyon de gösterilir. Izole beyin sadece küçük değil, ama bu aşamada ele nöronlara zarar görmesini önlemek için özel bakım ihtiyacı olan birçok dokusunun dış yüzeyine yakın. Biz, bizim geliştirdiğimiz özel bir tutucu kayıt odasında beyin stabilize etmek için nasıl kullanıldığını gösteriyor. Standart bir elektrofizyoloji kadar, tek bir nöron nöron veya çift kayıt için kullanılır. Bir floresan görüntü kayıt mikroskobu (GH146) projeksiyon nöronları (PNS) canlı beyinde nasıl tanımlanır göstermektedir GFP ifade sürüş GAL4 hattı üzerinden izlenebilmektedir. Yüksek güç Nomarski görüntü tüm hücre kayıt için hedeflenen tek bir nöronun bir görünümdür. Beynin zarar vermeden başarılı bir şekilde kaldırıldığı zaman, nöronların çoğunluğu aksiyon potansiyelleri ve / ateş veya kendiliğinden sinaptik giriş sergileyerek, kendiliğinden aktif. Bu, tüm beyin tespit nöronları tam hücre kayıt farmakolojik ve genetik manipülasyonlar ile kombine edilebilir hangi yerinde hazırlanması, yetişkin MSS hücresel fizyolojisi ve plastisite keşfetmek için yararlı bir model.

Protocol

Erişkin sinek I. beyin Diseksiyon

  1. 35 mm Petri kabında merkezi çözüm diseksiyon küçük bir damla (~ 100 ul) yerleştirin.
  2. Aspiratörü kullanarak yetişkin dişi yakalayın. Diseksiyon mikroskobu altında, sinek başını kesmek için iki şırınga iğneleri kullanın.
  3. Petri kabındaki tuzlu su diseksiyon küçük bir damla (papain eklenmiş) yerleştirin baş.
  4. Çanak alt bakan burnumun ile pozisyon kafa.
  5. 1 iğne ile sol bileşik göz kapsayan manikür tutun. 2, sadece 1 iğne medial iğne ile ventral dorsal uzanan diyagonal bir kesim olun.
  6. 1 iğne ile ağız tutun ve iğne 2 burnumun temel seviyesinde, sağ göz sol göz ventral uzanan yatay bir kesim yapmak için kullanabilirsiniz.
  7. 1 iğne ile doğru bileşik göz kapsayan manikür tutun. Iğne 2, iğne 1 sadece medial dorsal ventral yüzeyine uzanan bir çapraz kesim olun.
  8. Rostral tarafında Petri kabı yüzeyinde böylece baş döndürün. Rostral manikür ve beyin arasındaki yerleştirin, iğne 1 ve iğne 2 kullanmak ilk iğne olarak aynı yolu takip etmek. İdeal olarak, kapsül, kayıt için beyin stabilize önemli olan bu yana bağlı iki optik loblar ile beyin kabuğu olacaktır.
  9. Trakea, hava kesesi ve diğer bağ dokuları dikkatle iki ince uçlu forseps kullanarak kaldırılır.
  10. Tüm diseksiyonu 3-10 dakika sürer

II. MSS Montaj

  1. Beyin sarı bir ucu pipetlemeyin kullanarak kayıt odasına aktarılır.
  2. Kayıt odasına, beyin, iki ince çapraz kıllar, optik loblar ve merkezi beyin bölgesi arasındaki kavşakta doku ile temas kurmaya platin çerçeve koyarak stabilize edilir.
  3. Her beyin oksijenli tuzlu su ile sürekli perfüzyon (% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit) en az 10 dakika süreyle kayıt odasında dinlenmek için izin verilir. Oksijenli salin ile odasının Perfüzyon kayıt dönemi boyunca devam eder. Ve Nomarski optik sabit bir sahne ve 40x suya daldırma hedefi (; sayısal diyafram, 0.8 Zeiss Achroplan); Hazırlık dik bir mikroskobu (Zeiss, Oberkochen, Almanya Axioskop 2FS) kullanılarak görüntülenmiştir. GFP BP 505-530 floresan filtre ile görüntülenebilir.

III. Elektrofizyoloji

  1. 8-14 Mohms pipetleri tüm hücre kayıtları için kullanılır.
  2. Akım-kelepçe ve voltaj-klemp kayıtları Listesi EPC7 veya Axopatch 200B amplifikatör, Digidata 1322A DA dönüştürücü (Moleküler Aygıtlar, Foster City, CA), bir Dell Dimension 8200 bilgisayar (Dell Computer, Round Rock, Teksas), kullanılarak yapılmaktadır ve 9 yazılımı (Moleküler Aygıtları) pClamp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu video göstermek izole tüm beyin hazırlama uyarılabilirlik ve yetişkin Drosophila beyin (Gu ve O Dowd, 2006), koku işleme yolları da dahil olmak üzere tespit nöronlar, sinaptik iletim altında yatan hücresel mekanizmaları değerlendirme sağlar. Bu yaklaşım, uyanık davranmak memeliler kayıtları tamamlayıcı memeli bir beyin dilim nöronların kadar aynı şekilde kayıtları, bozulmamış yetişkin Drosophila (Wilson ve ark 2004) beyindeki nöronal aktivitenin çalışma tamamlayıcı. Memeli dilimlerine göre yerinde sinek beyin hazırlanmasında iki önemli avantajı vardır. ÖTV memeli beyin dilimleri yaparken oluşan daha büyük bir nöral devre küçük bir parça doku için gerekli değildir Öncelikle tüm sinek beyin kayıt odasına kolayca uyum sağlar. Bu nedenle izole Drospohila beynin içinde nöronal devrelerin büyük ölçüde sağlam kalır. İkincisi, nöronların çoğunun hücre gövdeleri, beyin yüzeyine yakın tüm hücre kayıt için kolayca erişilebilir ve sürekli, birkaç saat için oksijenli serum fizyolojik ile perfüze fonksiyonel etkin kalır.

Bir cam alt kayıt odası da kendi konumu ve / veya GFP ifade temelinde özel nöronların kimlik sağlar. Bu hazırlık, perfüzyon sırasında kayıt beyin istikrar gerektirir. Bu, tüm beyin (~ 1mm) küçük boyutu nedeniyle hipokampal dilimleri gibi dokular için etkili stratejik olarak yerleştirilmiş altın tel veya naylon mesh de dahil olmak üzere standart prosedürler,, ile uyumlu değildir. Bu nedenle bir platin çerçeve ve beynin yüzeyine yakın bulunan nöronların hasarı en aza indirmek için sadece iki yerlerde beyin irtibata yerleştirilmiş naylon çapraz kıllar ile tasarlanmış tutucu. Bu, ya yukarı bakacak şekilde ön veya arka yüzeyi ve karşıt yüzey sadece hafifçe kayıt odasının zemin üzerine oturtulmuş, beyin dengeler. Bu cihazı kullanırken, spesifik ilaçların banyo uygulaması gerektiren farmakolojik manipülasyonlar yaparken rutin bile Kenyon hücreleri de dahil olmak üzere küçük bir nöron, bir saat kadar istikrarlı tüm hücre kayıtları korumak için mümkün. Yenidoğan kemirgenler omurilik dilimleri gibi elektrofizyolojik çalışmalar için küçük doku örnekleri güvence sahibi de yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma için bir NIH hibe DKOD NS27501 tarafından desteklenmiştir. HHMI Profesör DKOD Programı Hibe tarafından bu iş için ek destek sağlanmıştır.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#5 Foceps Tool Fine Science Tools No. 11251-10 Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain Reagent Worthington Biochemical 3126 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope SMZ-2B Model:C-PS Nikon Instruments Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co 305175 & 309602 Cheap and durable
Upright microscope Axioskop2 FS plus Carl Zeiss, Inc. Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier 200 B Molecular Devices
Digidata D-A converter 1322A Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
  2. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).

Comments

5 Comments

  1. As a fly researcher with no prior experience in electrophysiology, I intend to set-up the necessary facility, gain skill and subsequently implement, in our ongoing Drosophila neuropharmacogenomic modeling work, recording from brains of intact organism as well as from single neurons from isolated brain as described in the present paper. In this backdrop, I would like to know if the materials and devices mentioned in this paper would be sufficient for recording from brains of intact organism. If not, what else will be required? Where from one can obtain them? Kindly also suggest alternative suppliers, if any, for material and devices that have already been successfully used in intact organism and single neuron recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2007 - 6:50 AM
  2. We have not recorded from brains in intact Drosophila with our equipment but I believe the set up we describe in this video is very similar to that used by Rachel Wilson and her colleagues at Harvard who are recording from intact organisms. In our lab we use both the Axon Instruments and List patch clamp amplifiers and they both work well. We have only used the Zeiss upright microscope.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2007 - 8:09 PM
  3. Is it possible to obtain or buy the designed holder (platinum frame and nylon cross hairs)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 14, 2010 - 11:50 PM
  4. We make these in the lab. You just need a short piece of platinum wire. Bend to shape you want. Use nylon hairs glued to wire with super glue. Nylon fibers are from a fine nylon mesh. We make under microscope and the nylon fibers are stretched over frame, taped on either side so they are tight, and then super glue applied to frame over the fiber. Each fiber glued in place allowed to dry before next one put on. Then trim all excess at end.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 15, 2010 - 7:43 PM
  5. What is the diameter of the platinum wire? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2015 - 12:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics