Hyperinsulinemic-euglycemic Klemmer i Conscious, Uhemmet Mus

Published 11/16/2011
21 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin klemme, er gullstandarden for vurdering av insulin handling

Cite this Article

Copy Citation

Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Type 2 diabetes er preget av en defekt i insulin action. Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin klemme, er viden betraktet som "gullstandarden" metode for å vurdere insulin action in vivo. Under en insulin klemme, er hyperinsulinemia oppnås ved en konstant insulin infusjon. Euglycemia opprettholdes via en samtidig glukose infusjon med en variabel rente. Denne variabelen glukoseinfusjon rate (GIR) bestemmes ved å måle blodsukker ved korte intervaller gjennom hele eksperimentet og justere GIR tilsvarende. GIR er et tegn på hele kroppen insulin action, som mus med forbedrede insulin handling krever en større GIR. Den insulin klemmen kan innlemme administrasjon av isotopiske 2 [14 C] deoxyglucose å vurdere vev-spesifikke glukoseopptak og [3 - 3 H] glukose for å vurdere muligheten for insulin å undertrykke frekvensen av endogen glukose utseende (Endora), en markør for hepatisk glukoseproduksjon, og å stimulererate på hele kroppen glukose forsvinning (Rd).

Miniatyrisering av insulin klemme for bruk i genetisk musemodeller av metabolsk sykdom har ført til betydelige fremskritt innen diabetes forskning. Metoder for å utføre insulin klemmer varierer mellom laboratorier. Det er viktig å merke seg at måten en insulin klemme er utført kan påvirke resultatene. Vi har publisert en omfattende vurdering av ulike tilnærminger til å utføre insulin klemmer i bevisst mus 1 samt en evaluering av de metabolske responsen av fire brukte innavlede mus stammer med ulike clamp teknikker 2. Her presenterer vi en protokoll for å utføre insulin klemmer på bevisst, hemningsløs mus utviklet av Vanderbilt Mouse Metabolsk fenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / mmpc). Dette inkluderer en beskrivelse av metode for å implantere kateter brukt under insulin klemmen. Protokollen ansatt iVanderbilt MMPC benytter en unik to-kateter system 3. Et kateter settes inn i vena jugularis for infusjoner. En annen kateter settes inn i carotisar, som gir mulighet for blodprøver uten å måtte begrense eller håndtere musen. Denne teknikken gir en betydelig fordel for den vanligste metoden for å innhente blodprøver i løpet av insulin klemmer som skal prøve fra kuttet tuppen av halen. I motsetning til sistnevnte metoden, sampling fra en arteriell kateter er ikke stressende å musen 1. Vi beskriver også metoder for bruk av isotoper tracer infusjoner å vurdere vev-spesifikke insulin action. Vi kan også gi retningslinjer for den aktuelle presentasjonen av resultatene fra insulin klemmer.

Protocol

1. Utarbeidelse av katetre og mus antenne for Sampling Access (MASA tm)

  1. Forbered arteriekateter ved å sette inn en 1,3 cm stykke av PE-10 (0,011 tommer indre diameter) i en 6 cm stykke silastic tubing (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1A. Bevel spissen av PE-10 med en skalpell slik at lengden fra enden av silastic til tuppen av skråkant er 0,9 cm.
  2. Forbered venekateter ved å skyve en 1 mm stykke silastic tubing (0,020 tommer indre diameter) 1,1 cm fra den skrå enden av en 6 cm stykke silastic tubing (0,012 tommer indre diameter) som vist i Figur 1B. Den 1 mm stykke silastic brukes som et besøksforbud perle.
  3. For å forberede en MASA tm, setter hver av to 1,3 cm stykker av 25 gauge rustfritt stål plugger i hver av to 3 cm biter av PE-20 (0,015 tommer indre diameter).
  4. Sikre PE-20/connectors til hverandre ved å skyve en 5 mm stykke silastictubing (0,040 tommer indre diameter) over området der stål rør og PE-20 møtes.
  5. Bøy stålrør til en ~ 120 ° vinkel og skill hvert rør av ~ 45 °.
  6. Plasser ferdig riggen i en klatt av medisinsk silikon slik at PE-20 rør er loddrett og endene av rustfritt stålrør utover limet (figur 1C). Tillat denne for å stille for 24h.

2. Kirurgisk kateterisering

  1. Før kirurgi, sterilisere katetre med 70% etanol, fyll dem med heparinisert saltvann (200 U heparin / ml saltvann) og sett i rustfritt stål plugger.
  2. Anesthetize mus, fortrinnsvis ved hjelp av en metode som kontinuerlig leverer anestesimiddel (f.eks inhalert isofluran).
  3. Bruk steril teknikk, fjerne hår fra snittet områder ved hjelp clippers og / eller en hårfjerningskrem krem ​​og desinfiser huden med alkohol etterfulgt av en betadine skrubb. For kateterinnleggelse, fjerne hår påregionen som strekker seg fra underkjeven til toppen av brystkassen og mellom clavicles. For eksternalisering av kateter bak hodet, fjerne hår i området mellom bunnen av skallen og interscapular regionen og desinfiser huden med alkohol etterfulgt av en betadine skrubb.
  4. Legg musen på ryggen på en varmende overflate og under visning området av et kirurgisk mikroskop. Fest halen og ekstremiteter med kirurgisk tape. Sikre hodet i nesen kjegle levere anestesi.
  5. Lag en liten vertikalt midtlinjen snitt 5 mm cephalica til brystbenet. Bruk pinsett, sløv dissekere vevet å eksponere venstre sternomastoid muskel. Reflektere denne muskelen å eksponere venstre carotisar. Forsiktig tease off bindevev fra arterien. Det er viktig på dette punktet for å isolere vagus nerven fra en arterie uten å skade verken arterien eller nerven.
  6. Isoler arterien og ligate den cephalica enden med silke sutur. Løst knute annenstykke sutur på caudal slutten av utsatte fartøyet.
  7. Clamp fartøyet med en micro-serrefine klemme på den bakre enden og kuttet like nedenfor ligated enden med våren saks. Forsiktig inn kateter så langt som klemmen. Nøye slipp mikro-serrefine klemme og forhånd kateteret til silastic-PE krysset.
  8. Tie både ligaturer sikkert til kateteret og bekrefter at kateteret prøvene ved å koble den frie enden av kateteret til en sampling sprøyte.
  9. Gjør et annet snitt 5 mm til høyre for midtlinjen og ca 2 mm caudal til den første snittet. Bruk pinsett, sløv dissekere vevet å avsløre og isolere høyre vena jugularis.
  10. Nøye ligate den cephalica ende med silke sutur og løst slips annen bit av sutur ved caudal slutten.
  11. Klipp rett nedenfor cephalica ligaturen med våren saks og sette kateteret opp til besøksforbud perle. Tie en sutur bak perle og bekrefter at kateteret prøvene.
  12. Turn musen over og lage et lite snitt mellom skulderbladene.
  13. Tunnel en 14-gauge nål under huden fra snittet for arteriekateter, på forsiden av musen, til interscapular snitt på baksiden. Tre arteriekateter gjennom nålen å exteriorize det på baksiden av musen. Gjenta dette for vena jugularis kateter ved tunnel på 14-gauge nål under huden på høyre side av musen fra snittet nettstedet på forsiden til interscapular snitt på baksiden.
  14. Klem arteriekateter med en micro-serrefine klemme på innsnitt området mellom skulderbladene. Skjær kateteret ~ 1 cm over denne klemmen. Plasser MASA tm med rustfritt stål kontaktene vender mot hodet av musen. Koble arteriekateter til rustfritt stål kontakten pekte mot venstre side av musen. Pass på å sikre at det ikke er hull eller knekk på kateteret. Gjenta for venekateter,koble den til rustfritt stål kontakten peker til høyre side av musen.
  15. Sett MASA tm i snitt mellom skulderbladene. PE-20 rør tilsvarer vena jugularis kateteret skal være til høyre side av musen og PE-20 rør tilsvarer arteriekateter bør ligge til venstre.
  16. Lukk ventral og dorsal snitt med nylon sutur. For dorsal stengetid, kan sutur kjøres gjennom herdet silikon av MASA tm å feste den på plass. Bekreft patency av kateter med en flushing løsning som inneholder heparinisert saltvann og antibiotika for å minimere risikoen for infeksjon. Plasser musen i en oppvarmet, rent bur for umiddelbar gjenoppretting. Figur 2 viser det ferdige produktet.
  17. La musen til å gjenopprette i minst 5 dager. Monitor vekt og generell helse. Utnytte den aktuelle postoperative smertestillende diett som er godkjent av institusjonens Animal Care ogBruk Committee.

3. Hyperinsulinemic-euglycemic klemme

  1. Rask musen for 5-6t. Som en referanse, refererer tiden t = 0 min til slutten av den raske og begynnelsen av insulin og glukose infusjonsvæske (dvs. klemmen perioden).
  2. Oppsettet og tidsplan for en typisk forsøk er vist i figur 3. Bruk Micro-Renathane eller tilsvarende slange for infusjon og prøvetaking linjer. Suspendere en dual-channel sving over musen. Dette fungerer som et knutepunkt mellom musen og infusjon / sampling sprøyter. Under eksperimentet forblir musen i et hjem bur eller lignende beholder, og er bundet til svivelen.
  3. Før tilkobling av mus, fyll arteriell prøvetaking linje med heparinisert saltvann (10 U heparin / ml saltvann) og plasser i rustfritt stål kontakten i bunnen slutten av linjen. Legg igjen en sprøyte med heparinisert saltvann (clearing sprøyte) koblet til toppen av prøvetaking linjen. Dette vil bli brukt til å trekke opp blod SAMPles.
  4. Fyll venøs infusjon linje med ikke-heparinisert saltløsning starter fra Infusjonsporten av svivelen (segment A i figur 3A) hele veien til bunnen av linjen. Plugg den øverste enden av linjen og plassere et rustfritt stål kontakt (eller en Y-kobling hvis en bolus skal administreres) nederst slutten av linjen. Hvis en isotop glukose tracer (f.eks [3 - 3 H] glukose) blir tilført, sikre en 1 ml sprøyte som inneholder tracer til en infusjon sprøyte. Fyll venøs infusjon linje med tracer istedenfor saltvann (Figur 3B).
  5. Tre timer inn i den raske, veie musen, og koble PE-20 for vena jugularis og arterielle katetre til infusjon og prøvetaking linjer, henholdsvis.
  6. Hvis administrere [3 - 3 H] glukose tracer, begynne en primet-kontinuerlig tracer infusjon ved t = -90 min (Figur 3C). En typisk priming dose er 1 μCi. Utarbeide en 0,05 μCi / mikroliter [3 - 3 H] glukose solution i ikke-heparinisert saltvann. Load løsningen i en 1 ml sprøyte og sikre sprøyten i en infusjonspumpe. Administrere priming dosen med infusjonen 20 mL / min for 1 min. Følg med en kontinuerlig infusjon på 0,05 μCi / min (1 mL / min) for en 90 min likevekt perioden.
  7. Forbered infusates av insulin og glukose. Insulin er utarbeidet i ikke-heparinisert saltløsning som inneholder 3% plasma som en transportør (en passende konsentrasjon av BSA kan også brukes). Glukose infusates er kommersielt tilgjengelig i en rekke konsentrasjoner (5, 20 og 50%).
  8. Forbered saltvann-vasket erythorocyte infusate ved å få fullblod fra en donor mus, helst av samme belastning bakgrunn som eksperimentell mus. Vanligvis 1 ml av fullblod er nødvendig per studere mus. Sentrifuge blod å skille erytrocytter. Vask erytrocytter med 10 U / ml heparinisert saltløsning og sentrifuger til å forkaste saltvann. Bestem volumet av erytrocytter og resuspender i et tilsvarende volum på 10 U / ml heparinized saltvann.
  9. Tegn hver infusate inn i en 1 ml sprøyte og sikker hver sprøyte til en individuell infusjonspumpe. Koble hver sprøyte til en 4-veis kontakt (figur 3).
  10. Ved t = -15 min ta en blodprøve ved sakte å utarbeide 50-100 mL av blod inn i clearing sprøyten. Klem arteriell prøvetaking linjen og fjern clearing sprøyten. Ved hjelp av en håndholdt glukose meter, ta et blodsukker lesing ved å fjerne klemmen på arteriell prøvetaking linjen og lar blodet å strømme inn i glukosemåler stripen.
  11. Når glukose måling er tatt, klemme den arterielle prøvetaking linjen og sette inn en stump-nål sprøyte (sampling sprøyte) inn i arteriell prøvetaking linjen. Fjern klemmen og tegne en mengde blod (se note) i prøvetaking sprøyten. Klem arteriell prøvetaking linjen og fjern prøvetaking sprøyten. Sett clearing sprøyten tilbake i arteriell prøvetaking linjen. Tegn opp på stempelet for å fjerne eventuelle luftbobler og re-fyller50-100 mL blod som opprinnelig var tegnet.

Merk: Volumet av blod samplet avhenger analysen utføres. For eksempel, analyse av [3 - 3 H] krever glukosekonsentrasjonen 10 mL av plasma, så 50 mL blod er trukket. Dette gir 20-30 mL av plasma, som er tilstrekkelig for analyse pluss ekstra plasma hvis nødvendig. Målinger av hormoner og andre metabolitter (f.eks insulin, frie fettsyrer) krever prøvetaking av ekstra blod.

  1. Tilsett blod i prøvetaking sprøyten inn en EDTA-belagt microtube. Sentrifuge og samle plasma. Hold plasma på is fram til slutten av studien eller umiddelbart butikken ved -20 ° C.
  2. Gjenta trinn 3,10 gjennom 3,12 ved t = -5 min. Innhente ytterligere blod (50 mL) for måling av baseline plasma insulin nivåer. Mål baseline hematokrit ved å tegne blod inn i et heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør. Målingene innhentet from plasmaprøver ved t = -15 og -5 min representere baseline (dvs. faste) verdier.
  3. Etter prøven ved t = -5 min, fylle infusjon linjer for glukose, insulin og salt-vasket erytrocytter opp til 4-veis kontakt. Koble 4-veis kontakten til slangen er festet til svivelen Infusjonsporten (eller slange koblet til Y-kobling hvis infusjonen [3 - 3 H] glukose) som vist i Figur 3.
  4. Begynn infusjonen saltvann-vasket erytrocytter først. Sett infusjonshastigheten å erstatte det totale volumet av blod blir samplet over varigheten av studien (f.eks hvis en total av 500 mL blod er samplet over 120 minutter av studien, sette infusjonshastighet til 4,2 mL / min). I motsetning til de andre infusates er erytrocytt løsningen rødt. Infusjonen denne løsningen gir først for eventuelle motstand eller hindringer i infusjonen linjer for å bli identifisert og korrigert.
  5. Når erytrocytt infusate når musen begynner insulin ogglukose infusjoner. Dette er nå t = 0 min. Insulin er tilført en konstant, forhåndsbestemt rate. En insulin infusjonshastighet på 4 mU • kg -1 • min -1 vil typisk undertrykke endogen glukose produksjonen med 80-100% og stimulere glukose forsvinning av 2-3 fold. Den innledende glukoseinfusjon rate (GIR) er estimert basert på baseline blodsukker og tidligere erfaring.
  6. Hvis infusjonen [3 - 3 H] glukose, kan man velge å øke tracer infusjonshastigheten for å matche den anslåtte økningen i glukose omsetningen (vanligvis en 2-3 ganger økning).
  7. Tatt i betraktning den høye frekvensen av glukose omsetningen i mus, bør blodprøver hentes fra den arterielle linjen ikke mindre enn hvert 10 min for måling av glukose konsentrasjon over varigheten av forsøket. Juster GIR å oppnå og opprettholde mål euglycemia (Figur 3C). Dette målet kan variere avhengig av modell eller formålet med studien. Et godt mål glucose konsentrasjon er 150 mg • L-1 siden dette er en typisk 6t fastende glukose nivå for en chow-matet C57Bl/6J mus.
  8. Målet er å oppnå euglycemia raskt, helst innen de første 40-50 min, og for å ha glukose og GIR stabil ved begynnelsen av steady-state periode (t = 80 min).
  9. Hvis infusjonen [3 - 3 H] glukose, innhente ytterligere blod på t = 80, 90, 100, 110 og 120 min for måling av plasma [3 - 3 H] glukose spesifikke aktivitet.
  10. Samle ekstra blod ved t = 100 og 120 min for måling av plasma insulin og andre hormon (s) eller metabolitten (e). Ved t = 110 min, trekker blodet inn i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør for måling av klemme hematokrit.
  11. Etter prøven ved t = 120 min er tatt, 2 [14 C] deoxyglucose kan gis for måling av vev-spesifikke glukoseopptaket. Administrere en 12 μCi bolus inn i bolus linjen koblet til jugularis prøvetaking linje (Figur 3B
  12. Innhente blodprøver (50 mL) fra den arterielle prøvetaking linjen ved t = 2, 15, 25 og 35 min etter inntak av bolus for måling av plasma 2 [14 C] deoxyglucose nivåer.
  13. Etter den siste prøven, anesthetize musen med en infusjon av pentobarbital gitt direkte inn i arteriell linjen. Raskt dissekere noen vev er nødvendig for vurderingen av glukoseopptak (f.eks skjelettmuskulatur av ulike typer, fettvev, hjerte, hjerne) og eventuelle andre vev (for eksempel lever, milt, nyrer). Snap fryse vev i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C til de analysert. Tissue glukose er analysert ved å måle akkumulasjon av fosforylert 2 [14 C] deoxyglucose i frosset vev og forsvinningen av 2 [14 C] deoxyglucose fra plasma.

Fire. Representant Resultater

Et eksempel på resultatene oppnådd fra et insulin klemme forsøket er vist i Figur 4.Dette eksempelet viser evne til et fettrikt kosthold for å fremskynde insulinresistens hos mus. Alle presentasjoner av insulin klemme resultater må inneholde følgende å bli tolke: en gang i løpet av blodsukker, en tid løpet av GIR og plasma insulin nivåer (baseline og klemme). Som vist her, fastende glukose (figur 4A) og insulin (Figur 4C) nivåene er høyere i mus matet en høy fett diett, som tyder på insulinresistens. Presentere en tid i løpet av blodsukkeret gjennom hele klemme studien (figur 4A) tillater leseren å vurdere hvor godt euglycemia ble opprettholdt, noe som er en indikasjon på kvaliteten av klemmen. Tilsvarende tillater en gang løpet av GIR (Figur 4B) leseren å avgjøre hvor raskt en steady-state ble oppnådd. Viser disse dataene ettersom tiden kurs er betydelig mer informativ enn den konvensjonelle praksis i musen insulin klemmen litteratur av å presentere en 2-timers eksperimentsom en enkelt datum punkt representerer gjennomsnittsverdier fra en udefinert "klemme" perioden (4-13). I dagens eksempel, var blodsukkeret lik mellom kontroll og høye fett-matet grupper, men GIR var signifikant lavere i høy fett-matet gruppe (Figur 4B). Dette er et tegn på en svekkelse i hele kroppen insulin action. Clamp insulin nivåene var også høyere i høy fett-matet gruppe (Figur 4C), noe som ytterligere støtter tilstedeværelsen av en insulin resistent fenotype i disse musene. Bruk av isotoper tracer infusjoner gjør for vurdering av insulin action i bestemte vev. [3 - 3 H] glukose brukes til å anslå frekvensen av endogen glukose utseende (Endora), som er en indeks av hepatisk glukoseproduksjon (HGP) og frekvensen av hele kroppen glukose forsvinning (Rd). Mens insulin helt undertrykker HGP i kontroll mus, dette er svekket i mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4D). Likeledes evne til isulin å stimulere Rd i kontroll mus er kompromittert på mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose brukes for å vurdere glukose metabolske indeks (RG), et mål av vev-spesifikke glukoseopptaket. Som vist i dette eksemplet er insulin-stimulert glukoseopptak i skjelettmuskulatur svekket i mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4F).

Figur 1
Figur 1: Utarbeidelse av arteriell (A) og (B) venøse katetre og (C) MASA tm. Arterielle katetre er forberedt ved å sette inn en 1,3 cm stykke av PE-10 ca 3 mm inn i en 6 cm stykke 0.012 "ID silastic. PE-10 spissen er skrå slik at lengden fra bevel til silastic er 0,9 cm. Venøse kateter er laget ved å skyve et lite stykke 0.020 "ID silastic 1,1 cm fra den skrå enden av en 6 cm stykke 0.012" ID silastic. Den 0.020 "ID silastic stykke fungerer som et besøksforbud perle å se kur kateteret til vena jugularis. For montering av MASA tm, hver av to 1,3 cm 25-gauge plugger settes inn i hver av to 3 cm biter av PE-20. Disse er holdt sammen av et lite stykke 0.040 "ID silastic. Kontaktene er bøyd til en 120 ° vinkel og skilt i 45 ° vinkel. Hele forsamlingen er nedsenket i medisinsk silikon.

Figur 2
Figur 2: Catheterized mus. Kateter er implantert i venstre carotisar og høyre vena jugularis. Den frie endene av kateter er externalized bak hodet og koblet til en MASA tm. Den MASA tm settes subkutant mellom skulderbladene. Dette åpner for vaskulær tilgang løpet insulin klemme eksperimenter uten behov for å begrense, håndtak eller anesthetize musen.

jpg "/>
Figur 3: Visning av oppsett og tidslinje for en insulin klemme eksperiment. Musen er tjoret til en dual-channel svivel som fungerer som en hub for infusjon og prøvetaking sprøyter. Typisk oppsett for eksperimenter ikke bruker tracer infusjoner (A) og bruker både [3 - 3 H] glukose og 2 [14 C] deoxyglucose (B) er vist. En tidslinje av prosedyrer for etablering og gjennomføring av insulin klemme (C) er også vist. Under klemmen, blodprøver ( blod ) Blir tatt hvert 10 min for å måle blodsukker. GIR er justert tilsvarende for å opprettholde euglycemia. Prøver for baseline blodsukker, plasma insulin, og plasma [3 - 3 H] glukose er tatt ved t = -15 og -5 min. Prøver for clamp plasma [3 - 3 H] glukose er tatt ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 og for klemme insulin ved t = 100 og 120 min. 2 [14 C] deoxyglucose er gitt etter prøven ved t = 120 min og blood samles ved t 2 =, 15, 25 og 35 min etter. Vev er tatt etter t = 35 min prøve.

Figur 4
Figur 4: Resultater fra en insulin klemme eksperiment sammenlikne mus på en kontroll kosthold (Chow) til mus på et fettrikt kosthold (HFD). Tid løpet av arteriell glukose (A) og GIR (B), baseline og klemme insulin (C), Endora (D), og Rd (E) og skjelettmuskelbetennelse (gastrocnemius og vastus lateralis) Rg (F) er vist. Alle resultater indikerer at effekten av høyt fettinnhold fôring å indusere insulinresistens.

Discussion

Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin klemme, er viden betraktet som "gullstandarden" metode for å vurdere insulin action in vivo. Denne teknikken har blitt brukt til flere arter, inkludert mennesker, hunder, rotter og mus. Gitt den økende antall av transgene mus modeller for metabolske forstyrrelser, har miniatyrisering av teknikken til bruk i musen gitt betydelig fremskritt for metabolsk forskning.

Mens konseptene bak insulin klemmen er grei, i praksis er det ulike tilnærminger for å utføre insulin klemme eksperimenter. Dette er ikke en triviell punkt, siden måten forsøket er utført påvirker resultatene 1. Her presenterer vi protokollen som brukes ved Vanderbilt MMPC. Den viktigste forskjellen mellom vår protokoll og andres, er at vi bruker en arteriell kateter for å innhente blodprøver. Dette er i kontrast til den mer utbredt tilnærming av OBTaining blodprøver av kuttet tuppen av de 4 halen, 7, 11, 12, 14-17. Fordelen med prøvetaking fra et arterielt kateter er at eksperimentet er utført i en bevisst og uhemmet mus. Prøvetaking fra halen krever ofte tilbakeholdenhet og øker indekser av stress når store blodprøver blir kjøpt en. Stress hormoner stimulere endogen glukoseproduksjon og svekke glukose disposisjon 18, 19, potensielt gir inntrykk av en insulin resistent fenotype. Prøvetaking fra avkuttede halen kan kreve spesiell Institusjonelle Animal Care og Bruk komité godkjennelse på grunn av sin stressende natur. Den arteriell kateterisering prosedyren ble utviklet for å unngå stress til musen av kuttet halen.

En sentral del av å utføre insulin klemmer er evnen til å opprettholde euglycemia. Det er ingen algoritmer som kan tippe hvordan GIR bør justeres basert på blodsukker målinger. I likhet med kirurgi,personell gjennomfører insulin klemme eksperimenter vil bli dyktigere i å opprettholde en rimelig euglycemia bare gjennom erfaring. Det er viktig å merke seg at på grunn av sin høyere metabolic rate data innhentet fra mus studier vil være naturlig støyende. Dette gjør den komplette presentasjonen av data, inkludert gang kurs av glukose og GIR og absolutte verdier for plasma insulin, Endora, Rd og Rg avgjørende for evnen til enhver leser å tolke resultatene. Den høye glukose fluks priser hos mus (ca 5 ganger høyere enn raten hos mennesker) garanterer en høy frekvens av glukose prøvetaking. Mens blod volumet av musen er begrenset, er et minimum sampling frekvens på hvert 10. minutt er nødvendig for å være sikker på at en tilstrekkelig clamp er oppnådd.

Som vist i figur 4, kan klemme insulin nivåer være forskjellig mellom gruppene. Faktorer som kosthold intervensjoner, transgene manipulasjoner eller forskjeller i bakgrunnen stammer kan påvirke FASting insulin nivåer, som senere kan påvirke klemme insulin nivåer. Tolke resultater når klemme insulin nivåer er forskjellige kan være problematisk. Dette kan være eksperimentelt løses ved å utføre pilot eksperimenter for å velge insulin infusjon priser som oppnår tilsvarende klemme insulin nivåer mellom gruppene. Alternativt kan somatostatin brukes til å hemme pancreatic hormon sekresjon, og insulin og glukagon kan erstattes ved eksperimentelt kontrollerte priser. Denne siste metoden er mer vanlig gjort på insulin klemmer på rotter enn mus. Hvis disse eksperimentelle tilnærminger ikke blir tatt, kan den steady-state GIR være normalisert til klemmen insulin nivå, eller en insulinfølsomheten indeks (S I) kan være avledet fra klemmen data som S I = GIR / (G • ΔI), der G er steady-state glukose konsentrasjon og ΔI er forskjellen mellom faste og klemme insulin konsentrasjoner. En forutsetning med enten tilnærming er at klemmen insulin nivå oppnådd erinnenfor området der insulin sensitivitet er lineært relatert til insulin nivå i henhold til gruppen som studeres. Denne siste forutsetningen ikke gjelder når man sammenligner insulinresistente og insulin sensitive grupper. Ideelt sett bør en insulin dose respons kurve kan genereres til å velge riktig insulin infusjon. Men på grunn av kravet om ytterligere eksperimenter, er dette sjelden gjort.

Allsidigheten leveres av arteriell kateterisering strekker seg til eksperimentelle tilnærminger utover euglycemic klemmer. For eksempel kan hyperglykemiske klemmer, hvor glukose er infused med variabel hastighet for å opprettholde hyperglycemia forhold til fastende glukose, brukes til å vurdere endogent bukspyttkjertelen funksjon i to vivo, 20, 21. Måling av første fase insulinsekresjon under denne testen krever hyppige oppkjøp av blodprøver (dvs hver 2-5 min), som ikke er gjennomførbart når skaffe prøver fra tuppen av halen. Videreforhøyet katekolaminer skyldes hale prøvetaking kan svekke insulinsekresjon og forbedre glukagonsekresjon 22. Den insulin klemme Protokollen kan også endres for å tillate blodsukkeret faller til relative hypoglykemi å vurdere counter-regelverk respons 2, 23, 24. Arteriell kateterisering kan også brukes til å vurdere dynamikken i glukosemetabolismen under trening 25-30. Dette er en betydelig fordel i forhold til konvensjonelle tilnærminger gjennomført på ett tidspunkt før og etter trening eller i isolerte muskler ex vivo. Teknikkene som presenteres her kan også brukes til å vurdere ikke bare glukose, men også fettsyre metabolisme 31.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Grant 5-U24-DK059637-10 til Vanderbilt Mouse Metabolsk fenotyping Center.

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats