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Caecale procédure Crevaison ligature

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Summary

Le modèle murin de la ligature et ponction du caecum comme un outil précieux pour l'étude du sepsis humain.

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

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Abstract

Sepsis humain est caractérisé par un ensemble de réactions systémiques en réponse à l'infection intensive et massive qui a échoué à être contenues localement par l'hôte. Actuellement, les rangs septicémie parmi les dix premières causes de mortalité dans les unités de soins intensifs de l'USA 1. Au cours du sepsis, il ya deux phases établies hémodynamiques qui peuvent se chevaucher. La phase initiale (hyperdynamique) est défini comme une production massive de cytokines pro-inflammatoires et des espèces réactives de l'oxygène par les macrophages et les neutrophiles qui affecte la perméabilité vasculaire (conduisant à une hypotension), la fonction cardiaque et induit des changements métaboliques aboutissant à une nécrose des tissus et de défaillance d'un organe. En conséquence, la cause la plus fréquente de mortalité est lésions rénales aiguës. La deuxième phase (hypodynamique) est un processus anti-inflammatoire impliquant modifié la présentation des antigènes de monocytes, une diminution de la prolifération des lymphocytes et la fonction et l'apoptose accrue. Cet état connu comme une immunosuppression ou immunodépression augmente fortement le risque d'infections nosocomiales et, finalement, la mort. Les mécanismes de ces processus physiopathologiques ne sont pas bien caractérisés. Parce que les deux phases du sepsis peut causer des dommages irréversibles et irréparables, il est essentiel de déterminer le statut immunologique et physiologique du patient. C'est la principale raison pour laquelle de nombreux médicaments ont échoué. Le même médicament donné à différents stades du sepsis peut être thérapeutique ou autrement nuisibles ou n'ont pas d'effet 2,3. Pour comprendre la septicémie à différents niveaux, il est crucial d'avoir un modèle animal approprié et complet qui reproduit l'évolution clinique de la maladie. Il est important de caractériser les mécanismes physiopathologiques survenant au cours de la septicémie et contrôler les conditions de modèle pour tester des agents thérapeutiques potentiels.

Pour étudier l'étiologie de chercheurs sepsis humain ont développé différents modèles animaux. Le modèle le plus largement utilisé est la ligature du cæcum cliniques et la ponction (CLP). Le modèle CLP compose de la perforation du cæcum permettant la libération de matières fécales dans la cavité péritonéale pour générer une réponse immunitaire induite par exacerbé infection polymicrobienne. Ce modèle répond à la condition humaine qui est cliniquement pertinent. Comme chez les humains, les souris qui subissent CLP avec la réanimation liquidienne montrent les premiers (premières) phase hyperdynamique que le temps progresse à la deuxième (en retard) de phase hypodynamique. En outre, le profil des cytokines est similaire à celle observée dans le sepsis humain où il ya une augmentation apoptose des lymphocytes (examiné en 4,5). Grâce à des mécanismes multiples et se chevauchent impliqués dans le sepsis, les chercheurs ont besoin d'un modèle de septicémie convient de gravité contrôlé afin d'obtenir des résultats cohérents et reproductibles.

Protocol

1. La ligature du cæcum et de la perforation comme un modèle de souris pour sepsis humain

Pour cette procédure de C57BL / 6 souris (7-9 semaines) sont utilisés.

  1. Anesthésier la souris par l'injection intrapéritonéale d'une solution de 01h01 kétamine (75mg/kg) et de xylazine (15mg/kg). Comme référence, injecter 30 ul de la solution de 01h01 dans une souris pesant 20 grammes. Alternativement, les souris peuvent être anesthésiés à l'isoflurane inhalées en utilisant un vaporisateur anesthésique.
  2. Rasage de l'abdomen de la souris et désinfecter région en solution de bétadine appliquant d'abord suivi en essuyant avec un alcool à 70% écouvillon (numéro 1 dans la séquence d'images ci-dessous). La chlorhexidine peut être utilisé comme un antiseptique alternative. En option: un champ stérile peut être utilisée pour maintenir les lieux propres.
  3. Dans des conditions aseptiques, la pratique de 1 à 2 cm laparotomie médiane et exposer le caecum avec l'intestin attenante (2 et 3).
  4. Le cæcum est étroitement lié avec une suture de soie 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) à sa base en dessous de la valvule iléo-caecale, et est perforée une ou deux fois avec une aiguille de calibre 19 (4 et 5) sur le même côté du caecum. S'il vous plaît noter que la longueur du cæcum ligaturé définie comme la distance de l'extrémité distale du caecum au point la ligature va déterminer le degré de sévérité. Une distance de> 1 cm produit de haute qualité tout en septicémie une distance de ≤ 1 cm produit une septicémie de grade moyen à faible. A noter également que selon la méthode de perforation cæcale montré ici est différente de la norme à travers et grâce à la technique de ponction (introduction d'une aiguille à travers le cæcum). Les deux méthodes produisent de façon fiable le résultat septicémie mêmes. Cependant, un inconvénient de la technique à travers et grâce, c'est qu'elle ne facilite pas le contrôle de la quantité de matières fécales extrudé lorsque le caecum est pressé.
  5. Le caecum est ensuite délicatement pressés d'extruder une petite quantité de matières fécales provenant des sites de perforation (6). Le caecum est retourné à la cavité péritonéale et le péritoine est fermée avec 6,0 points de suture en soie. (7).
  6. La peau est fermée avec Reflex clips 7mm (RS-9258, Instruments Roboz chirurgicale) ou des clips plaies Michel (7 mm, RS-9270) (8).
  7. Réanimer les souris par l'injection sous-cutanée de 1 ml de pré-chauffé solution saline à 0,9% en utilisant une aiguille 25G. Cette mesure sera la réanimation liquidienne induire la phase hyperdynamique du sepsis. Cette étape cruciale est décrite dans la section discussion.
  8. En option: Injecter par voie sous cutanée buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) ou de tramadol (20mg/kg de poids corporel) pour l'analgésie post-opératoire. Soyez avisé que ces opiacés peut supprimer la respiration et la locomotion et ces effets peuvent être interprétés comme des signes de sepsis.
  9. Les animaux sont placés temporairement sur un coussin chauffant ou bien retourné immédiatement à une cage à l'exposition à une lampe chauffante infrarouge de 150W jusqu'à ce qu'ils se remettre de l'anesthésie. Le temps de récupération est de 30 min à 1 heure.
  10. Fournir un accès libre à la nourriture et d'eau (hydrogel) placé sur le fond de la cage.
  11. Les souris sont surveillés toutes les 12 heures pour la survie d'une à deux semaines ou euthanasiés à différents temps de l'analyse des différents paramètres.

Comme le contrôle de la conception expérimentale, des animaux simulacre suivrait la technique laparotomie sans ligature et la ponction.
Six à 12 heures après l'intervention chirurgicale sera souris deviennent léthargiques et développent une fièvre, horripilation, des diarrhées, se blottir, et malaise; tous les symptômes de la septicémie. Souris atteints de sepsis sévère peut à peine bouger avant son décès et présentent une diminution spectaculaire de la température du corps. Lors de cette étape souris devrait être euthanasié pour éviter la douleur et la souffrance prolongée.

Figure 0

2. La plupart des communes paramètres analysés

Pour évaluer le résultat de la procédure, différents paramètres peuvent être analysés dans les organes, des extraits cellulaires ou des fluides corporels. Les échantillons peuvent être prélevés à différents temps de 3 heures à une semaine après l'intervention chirurgicale.

  1. La survie des souris.
  2. Cytokines et de chimiokines dans le sérum, la cavité péritonéale et extraits d'organes.
    1. L'interleukine-6: produits et libérés par les monocytes, cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B, les lymphocytes T, les granulocytes, les mastocytes et les types de cellules beaucoup plus. Elle joue un rôle important dans la réaction de phase aiguë et l'inflammation.
    2. Facteur de nécrose tumorale-α: cytokine Pleiotrophic qui joue un rôle central dans l'inflammation et l'apoptose. Produit par les monocytes, les macrophages, les neutrophiles, les cellules dendritiques et les fibroblastes.
    3. nterleukin-1β: Produit par les monocytes, les cellules NK, cellules dendritiques, cellules B et les lymphocytes T. Induit la fièvre aiguë et la synthèse des protéines de phase.
    4. L'interleukine 10: Favorise l'absorption phagocytaire et réponses Th2 mais supprime antigPrésentation de bains et réponses Th1 pro-inflammatoire.
    5. L'interleukine 10: Favorise l'absorption phagocytaire et réponses Th2 mais supprime la présentation des antigènes et des réponses Th1 pro-inflammatoire.
    6. Monocyte chimiotactiques protein-1 (aussi connu comme CCL2): Recrues monocytes, les cellules T mémoire, et les cellules dendritiques vers les sites des lésions tissulaires et l'infection.
    7. KC (CXCL1): Produit par les macrophages et les cellules endothéliales. Souris KC est un attractant des neutrophiles puissant et activateur.
    8. RANTES: Un chimiotactique des monocytes. Il peut chemoattract CD4 + stimulées / CD45RO + cellules T CD4 mémoire et stimulé + et CD8 + T avec ai na et les phénotypes de la mémoire.
    9. L'interféron γ-: Sécrétée par les cellules Th1, les cellules T cytotoxiques, les cellules dendritiques et les tueuses naturelles (cellules NK). Augmente la présentation des antigènes et de l'activité lytique dans les macrophages et supprime l'activité des cellules Th2. Favorise l'adhérence et contraignant requis pour la migration des leucocytes et favorise l'activité des cellules NK.
    10. Haute-mobilité du groupe B-1 protéine: Dans les monocytes est un facteur nucléaire kappa B activateur en se liant au récepteur cellulaire pour les produits de l'avance de glycation (RAGE), en activant la libération de médiateurs pro-inflammatoires dans la phase tardive de la septicémie.
  3. La détermination myéloperoxydase dans les organes comme une mesure de l'infiltration de neutrophiles. Myéloperoxydase (MPO) est une enzyme peroxydase plus abondamment présentes dans les granulocytes neutrophiles. Elle est une protéine lysosomale stockées dans les granules azurophiles des neutrophiles. MPO a un pigment héminique, ce qui provoque sa couleur verte dans les sécrétions riches en neutrophiles, comme le pus et certaines formes de mucus.
  4. Les bactéries de charge dans les organes et la circulation sanguine, mesure que le nombre d'unités formant colonie par millilitre.

3. Les résultats représentatifs

La procédure a été initialement réalisée CLP dans la souche de souris C57BL / 6. Nous avons testé plusieurs paramètres afin de moduler la sévérité du sepsis en modifiant la longueur de la ligature et l'épaisseur de l'aiguille, comme indiqué dans les figures 1 et 2. Parmi ces deux facteurs, la longueur de la ligature semble être plus efficace que l'épaisseur de l'aiguille d'altérer la survie pour cent. Comme le montre la figure 1, l'augmentation de la longueur de la ligature par plus de 1 cm provoque une augmentation de la mortalité de 100% par rapport à des souris ayant une ligature de ≤ 1 cm. L'augmentation de l'épaisseur de l'aiguille a aussi diminué la survie de 100% pour cent (à l'aide d'une aiguille 22G) à 55% (en utilisant une aiguille 19G) avec deux crevaisons. Nous avons également testé l'effet de la CLP sur C57BL / 6 et 129SvJ souris pour déterminer si des souches de souris différentes affichage susceptibilité semblables ou distincts pour CLP-induite septicémie. La figure 3 montre que dans les mêmes conditions, les souris 129SvJ étaient plus sensibles aux infections que les souris C57BL / 6, indiqué par un pour cent de mortalité accru.

Figure 1
Figure 1. Effet de la longueur ligature du cæcum dans la survie des animaux. CLP a été réalisée en souris C57BL / 6 en utilisant deux longueurs différentes de la ligature du cæcum. Ce seul paramètre affecte considérablement la survie des animaux puisque tous les animaux dans le groupe avec une zone de ligature plus de 1 cm est mort en moins de 3 jours en comparaison avec un groupe d'animaux ayant une superficie de 1 ligature cm env. (N = 8).

Figure 2
Figure 2. Influence de la grosseur de l'aiguille sur la survie. CLP a été réalisée en souris C57BL / 6 avec deux tailles d'aiguilles différentes, 19G et 22G. Les souris dont le caecum perforés à l'aide d'une aiguille 19G a montré une survie de 55-60%. En revanche, les souris avec le caecum perforés à l'aide d'une aiguille 22G montré survie de 100% alors qu'ils présentaient des symptômes typiques d'une inflammation au cours des 3-4 premiers jours, ce qui a disparu après 4 jours (n = 8).

Figure 3
Figure 3. Comparaison de la sensibilité septicémie entre deux souches de souris différentes. Le modèle CLP a été réalisée en 129SvJ et C57BL / 6 dans les mêmes conditions. A la fin de la période d'évaluation de la survie pour cent de la souche 129SvJ était de 25% de moins que dans la souche C57BL / 6, indiquant une plus grande susceptibilité à l'inflammation induite par l'infection polymicrobienne. (N = 6).

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Discussion

Ici, nous montrons en détail comment effectuer le modèle CLP chez la souris et de moduler le degré de gravité.

Comparé à d'autres modèles animaux de sepsis, CLP peut être effectuée dans n'importe quelle souche de souris d'âge et de sexe différents. C'est une procédure relativement simple et peu coûteux de chirurgie. Dans ce modèle, le grade de sévérité a un impact direct sur le pourcentage de survie. La longueur de la ligature, l'épaisseur de l'aiguille et le nombre de crevaisons sont des paramètres qui peuvent être contrôlés afin de moduler la sévérité / mortalité des CLP. Par conséquent, pour obtenir des changements dramatiques dans la sévérité du CLP, l'utilisateur peut changer la longueur de la ligature en légère modification de la sévérité peut être introduite en ajustant l'épaisseur de l'aiguille.

D'autres paramètres importants qui pourraient introduire une variabilité importante dans les résultats du CLP sont la souche de souris 6,7, 8 et le sexe âge de l'animal 9. À cet égard, nous montrons que différentes souches de souris d'affichage susceptibilités distinctes de la procédure lorsqu'elle est effectuée dans les mêmes conditions. En effet, les différences de niveaux de cytokines plasmatiques et endommager les tissus ont été détectés entre les différentes souches de souris 10-12. L'inclusion de la réanimation liquidienne et l'administration d'analgésiques sont des facteurs qui peuvent introduire une variabilité importante dans le modèle du CLP. Par exemple, la réanimation liquidienne augmente le taux de survie éventuellement en diminuant la production de début cytokines pro-inflammatoires 11, 13, 14 masquant ainsi les effets du potentiel des interventions thérapeutiques. En revanche, les analgésiques narcotiques peut supprimer la respiration et la locomotion chez l'animal et de provoquer un effet irréversible sans rapport avec un sepsis. Leur utilisation, par conséquent, peuvent influencer les taux de survie et la fonction des cellules immunitaires 15.

En conclusion, lors de l'exécution du modèle CLP toutes ces conditions et les paramètres techniques doivent être soigneusement examinées afin d'obtenir des résultats reproductibles et cohérents. Par conséquent, une connaissance profonde et la maîtrise de la procédure est absolument nécessaire pour effectuer le modèle CLP précision.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Pennsylvania Department of Health.
Le Dr Miguel Garcia Toscano a été boursier postdoctoral à l'Université Temple, financé par la Fondation Alfonso Martin Escudero cours de cette étude.
Nous tenons à remercier Iliya Yordanov et Kotredes Kevin pour la réalisation de la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Comments

7 Comments

  1. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:03 AM
  2. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:27 AM
  3. Hello Colleges, we are very interested in your model of abdominal sepsis, we would very much like to ask you a complete description, unfortunately we can not pay money for it. We'll be very grateful, and try using it to make a drop in the ocean of the world science.

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    Posted by: ana g.
    November 26, 2013 - 4:43 PM
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    Posted by: Roma Z.
    November 27, 2013 - 12:21 AM
  6. dear sir:I am a student of zhejiang University of China,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!
    my e-mail:li.renjun@yahoo.com

    Reply
    Posted by: li r.
    January 12, 2014 - 9:42 PM
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