ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d'ADN pour la grippe

Immunology and Infection

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Summary

technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l'œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.

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Moulton, K. R., Taylor, A. W., Rowlen, K. L., Dawson, E. D. ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza. J. Vis. Exp. (52), e2682, doi:10.3791/2682 (2011).

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Abstract

Puces à ADN sont apparues comme un puissant outil de détection des agents pathogènes. 1-5, par exemple, de nombreux exemples de la capacité de type et de sous-type du virus grippal ont été démontrés. 6-11 L'identification et le typage de la grippe sur les puces à ADN a des applications dans les deux publics la santé et de la clinique pour la détection précoce, d'intervention rapide, et en minimisant l'impact d'une pandémie de grippe. Fluorescence traditionnelle est actuellement la méthode la plus couramment utilisée puces de détection. Cependant, comme la technologie des biopuces progresse vers une utilisation clinique, une instrumentation coûteuse remplacer à faible coût de la technologie de détection présentant des caractéristiques de performance similaire à la fluorescence fera des essais biopuces plus attractif et rentable.

La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est destiné aux applications de recherche, et a une limite de détection au sein d'un ordre de grandeur de la fluorescence traditionnelle 11, avec un avantage principal étant une approximative de dix fois moindre coût instrument par rapport aux scanners biopuces à fluorescence confocale requis pour biopuces détection. Un autre avantage est la taille compacte de l'instrument qui permet pour la portabilité et la flexibilité, à la différence des instruments traditionnels de fluorescence. Parce que la technologie de polymérisation n'est pas comme intrinsèquement linéaire comme la détection par fluorescence, cependant, il est le mieux adapté à la densité plus faible applications des biopuces dans lequel une réponse oui / non de la présence d'une certaine séquence est souhaitée, comme pour les tableaux de détection de pathogènes. Actuellement, la densité maximale du spot compatible avec la détection ampliPHOX est ~ 1800 spots / tableau. En raison des limites de densité au comptant, biopuces haute densité ne sont pas adaptés pour la détection ampliPHOX.

Ici, nous présentons la technologie ampliPHOX détection colorimétrique comme une méthode d'amplification du signal sur une puce à faible densité développé pour la détection et la caractérisation des virus de la grippe (FluChip). Bien que ce protocole utilise le FluChip (une puce à ADN) comme une application spécifique de ampliPHOX détection, aucune puce incorporant cibles biotinylées peuvent être étiquetés et détectée d'une manière semblable. La conception de microréseau et biotinylation de la cible pour être capturés sont de la responsabilité de l'utilisateur. Une fois la cible biotinylé a été capturé sur le tableau, la détection ampliPHOX peut être effectuée par le marquage d'abord le tableau avec un conjugué streptavidine-étiquette (ampliTAG). Après exposition à la lumière en utilisant l'instrument de ampliPHOX Reader, la polymérisation d'une solution de monomère (ampliPHY) ne se produit que dans des régions contenant ampliTAG marqué cibles. Le polymère formé peut être ensuite colorées avec une solution non toxique pour améliorer le contraste visuel, suivi par imagerie et d'analyse en utilisant un logiciel simple (ampliVIEW). Le dosage de FluChip entière de l'ONU-échantillon extrait d'entraîner peut être effectuée en environ 6 heures, et les mesures de détection ampliPHOX décrit ci-dessus peut être complété en environ 30 min.

Protocol

1. Exemple d'amplification par RT-PCR

  1. Extrait d'ARN viral à partir du matériel clinique ou un isolat viral en utilisant le kit Qiagen MinElute Spin virus en conjonction avec la plate-forme automatisée QIAcube extraction d'acides nucléiques. Les extractions sont effectuées sur des échantillons 200 ul avec un volume d'élution finale de 60 pl. Extraits conserver à -70 ° C ou moins pour une utilisation ultérieure.
  2. Dans un modèle de libre-région, préparer le mélange de RT-PCR maître sur la glace selon le protocole du fabricant. Pour intégrer la biotine lors de la RT-PCR, utiliser un mélange de dNTP biotinylé en place du fabricant fourni mélange de dNTP. Le coût d'utilisation d'un mélange de dNTP biotinylé est inférieur à 1 $ USD / dosage. Des méthodes alternatives de l'incorporation de biotine comme l'utilisation d'une amorce biotinylée peut également être utilisé. Ajouter apprêt mêle à des concentrations finales de 1,0 uM pour la grippe A, 1,0 uM pour B grippe, et 0,14 uM pour le contrôle interne. La grippe A amorces amplifie le segment de gène de la matrice (1032 produits NT) et l'ensemble B Grippe apprêt amplifie un segment de gène non structurelles (811 produits NT). Chaque ensemble d'amorces FluChip contient une amorce avec un 5 'groupe phosphoryle pour faciliter la génération d'ADN simple brin par digestion enzymatique avec exonucléase lambda PCR suivant. Le produit résultant simple brin nécessite des temps beaucoup plus courte que l'hybridation l'équivalent double brin et raccourcit considérablement le temps de dosage global. Un mélange préparé à l'avance de ces amorces ainsi que l'ARN modèle de contrôle interne sont disponibles à partir InDevR aux chercheurs intéressés sur une base limitée.
  3. Brièvement au vortex et de distribuer 18 ul du mélange maître dans des tubes PCR à paroi mince.
  4. Transfert des tubes sur la glace à un espace de travail adapté à plus de modèle, et d'ajouter deux modèles ul dans chaque tube de réaction.
  5. Transfert des tubes PCR pour un cycleur thermique, et exécutez le profil thermique suivant: transcription inverse à 50 ° C pendant 30 min, l'inactivation des enzymes / activation à 95 ° C pendant 15 min, 40 cycles de PCR de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30s, et 72 ° C pendant 1 min, et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.

2. L'hybridation des produits RT-PCR à puces à faible densité

  1. Afin de générer un ADN simple brin d'hybridation FluChip, préparer le mélange de digestion enzymatique par des enzymes combinant 1,0 ul exonucléase lambda, 2,2 ul du tampon de réaction d'accompagnement, et de 0,8 l de l'eau sans nucléase. Ces montants sont pour un seul échantillon, mais peut être tout simplement à l'échelle pour le nombre total d'échantillons à être digéré. Retirer les échantillons du thermocycleur et ajouter 4 ul du mélange préparé à chaque réaction à digérer le brin phosphorylés du produit de PCR. Retour d'échantillons à l'thermocycleur et le programme du thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi par 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour compléter la digestion enzymatique et la fragmentation des mesures de chaleur.
  2. Les puces à la grippe personnalisés utilisés sont imprimés sur des lames de verre fonctionnalisées aldéhyde par Applied Microarrays Inc (Tempe, AZ). 5'-amino séquences de capture résilié sont combinés avec une mémoire tampon optimisée des taches et imprimés à une concentration finale de 20 uM (sauf pour la séquence de contrôle positif, qui a en outre une modification 3'-biotine et est repéré à une concentration finale de 500 nM) . Un contact non-spotting méthode est utilisée, avec un diamètre de la tache optimale de 300 um et le centre à la hauteur du centre de 700 um.
  3. Retirer microarrays dans la zone de stockage et d'appliquer des puits hybridation à usage unique autour de la microarrays en enlevant la feuille de protection et en appuyant fermement autour du périmètre bien.
  4. Placer les lames dans un bac de lavage contenant 110 ml d'eau purifiée pour 5 min de pré-hybridation laver en utilisant un agitateur orbital à 60-90 min. Sécher le tableau en touchant légèrement le tissu d'un essuie-glace au bord du puits et permettant à l'eau d'être méchant loin.
  5. Combinez 22 pi de tampon d'hybridation 2x avec chacun des produits ADNss fragmenté, et une pipette 40 ul de la solution d'hybridation dans les puits de biopuces.
  6. Autoriser diapositives à s'hybrider dans la chambre de l'humidité fermée pendant 60 minutes.
  7. Retirez les diapositives de la chambre humide, rincez brièvement tableaux avec le tampon de lavage D dans une bouteille de rincer avant de les placer dans le rack de diapositives. Typiquement le volume de rinçage de tampon de lavage D est de 2 ml par baie. Placer la lame en rack contenant des diapositives dans un bac de lavage contenant 110 ml de tampon de lavage Placez bin A. agitateur orbital à 60-90 rpm pendant 1 minute.
  8. Retirer support glisser de tampon de lavage A, brièvement rincer avec le tampon de lavage D, support glisser le transfert vers un bac contenant un tampon de lavage B et agiter à 60-90 rpm pendant 5 minutes.
  9. Séchez délicatement le tableau sur chaque diapositive, puis placez lames séchées dans la chambre de l'humidité dans la préparation des étapes ampliPHOX détection colorimétrique.

3. ampliPHOX: l'étiquetage des produits hybrides et des puces de calibration avec ampliTAG

  1. Combinent 10 ul de ampliTAG, 20 pl de tampon ampliTAG 2x, et 10 pl d'eau purifiée pour chaque tableau pour être traitées. Volumes de réactif peut être simplement réduit le nombre total d'échantillons. Assurez-vous de préparer le mélange d'étiquetage suffisant pour rendre compte de tous les tableaux et les tableaux de l'échantillon d'étalonnage nécessaires. Le nombre de jetons d'étalonnage nécessaires dépend de si vous effectuez un étalonnage complet (pour un nouvel instrument ou nouveau lot de réactifs), ou tout simplement un chèque instrument. Pour un étalonnage complet, 3 puces de calibration doivent être étiquetés, et pour un chèque de réactifs, juste une puce d'étalonnage unique devraient être étiquetés. S'il vous plaît noter que, avant les tableaux d'étalonnage sont étiquetés, ils devraient passer par l'étape de lavage pré-hybridation qui a été décrit précédemment pour les tableaux de la grippe.
  2. Transfert 40 ul de mélange étiquette pour chaque tableau, et permettent l'étiquetage réaction se dérouler dans une chambre humide fermée pendant 5 minutes.
  3. Rincer immédiatement tableaux avec le tampon de lavage D dans une bouteille de rincer avant de les placer dans un rack diapositives diapositive. Transfert en rack dans le bac contenant 110 ml de tampon de lavage C et agiter à 60-90 rpm pendant 5 minutes.
  4. Utiliser un bac rempli de second lavage de l'eau purifiée, effectuer trois années consécutives de bains d'eau brève pour enlever les résidus de sel. Sécher les tableaux en touchant doucement un essuie-glace sur le bord du tissu des puits.
  5. Les biopuces sont maintenant correctement étiquetés avec ampliTAG, et le reste de la procédure de détection ampliPHOX peut être effectuée. Photoactivation et l'imagerie de tableaux étiquetés devrait être achevé dans les 24 heures, et des tableaux supplémentaires peuvent être stockés dans une boîte à lames sombres jusqu'à l'utilisation.

4. ampliPHOX: étalonnage, l'amplification du signal, et l'imagerie

  1. Tournez ampliPHOX lecteur sur le logiciel et assurer ampliVIEW est prêt pour la photoactivation.
  2. Déterminer le moment optimal photoactivation utilisant des puces de calibration. En plus de la brève introduction qui suit, cette procédure est également décrite en détail dans le manuel d'utilisation ampliPHOX. Les puces de calibration contient une série de dilutions d'une séquence de contrôle biotinylé qui sont utilisés pour optimiser la sensibilité de l'essai, avec l'objectif de maximiser le nombre de lignes de la puce de calibration qui produisent un signal positif tel que déterminé par le logiciel.
  3. Retirer ampliPHY de 4 ° C, laisser réchauffer à température ambiante, et le vortex brièvement pour mélanger. Pipet 3 ul d'ampliPHY d'activateur dans le flacon ampliPHY, et le vortex soigneusement pendant 10 secondes.
  4. Uniformément transférer 40 ul de la solution ampliPHY dans la puce contenant le même ampliTAG marqué tableau, veiller à ce qu'aucun des bulles sont présentes. Fermer le flacon ampliPHY entre chaque application. Insérez la diapositive puces dans la baie du lecteur de photoactivation ampliPHOX.
  5. Pour le tableau de calibrage d'abord, utiliser le temps photoactivation par défaut dans le "Temps" boîte sur le panneau de gauche du logiciel et cliquez sur "Démarrer" sur le bouton vert pour commencer la photoactivation. Une fois terminé, retirez le tableau et rincer à l'eau purifiée pour enlever l'excès ampliPHY. Effacer formation de polymère sur certains des points doit maintenant être visible.
  6. Laisser les gouttes de polymère à sécher pendant 2 minutes, puis distribuer deux gouttes d'ampliRED sur la matrice et permettent de procéder coloration pendant 2 minutes.
  7. Ensuite, rincer rapidement puce à ADN avec de l'eau purifiée et sécher avec un tissu essuyer.
  8. Insérer puces dans la baie d'imagerie du lecteur ampliPHOX, et cliquez sur le bouton «nouvelle image de capture dans l'onglet Image. Une fois imagé, ajuster la culture et de sauvegarder l'image.
  9. Dans l'onglet Analyse, sélectionnez le masque puce d'étalonnage et le bouton «Placement automatique» pour lancer l'analyse. Le logiciel va automatiquement produire un «compte rendu» montrant les résultats quantifiés. Basé sur ces résultats, le temps de photoactivation est ajusté de 10 secondes pour le tableau de calibrage seconde, et la procédure est répétée.
  10. Une fois le temps photoactivation optimale a été déterminée, les tableaux de l'échantillon peut être traité en utilisant l'amplification du signal et des mêmes protocoles d'imagerie utilisés pour les tableaux d'étalonnage.
  11. Une fois que l'image est capturée pour les tableaux de l'échantillon, un masque pour votre mise en page de tableau particulier, comme la mise en réseau de la grippe décrites ici peuvent être created.The ampliVIEW logiciel est capable d'effectuer l'analyse d'image automatisée et générer des résultats de la grippe de sous-typage pour chaque échantillon.

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1
Figure 1. Illustration schématique de la méthode de détection colorimétrique ampliPHOX. (A) d'ADN cible biotinylé est hybride à chaque tache dans le tableau, et (B) marqué avec ampliTAG. (C) solution ampliPHY est ensuite ajouté, et (D) exposés à la lumière pour former des taches visibles polymère. (E) Les taches polymère formé sont ensuite colorés avec un colorant non toxique pour améliorer le contraste.

ONTENU "> Figure 2
Figure 2 (A). Grippe mise bas biopuces densité. Séquences 1-7 et 10-13 de la grippe A cibles, et les séquences 8, 9 cibles influenza B. (B) ampliPHOX et (C) des images de fluorescence d'un roman de 2009 («grippe porcine») H1N1 spécimen démontrant le motif de détection par les deux mêmes méthodes.

Figure 3
Figure 3. De gauche à droite, des images représentatives ampliPHOX pour la grippe A H3N2, H1N1 d'origine humaine, 2009 H1N1 (d'origine porcine), et un spécimen négatif. Tous les 3 sous-types montrent les modèles visuellement distincte sur le tableau. Notez que dans la négative que seul le contrôle interne est considéré MS2, indiquant l'amplification par RT-PCR n'a pas été inhibée.

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Discussion

La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX présenté ici est un rapide, alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence seule couleur pour les applications des biopuces baisse de densité. Schématisé à la figure 1, le principe de détection est basée sur l'utilisation d'un label de photoamorceur (1B). En présence d'une solution contenant du monomère (1C), exposition à la lumière des causes du photoamorceur (ampliTAG) pour déclencher une réaction de polymérisation que dans les régions étiquetées (1D). Bien que démontré ici, sur une puce à ADN pour l'identification de la grippe et sous-typage, la technologie peut être étendue afin de détecter tout produit biotinylé capturé sur une micropuce. À titre d'exemple, nos travaux antérieurs sur la détection basée sur la photopolymérisation en utilisant un réactif différent de chimie a été démontré sur les deux acides nucléiques et les anticorps des tableaux basés sur 12. D'autres ont également démontré la preuve de concept pour les applications d'anticorps et de protéines à base d'un système basé sur la photopolymérisation . Dans ces cas, chimies réactif différent nécessitant une purge avec un gaz inerte ont été utilisés. 13,14

Un schéma de la grippe de faible densité biopuces et des images représentant peut être vu dans la figure 2. Montré dans la figure 2A, le tableau contient un marqueur spatial / spotting de contrôle (en rouge) et 14 séquences de capture unique (en bleu), chaque repéré en trois exemplaires. Les séquences de capture sont aminés de synthèse résilié court (~ 25 mer) oligonucléotides conçus pour capturer les objectifs de la grippe qui sont génétiquement représentatives des types spécifiques ou sous-types de la grippe. Les séquences de capture sont conçus pour produire des modèles très différents sur la puce pour la grippe A sous-types différents. Les figures 2B et 2C montrent une comparaison directe de la détection d'un échantillon de 2009 par le nouveau virus H1N1 ampliPHOX et fluorescence traditionnels, respectivement. Le résultat de fluorescence a été généré en utilisant un scanner de puces à ADN confocale de fluorescence (Genetix Aquire). Le modèle de détection mêmes globale peut être facilement vu par les deux méthodes, cependant, le résultat ampliPHOX est visible à l'œil nu.

Montre la figure 3 sont les résultats de trois ampliPHOX la grippe Un représentant des échantillons positifs et un spécimen négatif traitées par le protocole décrit ici. Les figures 3A, 3B, 3C et les résultats montrent d'une origine humaine H3N2, H1N1 d'origine humaine, et d'origine porcine H1N1 (2009 H1N1), respectivement. Une nette différence dans le modèle de détection global peut facilement être vu pour ces 3 images. Par exemple, il peut être vu que les séquences 2 et 3 du signal de produire pour l'ensemble des sous-types de grippe A montré (3A-3C), mais que les séquences de 10, 12, et 13 seulement produire le signal de l'origine porcine H1N1-éprouvette (3C) . Cette approche a déjà été utilisé avec succès le type et virus de la grippe sous-type sur une puce. 6,8,10 important, l'échantillon négatif de la figure 3D montre le signal sur la séquence de contrôle interne, indiquant l'absence d'inhibition ou de l'échec de la réaction de RT-PCR.

L'interprétation de ces images est facilement automatisés par le logiciel ampliVIEW. L'utilisateur utilise d'abord le logiciel pour définir la disposition microréseau, puis de décrire ce qui les cibles devraient être présents pour générer une certaine «réponse» à cette disposition. Par exemple, la disposition de la grippe montré à la figure 2A pourraient générer des résultats logiques tels que «grippe A positif», «grippe B positif», «non saisonniers de la grippe A", "la grippe saisonnière A", et "négatif", selon le les résultats souhaités. Une fois ces affectations logiques sont prises et enregistrées, le logiciel peut interpréter automatiquement les images pour donner un résultat avec saisie de l'utilisateur peu.

La technologie de détection ampliPHOX génère visuelle, les résultats colorimétriques pour biopuces à faible densité avec une sensibilité similaire à la fluorescence en quelques minutes. Nous croyons que la combinaison de fonctions faciles à utiliser, réactifs peu coûteux avec un instrument à faible coût offre une alternative intéressante aux méthodes traditionnelles de détection des biopuces, en particulier en plus ciblée, plus faible densité génomique / diagnostic puces deviennent de plus en plus utilisés dans une variété d'applications.

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Disclosures

Tous les auteurs sont des employés de InDevR, Inc, une entité à but lucratif. InDevR commercialise la technologie ampliPHOX décrits.

Acknowledgments

InDevR reconnaît NIH / NIAID U01AI070276 et R43AI077112 du financement de ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Qiagen MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704 single 60 μl elution
QIAcube Qiagen 9001292 optional
ABI 9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems 4441166
Qiagen OneStep RT-PCR kit Qiagen 210210 kit dNTPs not used
2x Spotting Buffer InDevR Inc. MI-5007
Biotinylated dNTP Mix InDevR Inc. MI-5009
Lambda exonuclease Epicentre Biotechnologies LE032K 2500 U, 10U/μl
FluChip primer mix InDevR Inc. N/A not yet available for sale
Orbital Shaker Madell Technology ZD-9556-A
Wash Bins InDevR Inc. MI-4002
Wash Racks InDevR Inc. MI-4003
2x Hybridization Buffer InDevR Inc. MI-5004
Calibration Chips InDevR Inc. AP-5006
Wash Buffers A-D InDevR Inc. MI-5005
ampliRED InDevR Inc. AP-5004
ampliTAG InDevR Inc. AP-5001
2x ampliTAG Buffer InDevR Inc. AP-5002
ampliPHY, ampliPHY enhancer InDevR Inc. AP-5003

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References

  1. Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
  2. Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
  3. Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
  4. Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  5. Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
  6. Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
  7. Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
  8. Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
  9. Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
  10. Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
  11. Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
  12. Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
  13. Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).

Comments

1 Comment

  1. nice

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 11:34 AM

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