ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

Medicine
 

Summary

ووصف الإنتاجية العالية ، ومنصة الآلي للتصنيع الخلايا تطوير خط لإنتاج البروتين المداواة. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية دينار بحريني فارز الخلايا الأغنية ، وقد أثبتت CloneSelect تصوير والحرية TECAN EVO نظام مناولة السائل زيادة كبيرة في القدرة على معالجة وضع خط الخلية مع خلية تحسين جودة الخط واستنساخ عالية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shi, S., Condon, R. G., Deng, L., Saunders, J., Hung, F., Tsao, Y., Liu, Z. A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics. J. Vis. Exp. (55), e3010, doi:10.3791/3010 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الصناعة الصيدلانية البيولوجية التي تنمو بسرعة مطالب التطور السريع لنظم الإنتاج ذات كفاءة عالية وموثوق بها لتلبية الحاجة المتزايدة لإمدادات المخدرات. وقد شمل الجيل خطوط إنتاج الخلية تقليديا العمليات اليدوية التي تتطلب عمالة مكثفة ، وانخفاض الإنتاجية وعرضة لأخطاء بشرية. ونحن هنا التقرير منصة متكاملة عالية الإنتاجية والآلية لتطوير خطوط تصنيع الخلية لإنتاج البروتين المداواة.

مزيج من دينار بحريني FACS الأغنية ™ فارز الخلية ، وتصوير CloneSelect ™ TECAN EVO الحرية مكن ® نظام مناولة السائل خط خلية عالية الإنتاجية وأكثر كفاءة عملية التنمية. في هذه العملية ، يتم transfected first إنتاج الخلايا المضيفة مع ناقلات التعبير يحمل الجين المصالح 1 ، تليها العلاج مع وكيل التحديد. هي ملطخة ثم الخلايا ستابلي - transfected مع مضان المسمى مفتش الأضداد المضادة للبشرية ، وتخضع لاحقا لتحليل التدفق الخلوي 2-4. ويتم اختيار الخلايا المنتجة للغاية على أساس كثافة مضان ومعزولة عن طريق وحيدة الخلية الفرز على ™ FACSAria دينار بحريني. تم الكشف عن تشكيل مستعمرة من مرحلة وحيدة الخلية مجهريا واتخذت سلسلة من الصور الرقمية التي فات الوقت CloneSelect ™ تصوير لتوثيق التاريخ خط الخلية. بعد استنساخ واحدة شكلت ، كما تم عرض هذه الحيوانات المستنسخة لزيادة الإنتاجية التي تجرى على ELISA EVO الحرية TECAN ® السائل نظام المناولة. ويمكن فحص 10000 استنساخ لكل دورة عملية الإعداد مع النظام الحالي -- حوالي 2000.

وقد استخدم هذا النهج المتكامل لتوليد ارتفاع إنتاج المبيض الهامستر الصيني خطوط الخلية (شو) لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية (ماب) ، وكذلك البروتينات الانصهار بهم. مع المعونة من أنواع مختلفة من تحقيقات كشف ، يمكن استخدام أسلوب لتطوير علاجات أخرى أو البروتين يمكن تطبيقها على غيرها من نظم إنتاج المضيف. إلى إجراء مقارنة اليدوية التقليدية ، أظهرت هذه المنصة الآلي مزايا زيادة القدرة بشكل ملحوظ ، قابلية التنسيل مضمونا ، التتبع في التاريخ خط الخلية مع الوثائق الإلكترونية وفرصة أقل بكثير في الخطأ المشغل.

Protocol

1. الخلية المضيفة ترنسفكأيشن

  1. البذور 2 × 10 6 - CHO DXB11 الخلايا في خلية T75 كورنينج قارورة الثقافة في 15 مل متوسطة النمو (ميما مع النيوكليوتيدات والنيوكليوسيدات (Gibco ، رقم الكتالوج 12571) تستكمل مع 10 ٪ γ - المشع تتميز مصل بقري جنيني (cFBS) (HyClone ، رقم الكتالوج SH30071.03) و 10. مل / لتر من محلول جلوكوز 45 ٪ (سيغما ، كتالوج عدد G8769)) قبل يوم واحد ترنسفكأيشن
  2. في وقت ترنسفكأيشن ، وإعداد مجمعات ترنسفكأيشن على النحو التالي :
    1. تمييع 8 الحمض النووي في 800 ميكروغرام ميكرولتر من النمو دون المتوسط ​​في أنبوب المصل microcentrifuge العقيمة. المزيج بلطف.
    2. تمييع 40 ميكرولتر Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) في 800 ميكرولتر من النمو دون المتوسط ​​في أنبوب المصل البوليسترين.
    3. إضافة إلى الحمض النووي تضعف ™ Lipofectamine المخفف. المزيج بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة المتوسطة النمو من الخلايا في T75 واستبدالها مع 6.4 مل من متوسط ​​النمو دون المصل. إضافة 1.6 مل من المجمعات ترنسفكأيشن إلى القارورة. المزيج بلطف هزاز لوحة.
  4. احتضان خلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 6 ساعات.
  5. إضافة 8 مل من متوسط ​​النمو في قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 بين عشية وضحاها.
  6. إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط وإضافة جديدة للنمو متوسطة القارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 بين عشية وضحاها.
  7. استبدال المتوسطة متوسطة النمو مع التحديد (MEMA دون المتوسطة أو النيوكليوسيدات النيوكليوتيدات (Gibco ، رقم الكتالوج 12561) تستكمل مع 10 ٪ γ - المشع مدال مصل بقري جنيني (dFBS) (HyClone ، رقم الكتالوج SH30079.03) و 10 45 مل / لتر ٪ محلول الجلوكوز (سيغما ، رقم الكتالوج G8769)).
  8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 2-3 أسابيع.

2. الاستنساخ الخلوي عن طريق الفرز تدفق خلية المنشط

  1. إزاحة الخلايا من القارورة وأجهزة الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. Resuspend الخلايا في المتوسط ​​تستكمل مع اختيار الأبقار مصل الزلال 2 ٪ وfluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان على التخفيف 01:20.
  3. على الجليد لاحتضان 15-30 دقيقة ثم يغسل ومرتين مع PBS الباردة. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب البولي بروبلين.
  4. التحضير لفرز العقيم على ™ FACSAria دينار بحريني. إعداد 96 - جيدا زراعة الخلايا التي تحتوي على 200 لوحة متوسطة اختيار ميكرولتر في كل بئر.
  5. تحميل جو معقم و مطهر الأنبوب مع الخلايا وتحليل دينار بحريني على FACSAria ™ ، تسجيل النتائج للخلايا الملون وغير ملوثين ، على التوالي.
  6. تعيين غيتس والإعدادات لفرز الخلايا واحد من ملف مضان المطلوب في تلطيخ اللوحة جيدا - 96 (ق).
    1. هي أولا بتحليل الخلايا Transfected استنادا إلى الأمام مقابل مبعثر مبعثر الجانب. يرصد بوابة للخلايا الحية على أساس مبعثر إلى الأمام ، والذي يقيس حجم الخلية ، والتشرذم الجانب ، والذي يقيس تعقيد الخلية أو التفاصيل.
    2. ثم يتم فحص الخلايا التي تقع ضمن هذه البوابة لتلطيخ PE. يتم تعيين PE بوابة السلبية للخلايا transfected غير ملوثين أو الخلايا المضيفة الملون. كما يتم فحص خلايا transfected ملطخة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وحددت ثم "السامي PE" بوابة لتشمل أعلى 5 ٪ من كل الخلايا التي هي إيجابية لتلطيخ PE.
  7. احتضان لوحات في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة أسبوعين.

3. وثائق من تشكيل مستعمرة من قبل CloneSelect ™ تصوير

وثيقة تشكيل مستعمرة في 96 - جيدا على لوحات تصوير CloneSelect ™ في اليوم 0 ، 3 أيام ، يوم 7 ويوم 13 بعد FACS الفرز. فإن وثائق ضمان اختيار صورة من الحيوانات المستنسخة المشتقة من خلية واحدة. خطوة حاسمة في هذه الوثائق هو الحصول على ضبط البؤري بشكل صحيح لقياس 0 يوم ، لأنه ليس هناك خلية واحدة فقط في كل بئر عند تلك النقطة. من المهم جدا أن الصور واحدة من هذه الخلايا هي في التركيز ومحاولة لضبط التركيز عليها يمكن أن تكون مضللة في أحسن الأحوال. يمكن للطائرة تنسيق تتفاوت تفاوتا كبيرا بين أنواع من لوحات وربما حتى من الكثير الكثير من نفس الماركة. وبالتالي طائرة سلفا التنسيق يحتاج إلى استخدامها. ويمكن تحقيق ذلك من خلال التركيز على الخرز والجزئي أو اختبار الخلايا عالية الكثافة المودعة على لوحات الكثير من نفس المستخدمة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام لوحات نمت بشكل كامل من نفسه الكثير لهذا الغرض. FACS بعد الفرز ، من المهم أيضا السماح للخلايا تسوية مدة لا تقل عن 2 ساعة قبل التصوير ، بحيث أنها سوف تكون "ثابتة" في الموقف على لوحة.

4. الفرز والاختيار من الحيوانات المستنسخة مثمرة للغاية

  1. الوثيقة موقف عينة في لوحات تلقي مقايسة 96 - جيدا.
  2. aliquots نقل 20 ميكرولتر طاف (المخفف إذا لزم الأمر) في 96 - جيدا لوحات فحص من قبل EVO الحرية TECAN ® السائل نظام المناولة. هذا الروبوت مرنة وقادرةوقد تم تكييف جيم منصة لهذه الخلية وغيرها من ثقافة العمل الآلي. تم كتابة برامج خاصة للاستفادة من أفضل وتعزيز قدرات EVO الحرية الروبوتية لتطوير خط الخلية. مثال على ذلك هو تعيين TECAN لتفسير البيانات CloneSelect ™ تصوير لأخذ عينات الآبار مع المستعمرات واحد. وغيرها من البرامج المطلوبة لتنفيذ مهام إضافية مثل زراعة الخلايا لجعل التخفيفات المناسبة للعينات المأخوذة ، وتفسير ، وأنواع لوحات وضعت العينة يدويا إذا لزم الأمر ، من أجل زيادة إنتاج الحيوانات المستنسخة عالية ، وما يمكن أن العديد من هذه البرامج يمكن بسهولة تطبق على 384 لوحات جيدة وكذلك 96 الأصلية تنسيق جيد.
  3. ويتم تحليل إنتاج الأجسام المضادة في عينات من شطيرة الإنسان مفتش الكشف عن ELISA (بيرس ، روكفورد ، ايل) على الحرية EVO TECAN ® السائل نظام المناولة.
    1. والعينات القياسية. تم تحميلها (الإنسان المايلوما IgG1 ، كابا) (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في مرحلة ما قبل المغلفة بيو معطف مضاد للمفتش الإنسان لوحات الفحص دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، كاليفورنيا)
    2. والمحتضنة لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ثم يغسل PBS الثلاثة.
    3. وأضاف ImmunoPure عنزة المضادة للمفتش الإنسان ، (FC - غاما) - HRP (بيرس ، روكفورد ، ايل) على لوحة في التخفيف 1:2000 والمحتضنة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. تم غسلها لوحات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة ABTS الركيزة (بيرس ، روكفورد ، ايل) وتليت على القارئ باستخدام لوحة الامتصاصية في 405 نانومتر للكشف.
  4. حدد استنساخ مثمرة للغاية وتقييم الإنتاجية في الثقافة تعليق. لتتغذى على دفعات والثقافة ، وكان تلقيح الخلايا في 0.3X106 خلايا / مل في البروتين مجانا المتوسطة JRH ADVANTAGE الفوري 65578 (SAFC العلوم البيولوجية ، Lenexa ، KS) تستكمل مع 5 حلامة الصويا ز / لتر (DMV الدولية ، رقم الكتالوج SE50MAF UF - ، والكثير العدد) وحضنت في 37 درجة مئوية مع 7.5 ٪ CO 2. واصلت الثقافة واستكملت مع 2 ز / L الجلوكوز (سيغما ، G8769 عدد التسويقي ، وعدد الكثير 098K2329) عند تركيز الغلوكوز زائد اكتات في الثقافة وصلت إلى أقل من 2 غرام / لتر ، وتغذى 2 مم الجلوتامين (Gibco ، رقم الكتالوج 25030 ، كثيرا رقم 568177) عند مستويات الجلوتامين صلت إلى أقل من 200 ملغم / لتر (الأيضات تقاس Bioanalyzer YSI). أنهيت تغذيها الثقافات دفعة يوم 14 و إنتاج الأجسام المضادة والتي تقاس HPLC عكس المرحلة.
  5. الجينية توصيف استنساخ مرشح مضان التهجين في الموضع (FISH) 5.

5. ممثل النتائج :

ويرد مثال على الضد النامية المنتجة للاستنساخ مع أسلوب إنتاجية عالية في الشكل 1 والشكل 2. وكان ملون Transfected تجمع الخلايا مع fluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان (الشكل 1A) ، وتحليلها وفرزها على FACSAria ™ دينار بحريني (1B الشكل). تم تصوير تشكيل مستعمرة في لوحة 96 - جيدا على تصوير CloneSelect ™ (الشكل 1C). وأخذت عينات الخلايا طاف الثقافة من الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة ويعاير بواسطة ELISA على حرية TECAN نظام ® EVO مناولة السائل (1D الشكل). تم العثور على استنساخ مثمرة للغاية من الخلايا التي أظهرت ارتفاع مستوى الأجسام المضادة السطحية التي تعكسها تلطيخ مع الفلورسنت مفتش مكافحة الإنسان المسمى. عند المقارنة بين الحيوانات المستنسخة ولدت اثنين من سكان تجمع transfected الخلية الأولية ، والفارق الشاسع في الإنتاجية في تغذيتها على دفعات ولوحظ الثقافة (الشكل 2). لاستنساخ اثنين من كبار ولدت من السكان مع ارتفاع سطح الخلية التعبير الأضداد (PE العالي) ، وتراوحت إنتاجية محددة 50-70 جزء من الغرام / خلية / يوم. في حين أن الأجسام المضادة الإنتاجية ~ 20 بيكوغرام / خلية / يوم لاثنين من كبار الحيوانات المستنسخة ولدت من السكان مع انخفاض سطح الخلية التعبير الأضداد (PE منخفض). وعلاوة على ذلك ، والخطوط التي وضعتها خلية FACS الفرز هي أكثر استقرارا فيما يتعلق بالإنتاج الضد من تلك التي تم استنساخها من خلال تخفيف التجيير اليدوية (الشكل 3A). إنتاجية محددة من استنساخ العلوي ، انخفض "استنساخ 1" ، التي تم إنشاؤها بواسطة التخفيف من الجير اليدوي ~ 30 ~ 10 إلى PCD PCD بعد زرع الخلايا لالأضعاف 80. من ناحية أخرى ، فإن subclone الأعلى التي تم إنشاؤها بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والفرز ، "استنساخ 2" ، كان قادرا على الحفاظ على إنتاجية محددة نحو 20 PCD الأضعاف عن الخلية لا يقل عن 100. بواسطة فلوري التهجين في الموضع (FISH) ، أثبتنا استنساخ 1 اظهر كما اختلط فيها النمط الظاهري ألف (85 ٪) و (ب) النمط الظاهري (15 ٪). في المقابل ، FACS فرز استنساخ (استنساخ 2) التي أظهرت أن عدد السكان أكثر تجانسا مع 99.5 ٪ من الخلايا ثبت أن النمط الظاهري A (الشكل 3B)

الشكل 1
الشكل 1. التنمية خطوط تصنيع الخلية لإنتاج الاجسام المضادة من خلايا CHO. أ) تلوين سطح الخلية الأولي تجمع transfected مع fluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان. ب) من سكان الخلية الفرز مع كثافة عالية مضان (PE عالية) وكثافة منخفضة مضان (PE منخفض) في لوحة 96 - جيدا. ج) توثيق مستعمرةتشكيل من يوم بذر آخر 0 إلى 13 يوما في تصوير CloneSelect ™. فحص الحيوانات المستنسخة D) عن طريق ELISA.

الشكل 2
الشكل 2. مستوى سطح الجسم المضاد يرتبط ارتباطا والإنتاجية مع الضد من الخلية. وكانت كل من البلدان المتقدمة مع الحيوانات المستنسخة تلطيخ الفلورية العالية والمنخفضة إلى خطوط الخلية وتقييمها في تغذيها ثقافة الدفعي. وتمت مقارنة عيار الحجمي وإنتاجية محددة بين الحيوانات المستنسخة 2 أعلى كل السكان.

الشكل 3
الشكل 3. النسخ الناتجة عن الفرز FACS المعرض التجانس العالي الوراثية واستنساخ الاستقرار. أ) استقرار الانتاج في جسم الثقافة دفعة ل~ الأضعاف الخلية 80 من الوقت ينقضي الثقافة. Δ ، قد ولدت عن طريق استنساخ تخفيف الحد ، حيث كان المصنف الخلايا على 2000 خلية / كذلك ، 1000 خلية / جيد و 500 خلية / أيضا. مثلث أسود ، قد ولدت عن طريق استنساخ الخلية FACS في 1 / أيضا. ب) يتم تحديد موقع التحوير التكامل في كروموسوم الخلية CHO بواسطة نيون في الموقع التهجين.

Discussion

قدمنا ​​خلية التصنيع الآلي الخط الأساسي للتطوير العزلة التي تمكن من استنساخ مثمرة للغاية ، ويعنى في حين ان يضمن قابلية التنسيل استنساخ والاستقرار. إشراك تلوين الأجسام المضادة السطحية تليها فرز FACSAria الخلية ™ هو مفتاح الحصول على الحيوانات المستنسخة واحد مع الضد الإنتاجية العالية. نتائجنا وغيرها من التقارير 2-4 توحي بأن مستوى الأجسام المضادة عرض عابر على سطح الخلية مرتبطة بشكل جيد مع إنتاجية الخلية. وبالتالي ، يمكن استخدام الأجسام المضادة ، مترافق فلوريسئين الاعتراف المنتجات المرتبطة بها والمساعدات غشاء عزل المنتجين عالية. بدلا من ذلك ، وقد استخدمت coexpression الجينات مراسل وهلام microdrop التكنولوجيا لتسهيل اختيار عالية استنساخ بواسطة FACS 6-8. بالإضافة إلى عزل الحيوانات المستنسخة عالية المنتجة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، تطورت تقنيات أخرى لتحقيق نفس الهدف. وتشمل هذه التكنولوجيا تعريشة CellSpot العلوم البيولوجية التي تستخدم أنظمة الكشف عن الأجسام المضادة microspere وتكنولوجيا الليزر لتحديد الفرز استنساخ مثمرة للغاية والقضاء على الخلايا غير المرغوب فيها ، Genetix ClonePix FL StemCell وتقنيات منصة EasyPick ClonaCell تؤدي سرعة عالية فحص خطوط إنتاج الخلية باستخدام نظام كشف الأجسام المضادة الفلورسنت . اخترنا لتنفيذ أسلوب الاستنساخ FACS على أساس مستوى سطح الجسم المضاد يرتبط لأنه يجمع بين سهولة التشغيل والانتقائية على الإنتاجية وقابلية التنسيل.

توظيف الحرية TECAN نظام ® EVO مناولة السائل زيادة كبيرة في إنتاجية الفرز ، والتي توفر الفرصة لاختيار لاستنساخ عالية الغلة من تجمع الخلايا أكبر من ذلك بكثير. أجهزة أخرى لفحص مثل HTRF ، BioForte اللحن الثماني ، HPLC ، الخ ، وجميع الوسائل الممكنة لتحديد وفحص المنتجين عالية من المنتجين منخفضة. من خلال تتبع تشكيل استنساخ مع CloneSelect تصوير ™ ، ولدت لنا الوثائق اللازمة لإثبات قابلية التنسيل رقمية مع خلية خط التاريخ. ويؤكد كذلك قابلية التنسيل التي تميز وراثيا واحد موقع التكامل التحوير على الكروموسوم. وهكذا يمكن خطوة subcloning التي تؤخذ عادة لضمان قابلية التنسيل ، لا يمكن إزالتها. وهذا سيوفر 4-8 أسابيع من الوقت لتطوير خط الخلية. باختصار ، أظهرت نوعية خطوط الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة منصة عالية الإنتاجية الآلي إنتاجية عالية ، والاستقرار وتوثيق تاريخ الإنتاج خط الخلية التي يجب أن تلبي الطلب على الانتاج الواسع النطاق والمتطلبات التنظيمية الحالية.

Disclosures

كتاب هذه المقالة هي من موظفي شركة ميرك وشركاه ، وشركة ، الذين يستخدمون هذه الطريقة لانتاج على نطاق واسع من العلاجات البروتين من خطوط الخلايا الثديية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACS Aria™ Cell Sorter BD Biosciences
CloneSelect™ Imager Genetix
TECAN Freedom EVO® liquid handling system Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization. Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).
  2. Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity. J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).
  3. Kromenaker, S. J., Srienc, F. Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study. Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).
  4. Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry. Cytometry. 11, 498-505 (1990).
  5. Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing. Cytomery. 43, 101-109 (2001).
  6. Meng, Y. G. Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells. Gene. 242, 201-207 (2000).
  7. DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen. Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).
  8. Weaver, J. C. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells. Nat. Med. 3, 583-585 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics