Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

Published 4/26/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

För att testa samspelet mellan ett protein med sitt mål lipid vi använt Mac och Annexin V-konjugerad magnetiska kulor och blåsor lipid syntetiseras från målet lipid och Annexin V-bindande fosfatidylserin. Proteiner bundna till målet lipid är co-renade och analyseras efter elueringen från pärlor.

Cite this Article

Copy Citation

Bieberich, E. Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction. J. Vis. Exp. (50), e2657, doi:10.3791/2657 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analysen av fett protein interaktion är svårt eftersom lipider är inbäddade i cellmembranen och därför otillgängliga för de flesta rening förfaranden. Som ett alternativ kan lipider vara lackerad på den plana ytor som används för lipid ELISA och Plasmon resonans spektroskopi. Däremot utgör ytbeläggning lipider inte microdomain strukturer, vilket kan vara viktigt för lipid bindande egenskaper. Dessutom tillåter dessa metoder inte för rening av större mängder proteiner binder till sitt mål lipider.

För att övervinna dessa begränsningar att testa interaktion fett protein och för att rena lipid bindande proteiner vi utvecklat en ny metod kallas lipid vesikler-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera-aktiverad cell sortering (LIMACS). I denna metod är lipid blåsor förberedda med målet lipid och fosfatidylserin som ankare lipid för Annexin V MACS. Fosfatidylserin är en allestädes närvarande cellmembran fosfolipid som visar hög affinitet till det protein Annexin V. Använda magnetiska kulor konjugerad med Annexin V fosfatidylserin som innehåller lipid blåsor kommer att binda till den magnetiska pärlor. När lipid blåsor inkuberas med en cell lysat proteinbindningen till målet lipid kommer också att vara bundna till pärlor och kan co-renas med hjälp av Mac-datorer. Denna metod kan också användas för att testa om rekombinanta proteiner återskapa ett protein komplex bindning till målet lipid.

Vi har använt denna metod för att visa samspelet mellan atypiska PKC (aPKC) med sphingolipid ceramider och att samarbeta rena prostata apoptos svar 4 (PAR-4), ett protein bindning till ceramid-associerad aPKC. Vi har också använt denna metod för beredning av en Ceramide-relaterade komplex av rekombinant aPKC med cellen polaritet-relaterade proteiner Par6 och Cdc42. Eftersom lipid blåsor kan framställas med en mängd olika sphingo-eller fosfolipider, erbjuder LIMACS en mångsidig test för lipid-protein interaktion i en lipid miljö som mycket lik den av cellmembranet. Ytterligare fett proteinkomplex kan identifieras med hjälp av proteomik analys av fett protein tillsammans renas med lipid blåsor.

Protocol

1. Inledning

Den lipid vesikler-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera-aktiverad cell sortering (LIMACS) Tekniken utvecklades i vårt laboratorium för att isolera ceramid-associerad protein komplex 1-3. Ursprungligen var de lipid blåsor gjord av ceramider och fosfatidylserin, som tillåtet för MACS med magnetkamera partikel-konjugerade Annexin V (mycket affina att fosfatidylserin) isolera blåsor och tillhörande proteiner. Vi har använt LIMACS teknik för in vitro-beredning av en Ceramide-associerad polaritet komplexa och isoleringen av Ceramide-bindande proteiner från cell lysates 3. LIMACS kan ändras med hjälp av andra interaktion partner för isolering av blåsor (t.ex. glykolipiden-specifc lektiner eller antikroppar lipid).

2. Experimentell Rutiner

Beredning av Lipid Blåsor och aPKCBinding analyser

  1. Lipid blåsor erhålls från torkade blandningar av ekvimolära mängder fosfatidylserin (105 mikrogram) och C16-ceramid (85 mikrogram) följande ändrade rutiner för stora liposomer förberedelse 1,4-7.
  2. Den lipid blandningar är sedan återsuspenderade och sonicated för 1 timme i 100 ìl vesikler buffert består av 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) och 150 mM NaCl.
  3. Efter att ha lagt 300 ìl av vesikler buffert kompletteras med 0,1 mM MnCl 2 skall proverna centrifugeras vid 12 tusen μ g under 20 minuter vid 4 ° C.
  4. Den pellet (stora lipid vesiklar) är suspenderade i 100 ìl vesikler buffert och inkuberas med 1 nmol av Vybrant CM-dii för 1 h vid 37 ° C för att visualisera vesikler delen av avfallet efter MACS separation. Vybrant CM-dii är en röd fluorescerande färg specifikt införliva lipid membraner.
  5. Ett tvättmedel utan cell lysat har utarbetats av ultraljudsbehandling / homogenisering av celler i 300 ìl hypoton buffert (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) med proteashämmare och hämmare fosfatas) följt av borttagning av membranös skräp genom centrifugering. En centrifugering steg i 100.000 xgi 1 h bör läggas för att undvika kontaminering av cellen lysat med endogen membran som innehåller fosfatidylserin.
  6. Den godkända lysat läggs till lipid vesikler fjädring, och blandningen inkuberas under 2 h vid 4 ° C.
  7. Reaktionsblandningen kompletteras med 20 l av 20x Annexin V bindande buffert och 50 ìl av en lösning som innehåller magnetiska kulor konjugerat till Annexin V följt av inkubering under 1 h vid 4 ° C.
  8. MACS utförs enligt tillverkarens (Miltenyi Biotec, Inc.) protokollet. Förekomsten och mängden av lipid blåsor bestäms genom att övervaka Vybrant CM-dii fluorescens i genomströmning och eluering bråk med en mikroplattor fluorescens läsare.
  9. Den linjära samband mellan mängden vesikulär lipid och fluorescensintensiteten av vesikler bundna Vybrant CM-dii verifieras genom kvantitativ högpresterande tunnskiktskromatografi (HPTLC) av lipid blandningen tillämpas Annexin V-baserade Mac-datorer.
  10. Specificiteten av den bindande reaktion aPKC eller andra proteiner till ceramid / fosfatidylserin blåsor verifieras av en antikropp konkurrens analysen med 1 mikrogram av anti-PKCζ kanin polyklonala antikroppar mot inkubera cellen lysat för 1 h vid 4 ° C före inkubering med lipid blåsor.
  11. Proteinbindningsgraden att ceramid / fosfatidylserin blåsor i MACS eluatet analyseras av SDS-PAGE och immunoblotting

In vitro lipid-protein polaritet komplex

  1. In vitro blandning av en lipid-protein polaritet komplex utförs efter LIMACS som beskrivs i föregående avsnitt. I korthet fosfatidylserin (420 mikrogram) och C16-ceramid (107 mikrogram) torkas från organiska lösningsmedel.
  2. Den torkade lipider är suspenderade i ultraljudsbehandling i 500 l av vesikler buffert (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
  3. Fem l 10 mm MnCl2, 1 ìl Vybrant CM-DII, och 500 ng PKCζ (human rekombinant) tillsätts och reaktionsblandningen inkuberas undergentle omrörning i 60 minuter vid 4 ° C.
  4. Vybrant CM-dii målat fosfatidylserin / ceramid vesiklar återvinns genom centrifugering vid 12.000 xgi 60 minuter vid 4 ° C.
  5. Pelleten (rosa) är suspenderade i 100 l Tris-buffert och kompletteras med γS-GTP (100 M), BNP (1 mm), GST-Par6 (100 ng), eller GST-Cdc42 (500 ng) och ytterligare inkuberas 3 h vid 4 ° C (någon annan kombination av rekombinanta proteiner av intresse kan användas här).
  6. Annexin V-buffert (5 ìl av en 20x stamlösning) och Annexin V-konjugerade magnetiska kulor (50 l) läggs till och reaktionsblandningen inkuberas i försiktig omrörning i ytterligare 30 minuter vid 4 ° C.
  7. Annexin V-MACS utförs efter leverantörens protokoll som beskrivits tidigare. Elueringen fraktionen (1 ml) kompletteras med 10 mikrogram ren äggalbumin som nederbörd stöd. Proteinet är koncentrerat med Wessel-Flugge nederbörd och analyseras av SDS-PAGE/immunoblotting som tidigare beskrivits 8.
  8. Mängden elueras lipid blåsor kvantifieras genom upptäckten av Vybrant CM-dii (rosa) i det organiska (kloroform / metanol) fasen av Wessel Flugge nederbörd reaktion. Mängden analyserade protein är normaliserad på lika mängder av lipid blåsor.

3. Resultat

LIMACS rening av PKCζ-EGFP och ceramid bindande domänen C20ζ-EGFP

Ett tvättmedel utan lysat av MDCK celler som uttrycker full längd PKCζ C-terminalt kopplade till grönt fluorescerande protein (FLζ-EGFP) eller en ceramid bindande domän i C-ändstationen av PKCζ (C20ζ-EGFP) var inkuberas med fosfatidylserin / ceramid blåsor som beskrivs i experimentell förfaranden. Efter eluering av MACS kolumnen var protein analyserades med immunoblotting och antikroppar mot PKCζ och EGFP för detektion av elueras protein 2.

Figur 1
Figur 1. LIMACS av EGFP-märkta PKCζ och C-terminala fragment C20ζ med fosfatidylserin / ceramid blåsor.

Tvättmedel utan lysates av MDCK celler som uttrycker EGFP (som en icke-bindande reglering), full längd PKCζ-EGFP, eller ceramid bindande, C-terminala fragment C20ζ-EGFP inkuberades med fosfatidylserin / blåsor ceramider som beskrivs i experimentella delen . Efter att ha använt LIMACS, var proteiner elueras med SDS prov buffert och analyseras med SDS-PAGE och immunoblotting. Den vänstra panelen visar att EGFP inte binda till blåsor behålls med Annexin V-länkade magnetiska kulor. Den mellersta och höger panel visar att fulla längd PKCζ-EGFP och C20ζ-EGFP behölls grund av bindning till ceramider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att testa den specifika interaktionen mellan en lipid och dess bindande protein hämmas av inbäddning av lipider i cellmembranet. Cellmembranet består av en blandning av flera lipider och proteiner och är organiserad i lipid microdomains eller flottar. Därför kan samtidig rening av microdomains och proteiner inte klart urskilja om ett protein direkt binder till en lipid eller endast anrikas i en microdomain struktur. Andra metoder att använda definierade lipider beläggning på ytor som lipid Elisa-test eller Plasmon resonansspektroskopi kan upptäcka samspelet mellan en specifik lipid med protein .. Men för att avgöra detta samspel i en fysiologiskt relevant membranstabiliserande miljö ytan (t.ex. för Plasmon resonans spektroskopi) måste vara belagd med lipid blåsor eller liposomer.

Vi utvecklade ett nytt lipid vesikler bindande analys som ett alternativ till dessa tidigare metoder. Nyheten kommer från att ha ett ankare lipider (fosfatidylserin) i blåsor, som möjliggör för isolering av lipider blåsor med Annexin V-konjugerad magnetiska kulor. Därför kallade vi denna analys lipid vesikler-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera aktiverad cell sortering (LIMACS). LIMACS kan utföras för endogena proteiner, rekonstruerad proteiner som uttrycks i celler eller rekombinanta proteiner i en lipid proteinkomplex 1-3.

Det protein bundet till lipid blåsor kan sedan återvinnas genom att helt enkelt ta MACS kolumn från den magnetiska står och eluerande den med en lämplig buffert. Detta kan vara ett enzym kompatibel buffert för att mäta enzymaktiviteten i eluatet eller SDS prov buffert för att genomföra proteinanalys med SDS-PAGE och immunoblotting. Om du använder SDS prov buffra MACS kolumnen inte behöver tas bort från den magnetiska stativ, som möjliggör lagring av den magnetiska pärlor på stativet.

Det finns försiktighetsåtgärder vid användning LIMACS. Uppenbarligen kan LIMACS inte användas med ett tvättmedel lysat eftersom detta kommer att förstöra lipid blåsor. Dessutom måste det testas om protein av målet lipid också binds till fosfatidylserin eftersom detta fett används som ett ankare för bindning av blåsor att Annexin V-konjugerad magnetiska kulor. . I vissa fall kan fosfatidylserin försämra binder till målproteinet. Därför negativa kontroller och kontroller med olika mängder av fosfatidylserin måste inkluderas i analysen. Thesecontrols kan lätt utföras med hjälp av lipid blåsor som endast innehåller fosfatidylserin eller en blandning av fosfatidylserin med icke-bindande lipider. Inklusive negativa kontroller krävs också för cell lysates som innehåller en betydande mängd av endogena fosfatidylserin. Att undvika kontaminering med endogen lipid membraner eller blåsor är det rekommenderat att rensa cellen lysat genom att ta en ultracentrifugering steg i 100.000 xg under 1 h. Det är uppenbart att fett proteiner i supernatanten endast kan cytosoliskt, vilket är en begränsning av LIMACS förfarande. Det finns möjlighet att utöka LIMACS till andra förankra lipider som GM1 och kolera toxin B-subenhet konjugerade med magnetiska kulor.

Vi är för närvarande undersöka användningen av lipid-specifika antikroppar mot LIMACS, vilket skulle göra användningen av ankare lipider för beredning av blåsor onödigt. En av de positiva aspekterna av LIMACS är isoleringen av lipid proteinkomplex som möjliggör för en mängd av protein analysmetoder som inte är genomförbara .. Till exempel har vi använt LIMACS att isolera en rekonstruerad komplex polaritet protein av Par6/Cdc42 samband med ceramider bundna aPKC. Därför är LIMACS en kraftfull ny metod för analys och isolering av lipid-associerad protein komplex.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01NS046835 och R01AG034389 och March of Dimes bevilja 6FY08-322. Ett särskilt tack ägnas åt fru Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornien) som hjälpte enormt med henne inblick i MACS teknik. Miltenyi har generöst som det material som används för demonstration av de experiment utan kostnad. Jag är också tacksam mot Dr Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, Georgien) som genererade PKCζ uttrycka cellinjer. Stöd av Institutet för molekylär medicin vid Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (under styrelseuppdraget av Dr Lin Mei) är också erkänt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns Miltenyi Biotec
Lipids (of highest purity) Avanti Polar Lipid, Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
  2. Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
  3. Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
  4. Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
  5. Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. 177-188 (2005).
  6. Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
  7. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats