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प्रसव के बाद मस्तिष्क में एक उच्च संकल्प Neuronal प्रवासन के समय चूक इमेजिंग के लिए Organotypic स्लाइस परख

Neuroscience

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Summary

यह एक organotypic टुकड़ा परख प्रसवोत्तर और व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा में उच्च संकल्प neuroblast प्रवास के समय चूक इमेजिंग मस्तिष्क के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

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Jacquet, B. V., Ruckart, P., Ghashghaei, H. T. An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain. J. Vis. Exp. (46), e2486, doi:10.3791/2486 (2010).

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Abstract

पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, neuroblasts के प्रवास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भेदभाव और तंत्रिका सर्किट मौजूदा में नए न्यूरॉन्स के एकीकरण के प्रसार: प्रसव के बाद मस्तिष्क में Neurogenesis तीन जैविक घटनाओं के रखरखाव पर निर्भर करता है. घ्राण बल्ब में प्रसवोत्तर neurogenesis के लिए, इन घटनाओं को तीन anatomically अलग डोमेन के भीतर अलग - अलग हैं: प्रसार काफी हद तक पार्श्व ventricles के subependymal क्षेत्र (एसईजेड) में होता है, पलायन neuroblasts व्याख्यान चबूतरे वाला प्रवासी धारा (आरएमएस) के माध्यम से पार, और नए न्यूरॉन्स अंतर और घ्राण बल्ब (ओ) के भीतर एकीकृत. तीन डोमेन आदर्श प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करने के लिए सेलुलर, आणविक और शारीरिक तंत्र है कि जैविक घटनाओं में से प्रत्येक साफ़ विनियमित अध्ययन. यह कागज एक organotypic टुकड़ा प्रसव के बाद मस्तिष्क के ऊतकों के लिए अनुकूलित परख, जिसमें कोशिकी शर्तों निकट vivo वातावरण में neuroblasts पलायन करने के लिए नकल का वर्णन करता है. हम बताते हैं कि हमारे परख आरएमएस के भीतर neuroblasts की वर्दी, उन्मुख है, और तेजी से आंदोलन के लिए प्रदान करता है. यह परख अत्यधिक सेल अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर चूहों से पार प्रत्यारोपण दृष्टिकोण का उपयोग करके neuronal प्रवास के स्वायत्त और गैर स्वायत्त विनियमन के अध्ययन के लिए उपयुक्त हो जाएगा.

Protocol

मैं प्रक्रिया

निम्नलिखित तकनीक बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया जाना चाहिए, एक लामिना का प्रवाह हुड में, निष्फल उपकरण का उपयोग कर.

गिलास नीचे व्यंजन के organotypic स्लाइस के लिए तैयार

  1. व्यंजन बाँझ वातावरण में तैयार किया जाना चाहिए और निष्फल उपकरण का उपयोग कर.
  2. टुकड़ा के माध्यम से एक 150μL ड्रॉप (व्यंजनों देखें) देखभाल के साथ पकवान मध्यम में हवाई बुलबुले से बचने का हिस्सा गिलास नीचे के केंद्र में रखा गया है.
  3. परिपत्र coverslip कि पकवान संस्कृति के केंद्र में रह रहे हैं करने के लिए आसन्न वर्ग किनारे पर रखा जाता है, जबकि एक unglued ओर जा - एक डिस्पोजेबल सिरिंज एक 23 गेज सुई, गोंद के कई स्थानों (है Elmer, बिल्ली E904 # रबर सीमेंट) के साथ सुसज्जित के साथ तरल पदार्थ के आदान प्रदान के लिए (चित्रा 1). गोंद के प्रकार सूचीबद्ध स्लाइस या कोशिकाओं के रूप में इस प्रोटोकॉल में लागू करने के लिए विषाक्त नहीं है. देखभाल के गिलास को कवर पर्ची पर किसी भी गोंद रखने के रूप में इस पर टकराना और इमेजिंग स्लाइस की बाद में बाधा डालती से बचने के लिए दिया जाना चाहिए. एक nucleopore झिल्ली (25mm व्यास, रोमकूप आकार 8.0μm - वाटमान, बिल्ली 110,614 #) कांच coverslip के शीर्ष पर रखा है, गोंद स्पॉट का उपयोग करने के लिए यह जगह में सुरक्षित है. यह एक माइक्रो संदंश का उपयोग किया जाना चाहिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि हवा बुलबुले कांच coverslip और झिल्ली के बीच में नहीं फंस रहे हैं.
  4. झिल्ली के शीर्ष पर 1 एमएल टुकड़ा मध्यम जोड़ें. व्यंजन एक मशीन में 30 मिनट के लिए और फिर बर्फ पर रखा जाता है, जब तक का उपयोग करने के लिए तैयार है,.

जल्दी प्रसव के बाद दिमाग का निकालना

जब स्लाइस युवा प्रसव के बाद चूहों (P1-P10) से तैयार कर रहे हैं सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं.

  1. Pups टर्मिनली isofluorane या अन्य अनुमोदित विधियों द्वारा anesthetized (overdosed) कर रहे हैं. सिर 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जा सकता है बाँझपन में वृद्धि, तेजी से तेज कैंची का उपयोग कर कत्ल के द्वारा पीछा किया.
  2. सिर सूक्ष्म संदंश के साथ जबड़ा clamping के द्वारा स्थिर है. त्वचा longitudinally गर्दन से थूथन excised है. खोपड़ी longitudinally और पूर्व से कट जाता है cisterna मैग्ना में शुरू एक औसत दर्जे का है और 2 पार्श्व में कटौती (प्रत्येक पक्ष पर - चित्रा 2A) बनाकर. केयर अंतर्निहित cortical ऊतक के साथ संपर्क को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए के रूप में कपाल फ्लैप मस्तिष्क से दूर हटा रहे हैं.
  3. Vibratome सेक्शनिंग दौरान ऊतक की स्थिरता में सुधार करने के लिए, मस्तिष्क के सबसे पार्श्व पहलुओं दो बाण के समान कटौती करने से हटा रहे हैं. मस्तिष्क की दुम का पहलू भी सेरिबैलम (चित्रा 2B) के व्याख्यान चबूतरे वाला आधार पर एक कट बनाने के द्वारा हटा दिया जाता है.
  4. दो गोलार्द्धों के midline विदर के साथ एक चिकनी कटौती करके अलग कर रहे हैं, और दोनों गोलार्द्धों ध्यान से खोपड़ी के बाहर पकड़े जाते और रखा, नीचे औसत दर्जे की सतह, एक embedding के सांचे में (Figs. 2C - डी).

मेजबान मस्तिष्क के सेक्शनिंग

  1. embedding के सांचे में दो गोलार्द्धों के तुरंत पिघला 3% कम पिघलने बिंदु डीएनए ग्रेड agarose जेल (फिशर, बिल्ली # BP1360-100) ऊतक तैयारी बफर है कि 37 डिग्री सेल्सियस (व्यंजनों देखें) पर बनाए रखा है में भंग के साथ कवर कर रहे हैं. एक फ्लैट क्षैतिज सतह पर 2 मिनट स्थिरीकरण के भी agarose की सख्त सुनिश्चित बाद, molds बर्फ पर तैनात कर रहे हैं करने के लिए सेटिंग को पूरा करने के लिए.
  2. एक बार गोलार्द्धों युक्त जेल सेट कर दिया जाता है, यह मोल्ड से निकाल दिया जाता है और छंटनी की, मस्तिष्क के ऊतकों के आसपास जेल के 2-3mm जा.
  3. जेल - एम्बेडेड ऊतक तो vibratome का नमूना डिस्क पर रखा है, औसत दर्जे की सतह के साथ, और cyanoacrylate चिपकने वाला (Krazy गोंद या समकक्ष) के साथ सुरक्षित. देखभाल करने के लिए गोंद का केवल न्यूनतम मात्रा में लागू करने के लिए लिया जाना चाहिए, के रूप में बहुत ज्यादा स्लाइस और पलायन कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव पड़ेगा. ब्लॉक के पक्षों पर बहुत ज्यादा गोंद भी काटने बाधित होगा, ऊतक में संभावित क्षति के कारण.
  4. डिस्क vibratome नमूना ठंडा ऊतक तैयारी के माध्यम से भरा ट्रे में स्थापित किया गया है.
  5. 150μm मोटाई में sectioned ऊतक है, vibratome एक धीमी गति से मध्यम रेंज पर निर्धारित गति के साथ (प्रयुक्त vibratome पर निर्भर करेगा, और इस प्रकार इष्टतम परिणामों के लिए स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए). हमारे हाथों में कंपन आवृत्ति इष्टतम है जब अधिकतम पर सेट है. पहले कुछ स्लाइस खारिज किया जा सकता है.
  6. जैसे ही आरएमएस - युक्त स्लाइस ब्लेड (आरएमएस एक ग्रे U-आकार की संरचना एसईजेड से ओ विस्तार के रूप में नग्न आंखों से दिखाई देता है) से जारी कर रहे हैं, वे ध्यान से जेल आचारण के बाहर हैं छेड़ा, और पकड़े जाते एक छोटे फ्लैटहेड रंग का उपयोग कर. स्लाइस गिलास नीचे टुकड़ा मध्यम (चित्रा 3A बी) युक्त व्यंजनों की nucleopore झिल्ली पर रखा जाता है. एक ठेठ जल्दी प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क लगभग 2-3 गोलार्द्ध प्रति RMS वर्गों को उपज जब 150 सुक्ष्ममापी में कटौती करेंगे. यह महत्वपूर्ण है कि स्लाइसें से निपटने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाता है के रूप में वे बहुत नाजुक हैं. स्लाइस के साथ व्यंजन तो एक मशीन को हस्तांतरित कर रहे हैं.

दाता मस्तिष्कसेक्शनिंग और आरएमएस प्रत्यारोपण

  1. दाता दिमाग (neuroblasts पलायन में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त दिमाग) 250μm मोटाई में sectioned हैं और स्लाइसें ठंडा ऊतक तैयारी बफर में एकत्र कर रहे हैं.
  2. स्लाइसें तुरंत epifluorescence क्षमता के साथ एक विदारक खुर्दबीन के नीचे रखा जाता है, और धीरे आरएमएस, microdissected सूक्ष्म संदंश का उपयोग. एक संदंश टुकड़ा स्थिर जबकि अन्य आरएमएस के आसपास छोटे कटौती बनाने के लिए जब तक यह टुकड़ा से जारी है के लिए प्रयोग किया जाता है प्रयोग किया जाता है. excised आरएमएस तो छोटे (व्यास में लगभग 200-500 सुक्ष्ममापी) explants प्रत्यारोपण करने से पहले में कटौती है.
  3. नीचे ग्लास मेजबान nucleopore फिल्टर पर तैनात स्लाइस युक्त व्यंजन इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं और विदारक खुर्दबीन के नीचे रखा. दृश्य प्रकाश का प्रयोग, आरएमएस स्पष्ट रूप से और पहचान की है एक छोटा सा चीरा आरएमएस के प्रारंभिक खंड में किया जाता है.
  4. एक एक 20 μL टिप के साथ सुसज्जित pipettor का उपयोग, एक एकल दाता आरएमएस explant मेजबान आरएमएस में छिन्न साइट के लिए स्थानांतरित कर रहा है. explant धीरे चीरा में धकेल दिया है 2 ऊतकों के बीच संपर्क स्थापित करने के लिए. यह सुनिश्चित करने के लिए इस संपर्क स्थिर है, explants थोड़ा टुकड़ा और nucleopore झिल्ली के बीच में धकेल रहे हैं.
  5. एक बार RMS के साथ सभी मेजबान स्लाइस प्रतिरोपित कर रहे हैं, बर्तन इनक्यूबेटर करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए लौट रहे हैं वर्गों झिल्ली पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. Neuroblasts मेजबान लगभग 1-2 घंटे के बाद आरएमएस में explant से विस्थापित शुरू करना चाहिए.

Neuronal प्रवास के समय चूक इमेजिंग

  1. गिलास नीचे व्यंजनों इनक्यूबेटर से खुर्दबीन पर incubated चैम्बर (चित्रा 3C) को हस्तांतरित कर रहे हैं. प्रतिदीप्त neuroblasts 0 से 10 वांछित विश्लेषण के प्रकार पर निर्भर करता है मिनट के लिए लेकर अंतराल पर imaged किया जा सकता है. उदाहरण के लिए कम से कम या 2.5 मिनट के लिए बराबर हमारे अंतराल सेटिंग के द्वारा व्यक्ति neuroblasts के प्रवासी चक्र के दौरान हम cytoskeletal गतिशीलता छवि. हालांकि, अभिविन्यास और प्रवास की गति जैसे जनसंख्या गतिशीलता बेहतर 5 से 10 मिनट से लेकर अंतराल पर कब्जा कर रहे हैं. उद्देश्यों की पसंद माइक्रोस्कोप के ब्रांड के आधार पर अत्यधिक परिवर्तनशील है. एक Nikon C1 confocal खुर्दबीन के लिए, हम पाते हैं कि 20x सूखी लेंस (Nikon पान Fluor, 0.75 एनए, WD 0.35mm) हमारे विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है. इस confocal सिस्टम पर सर्वोत्तम परिणामों के लिए, pinhole एक मध्यम आकार (60μm व्यास) के लिए खोला जाता है. सबसे उपयुक्त प्रवासी व्यवहार के लिए, इमेजिंग आरएमएस की मोटाई के भीतर गहरे कोशिकाओं तक ही सीमित है, कम से कम 20 सुक्ष्ममापी के किसी भी टुकड़ा की कटौती सतहों से दूर. लेजर शक्ति अनुकूलित किया जा इतना है कि यह एक कम से कम है, लेकिन है कि व्यक्तिगत neuroblasts के विवरण दिखाई रहते हैं.
  2. स्लाइस एक बार इमेजिंग पूरा हो गया है बर्फ का ठंडा के साथ तय किया जा सकता है, और हौसले से 4% paraformaldehyde तैयार, immunostained, और आगे इमेजिंग के लिए स्लाइड्स पर मुहिम शुरू की. चूंकि हम laminin के रूप में किसी भी पक्षपाती substrates के साथ हमारे झिल्ली कोट नहीं, स्लाइस आम तौर पर झिल्ली से तैर एक बार वे धुंधला बफ़र्स में डूब रहे हैं. धारा जबकि उनके 150 सुक्ष्ममापी मोटाई बनाए रखने imaged हैं. यह भी संभव है स्लाइस cryopreserve और स्थिर और cryostat का उपयोग करने के लिए मूल स्लाइस की पतली वर्गों प्राप्त है. हालांकि, यह धुंधला हो जाना के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊतक की अखंडता को बदलने में कलाकृतियों की घटनाओं में वृद्धि में परिणाम होगा.

द्वितीय. सामग्री / उपकरणों

गिलास नीचे व्यंजन के organotypic स्लाइस के लिए तैयार

  • लघु सीरिंज (1 एमएल)
  • 23 गेज सुई
  • Nucleopore झिल्ली ट्रैक नक़्क़ाशी - व्यास 25mm, ध्यान में लीन होना आकार 8.0μm वाटमान, बिल्ली 110614 #
  • ग्लास नीचे संस्कृति व्यंजन - 35 मिमी पेट्री डिश, 14mm microwell, सं 1.5 coverglass - MatTech # बिल्ली P35G 1.5 14 - सी
  • - रबर सीमेंट है Elmer, बिल्ली E904 #
  • बेसल मध्यम ईगल - Gibco, 21010 # बिल्ली
  • 1M Hepes (pH7.4)
  • डी - ग्लूकोज 1M
  • 100mm 2 CaCl
  • 100mm 4 MgSO
  • 1M 3 NaHCO
  • DH 2 हे
  • एल glutamine 200mm
  • पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन

ब्रेन निष्कर्षण और एम्बेडिंग

  • चतनाशून्य करनेवाली औषधि (isofluorane, आदि)
  • माइक्रोवेव ओवन
  • कम पिघलने agarose - फिशर, बिल्ली # BP1360-100
  • Krazy गोंद - बिल्ली KG585 #
  • पील एक मार्ग प्रयोज्य एम्बेडिंग (नि. 40) Molds - 22mmx40mm आयताकार, गहरी 20mm - Polysciences, # बिल्ली 18646C

ब्रेन सेक्शनिंग और आरएमएस प्रत्यारोपण

  • Vibratome - Leica VT1000S और टुकड़ा तैयार करने के लिए सभी गौण घटकों
  • 10X हांक बैलेंस्ड नमक समाधान - Gibco, बिल्ली 14185 #
  • Microdissecting # 5 संदंश - Roboz, बिल्ली # 4976 रुपये
  • Microspatula - फिशर, बिल्ली 21-401-15 #
  • Stereomicroscope

समय चूक की इमेजिंगorganotypic स्लाइस

  • Humidified मशीन, 5% सीओ 2
  • उल्टे माइक्रोस्कोप इन्क्यूबेटर कक्ष और लंबी दूरी काम कर उद्देश्यों (0.6 या उच्चतर के एनए) के साथ सुसज्जित

III. व्यंजनों

ऊतक विच्छेदन और टुकड़ा तैयारी (ऊतक तैयारी बफर) के लिए बफर समाधान

स्टॉक समाधान आयतन अंतिम Concetration
10X HBSS 50 एमएल 1X
1M Hepes (7.4 पीएच) 1.25 एमएल 2.5mm
डी - ग्लूकोज 1M 15 एमएल 30mm
1M 2 CaCl 0.5 एमएल 1mm
1M 4 MgSO 0.5 एमएल 1mm
1M 3 NaHCO 2 एमएल 4mm
DH 2 हे 430.75 एमएल

0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ बाँझ फ़िल्टर

Organotypic स्लाइस, ऊतक प्रत्यारोपण और इमेजिंग के लिए संस्कृति मध्यम (टुकड़ा माध्यम)

स्टॉक समाधान आयतन अंतिम एकाग्रता
बेसल मध्यम ईगल 35 एमएल
ऊतक तैयारी बफर 12.9 एमएल
डी - ग्लूकोज 1M 1.35 एमएल 20mm
एल glutamine 200mm 0.25 एमएल 1mm
पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन 0.5 एमएल 100units / एमएल पेनिसिलिन और 0.1mg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन

0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ बाँझ फ़िल्टर

कम पिघलने बिंदु agarose जेल की तैयारी

कम पिघलने बिंदु agarose ऊतक तैयारी बफर में 0.3g / एमएल (व्यंजनों देखें) एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पतला है. ट्यूब 5-10 सेकंड के वेतन वृद्धि में उच्च शक्ति पर microwaved है. वेतन वृद्धि की संख्या कुल मात्रा पर निर्भर है, 10 एमएल के लिए, तीन वेतन वृद्धि (10-8-5 सेकंड, प्रत्येक) पर्याप्त होना चाहिए. ट्यूब टोपी ध्यान हीटिंग वेतन वृद्धि के बीच unscrewed है हवा के दबाव जारी है और ट्यूब के विस्फोट से बचने. सावधानी ट्यूब सामग्री के रूप में बहुत गर्म हो जाएगा करने के लिए लिया जाना चाहिए. एक बार agarose पूरी तरह भंग है, ट्यूब एक कम से कम 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बनाए रखा है के तापमान को स्थिर करने से पहले करने के लिए उपयोग करने के लिए अनुमति देते हैं. कमरे के तापमान पर लंबे समय तक जोखिम कठोर जेल जाएगा. हालांकि यह जितना संभव से परहेज किया जाना चाहिए, कठोर जेल और reheated किया जा सकता है तत्काल उपयोग के लिए प्रारंभिक तैयारी के 24 घंटे के भीतर फिर से पिघल.

Organotypic स्लाइस पर immunohistochemistry

Confocal खुर्दबीन इमेजिंग के बाद, स्लाइस 4 ° C में रात भर हो सकता है पीबीएस में 4% formaldehyde के साथ तय की. धारा 4 ° C पर तो हैं रातोंरात अवरुद्ध, 10% 1% Triton एक्स के साथ बकरी सीरम में पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात में ऊष्मायन द्वारा पीछा किया (सिग्मा, बिल्ली # - S26 36 23.) Fluorescently टैग बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी दृश्य (सभी पतला 1:1000, कमरे के तापमान पर 1 घंटे ऊष्मायन) के लिए किया जाता है. लेबल स्लाइस अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे पहले पीबीएस गिलास स्लाइड पर बढ़ते और coverslipping के साथ कर रहे हैं 5-6 बार धोए.

चतुर्थ. प्रतिनिधि परिणाम

हमारे organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परीक्षण किया गया है और प्रवास पैटर्न और ओरिएंटेशन में स्थिरता के लिए है कि पिछले कुछ वर्षों में अनुकूलित. चूहों से प्राप्त explants जो में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, टीडी - टमाटर, की अभिव्यक्ति Nestin प्रमोटर (Nestin - टीडी टमाटर) के तहत प्रेरित है से emigrating कोशिकाओं का विश्लेषण, मेजबान आरएमएस में tdTomato + neuroblasts के अत्यधिक उन्मुख और तेजी से प्रवास से पता चलता है ( 4A चित्रा). उच्च बढ़ाई विश्लेषण समय चूक एक इमेजिंग 20 मिनट के सत्र (4B चित्रा) के दौरान एक पलायन neuroblast की पूरी लंबाई के उत्कृष्ट संकल्प दिखाता है.

दाता के साथ स्लाइसें टीडी टमाटर + कोशिकाओं तय थे और आरएमएस के भीतर अलग सेलुलर घटकों के लिए immunostained. GFAP + astrocytes और CD31 + रक्त वाहिकाओं फ्लोरोसेंट immunohistochemistry (चित्रा 5A) का उपयोग कर पता चला रहे थे. Cytoskeletal प्रोटीन actin और ट्यूबिलिन के लिए दाग स्लाइस के उच्च बढ़ाई विश्लेषण प्रवास (चित्रा 5B) के बीच में एक सेल द्वारा इन घटकों के गैर वर्दी अभिव्यक्ति प्रकट करते हैं.

में इस्तेमाल किया एंटीबॉडीइन उदाहरणों: खरगोश विरोधी (Abcam, 1:250) आरएफपी, खरगोश विरोधी GFAP (Dako, 1:1000), विरोधी CD31 चूहा (बी Pharmigen, 1:100), माउस विरोधी actin (सांताक्रूज, 1: 500), विरोधी ट्यूबिलिन (सिग्मा, 1:1000) खरगोश, बकरी Cy3 विरोधी माउस (Chemicon, 1:1000), विरोधी खरगोश बकरी 647 AlexaFluor (Invitrogen, 1:1000), बकरी विरोधी चूहे 488 AlexaFluor (Invitrogen ) 1:1000, बकरी विरोधी खरगोश 488 AlexaFluor (Invitrogen, 1:1000).

चित्रा 1
चित्रा 1. Organotypic स्लाइस के लिए गिलास नीचे व्यंजन की तैयारी. गोंद के एकाधिक स्थानों पकवान के परिपत्र घटक गिलास नीचे (लाल) के चारों ओर रखा जाता है, फिल्टर के नीचे से मध्यम के आदान प्रदान के लिए एक तरफ खुला छोड़. टुकड़ा के माध्यम से एक 150μL ड्रॉप गिलास coverslip के केंद्र में रखा गया है. एक nucleopore झिल्ली (नीला) तो है, चमकदार पक्ष नीचे आवेदन किया है, जबकि यह सुनिश्चित करना कि कोई हवाई बुलबुले कांच coverslip और झिल्ली के बीच फंस रहे हैं. टुकड़ा मध्यम (ग्रे) के एक मिली लीटर झिल्ली के शीर्ष पर फैला हुआ है, और व्यंजन 37 में incubated ° सी से पहले का उपयोग करने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. मस्तिष्क और सेक्शनिंग के लिए निकासी की तैयारी. (ए) खोपड़ी गर्दन से थूथन (midline साथ बिंदीदार रेखा) खोपड़ी incising द्वारा अवगत कराया है. खोपड़ी तो longitudinally और पूर्व से कट जाता है cisterna मैग्ना में शुरू, (बी) के एक औसत दर्जे का है और 2 पार्श्व में कटौती (प्रत्येक पक्ष पर एक, 2A) बनाकर प्रांतस्था के पार्श्व सबसे पहलुओं और सीएनएस की दुम पहलू हैं. vibratome सेक्शनिंग दौरान ऊतक की स्थिरता में सुधार resected (सीडी) दोनों गोलार्द्धों और फिर अलग हो रहे हैं औसत दर्जे का चेहरा रखा नीचे एक embedding के सांचे में 3% agarose ऊतक तैयारी बफर में भंग जेल के आवेदन करने से पहले.

चित्रा 3
चित्रा 3. ब्रेन सेक्शनिंग और पार प्रत्यारोपण. (ए) मेजबान ऊतक 150μm मोटाई में sectioned है, और आरएमएस युक्त वर्गों को ध्यान गिलास ठंडा - नीचे व्यंजनों की nucleopore झिल्ली पर फ्लैट तैनात (बी) दाता दिमाग (आरएमएस में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त दिमाग) में sectioned हैं . 250μm मोटाई, और स्लाइसें ठंडा ऊतक तैयारी बफर में एकत्र कर रहे हैं. दाता आरएमएस microdissected है और छोटे explants में कटौती. एक एक 20 μL टिप के साथ सुसज्जित pipettor का उपयोग, व्यक्तिगत आरएमएस explants मेजबान आरएमएस में एक छिन्न साइट के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं ऊष्मायन के 1-2 घंटे के बाद (सी), बर्तन एक confocal खुर्दबीन पर एक incubated चरण के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और प्रवास पर कब्जा कर लिया है. समय चूक इमेजिंग का उपयोग. photomicrograph कम बढ़ाई छवि एक ठेठ (ग्रे) टुकड़ा प्रत्यारोपण के बाद 1 घंटा (, लाल बिंदीदार लाइनों रूपरेखा आरएमएस में मेजबान टुकड़ा tdTomato + आरएमएस से एक दाता माउस के लाल explant) सेट का एक प्रतिनिधि है.

चित्रा 4
चित्रा 4. मेजबान आरएमएस में explants से neuroblasts के प्रवासन. (ए) Nestin tdTomato + neuroblasts (लाल) मेजबान (डॉटेड ग्रीन लाइन) प्रत्यारोपण के बाद 1 घंटा आरएमएस में explants से विस्थापित. tdTomato + मेजबान organotypic स्लाइस एक अत्यधिक उन्मुख और तेजी से एसईजेड से दूर तरीके में और ओ की ओर कदम के RMS हमलावर कोशिकाओं (बी) प्रवासी चक्र में लगभग एक से अधिक उच्च शक्ति neuroblast के समय चूक छवियों में देखा जा सकता है. 20 मिनट की अवधि. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 5
चित्रा 5. Organotypic स्लाइस के immunohistochemical मूल्यांकन Explanted neuroblasts (लाल) प्रवास के बीच में तय किए गए 12 घंटे पोस्ट प्रत्यारोपण (ए) का टुकड़ा प्रतिदीप्त immunohistochemical धुंधला GFAP + astrocytes के एक घने पूल (नीला) से पता चलता है और बिखरे हुए CD31 + रक्त वाहिकाओं (हरा) (बी) मेजबान टुकड़ा के RMS के भीतर एक अलग tdTomato की cytoskeleton + एक मेजबान आरएमएस में पलायन सेल (लाल) के सह (नीला) actin और ट्यूबिलिन (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunostaining द्वारा पता चला है.

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Discussion

आरएमएस में neuronal प्रवास घ्राण एक बल्ब में एक प्रसवोत्तर neurogenesis के आवश्यक घटक है. प्रवासन आरएमएस के माध्यम से मस्तिष्क की सतह के लिए एक स्पर्शरेखा विमान में होता है. Tangentially पलायन neuroblasts त्रिज्यात उनके पूर्वज स्रोत के स्थान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने अंतिम neuronal 1 उत्पादों, 2, 3 के मुक़्तलिफ़ भाग्य पर आधारित कोशिकाओं पलायन से अलग कर रहे हैं. प्रसवोत्तर आरएमएस में tangentially पलायन कोशिकाओं के अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी इस anatomically definable स्पर्शरेखा प्रवास के तंत्र के अध्ययन के लिए एक इष्टतम मंच क्षेत्र बनाता है. Neuronal प्रवास के सेलुलर और आणविक तंत्र का गूढ़ रहस्य कई neurodevelopmental रोगों (जैसे, 4 रेफरी.) को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस ज्ञान को आगे तंत्र है कि गठन और मस्तिष्क ट्यूमर के प्रसार को (उदाहरण के लिए, रेफरी 5) आबाद के पहचान की सुविधा सकता है और चोट या भविष्य neuronal प्रतिस्थापन रणनीति में neurodegeneration की साइटों के लिए reprogrammed neuroblasts निर्देशन के लिए आवश्यक है.

पिछले कुछ वर्षों में भारी प्रगति के बावजूद, आनुवंशिक और आणविक neuronal प्रवास अंतर्निहित तंत्र, और उनके विशिष्ट subcellular घटनाओं के लिए लिंक के वर्तमान को समझने खंडित बनी हुई है. इस खोज में headways बनाने में कठिनाई का ज्यादातर सबसे प्रवास के अध्ययन के ऊतक नियतन और immunohistochemistry, जो अप्रत्यक्ष रूप से भ्रूण के मस्तिष्क में RMS और अन्य प्रवास धाराओं में प्रवास के तंत्र के बारे में inferences आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पर निर्भरता के कारण है. 'तय' दृष्टिकोण suboptimal है क्योंकि यह केवल एक सेल का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, जबकि अस्थायी समाधान सेलुलर प्रवास के रूप में एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. कुछ व्यावहारिक अध्ययन इन विट्रो विधि जिससे explants हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल उन लोगों के लिए समान, बाह्य मैट्रिक्स के घटकों (जैसे, refs 6, 7) के साथ लेपित प्लास्टिक या ग्लास substrates पर चढ़ाया जाता है में एक का उपयोग सेलुलर प्रवास के तंत्र को संबोधित किया है. हालांकि इस परख का उपयोग अध्ययन प्रवास में स्पष्ट भूमिकाओं के साथ तंत्र की एक नंबर की पहचान की है, में vivo परिस्थितियों में अपने निष्कर्षों की प्रासंगिकता स्पष्ट नहीं है. हाल ही में, fibered confocal माइक्रोस्कोपी और एमआरआई के उपयोग के माध्यम से neuroblasts के vivo इमेजिंग में सीधे 8-10 आयोजित किया गया है. हालांकि, इस तरह की तकनीक उपज कम संकल्प छवियों और इस प्रकार neuronal प्रवास के subcellular मूल्यांकन में अपर्याप्त हैं. एक और दृष्टिकोण, पूरे माउंट Alvarez-Buylla 11 समूह द्वारा तैयार तैयारी, subependymal स्टेम सेल आला 12-14 के विनियमन में महत्वपूर्ण शारीरिक अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है. फिर भी, इस सुरुचिपूर्ण दृष्टिकोण आरएमएस में neuroblast प्रवास का अध्ययन नहीं किया जा उपयोग कर सकते हैं. पिछला भ्रूण मस्तिष्क 15 और प्रसवोत्तर आरएमएस में प्रवास के विश्लेषण के लिए organotypic स्लाइस उपयोग रिपोर्ट 16-18 प्रकाशित किया गया है. हम इस दृष्टिकोण सिद्ध किया है और यहाँ प्रोटोकॉल है जो उन्मुखीकरण के उच्च throughput, रिकॉर्डिंग गति, और उच्च संकल्प पर आरएमएस में प्रवास के अंतर और कहनेवाला गतिशीलता के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुछ चुनौतियों है कि अभ्यास, धैर्य, और दोनों तैयारी और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए समर्पित समय की आवश्यकता बन गया है. निम्नलिखित सुझावों इस प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के साथ आपकी सहायता करेगा:

  • हमारे अनुभव में, P1 की उम्र P10 रेंज में चूहों सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करते हैं. दाता और प्राप्तकर्ता के दिमाग के बीच आयु मिलान भी प्रयोगों के reproducibility में सुधार.
  • के बाद से सबसे अभिकर्मकों और संस्कृति व्यंजन हौसले से तैयार किया जाना चाहिए, हमारे टुकड़ा परख निर्बाध और एक ही दिन में तैयार इमेजिंग के कई घंटे की आवश्यकता है. एक बार दिमाग harvested रहे हैं फलस्वरूप कदम के रूप में संभव के रूप में में तेजी से पूरा किया जाना चाहिए.
  • कत्ल और स्लाइस की तैयारी के बीच, सभी चरणों बर्फ के ठंडे अभिकर्मकों का उपयोग किया होना चाहिए, और ऊतक हेरफेर एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए क्रम में संरचनात्मक अवरोधों से बचने.
  • इन dissections के लिए उपयोग किए गए उपकरण बाँझ और केवल जीना ऊतक जोड़तोड़ के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए. उपकरण है कि formaldehyde जैसे fixatives के साथ संपर्क में कभी थे कभी नहीं का उपयोग.
  • स्लाइस आम तौर पर 36 घंटे के लिए व्यवहार्य प्रवास गति और अभिविन्यास में दिखाई गिरावट के साथ 24 और 36 घंटे के बीच. इस सीमा के खबरदार जब अपने प्रयोगों और विश्लेषण की योजना बना.

हमारे ज्ञान करने के लिए प्रस्तुत organotypic टुकड़ा परख ओबी के लिए एसईजेड से neuroblast प्रवास के आनुवंशिक और आणविक तंत्र का गूढ़ रहस्य के लिए सबसे अच्छा वर्तमान दृष्टिकोण प्रदान करता है. उभरती 19 आरएमएस, भविष्य प्रयोगों में नेटवर्क संकेत की पहचान की लिंक की अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी को देखते हुएneuronal प्रवास करने के लिए संकेत cascades व्यापक हमारे परख से लाभ होगा. हमारे प्रोटोकॉल उम्मीदवार संकेतन अणुओं है जो neuroblast माइग्रेशन autonomously को विनियमित करते हैं की पहचान की सुविधा है, जबकि भी जांचकर्ताओं एक गैर स्वायत्त तरीके में प्रवास के नियमन में chemokines और secreted कारकों की भूमिका का आकलन करने के लिए अनुमति देता है, जैसा कि हम हाल ही में 20 18, दिखा दिया है . हमारे प्रस्तुत तकनीक आसानी से स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, वृक्ष के समान / axonal परिणाम, और विकास तंत्रिका जीव विज्ञान और वयस्क neurogenesis में अन्य विषयों की एक पूरी मेजबान के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Disclosures

जानवरों पर प्रयोगों उत्तरी केरोलिना राज्य विश्वविद्यालय और पशु चिकित्सा कॉलेज द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम वीडियो में प्रोटोकॉल narrating के लिए दान McWhorter धन्यवाद. यह काम NIH अनुदान 5R01NS062182, एजिंग रिसर्च के लिए अमेरिकन फेडरेशन से एक अनुदान, और संस्थागत HTG के लिए सम्मानित किया गया धन के द्वारा समर्थित है.

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