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 JoVE Medicine

Hyperinsulinémique euglycémique-pinces dans Conscient, Souris illimités

1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3

1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

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    Summary

    La pince hyperinsulinémique-euglycémique, ou pince à l'insuline, est le gold standard pour évaluer action de l'insuline

    Date Published: 11/16/2011, Issue 57; doi: 10.3791/3188

    Cite this Article

    Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

    Abstract

    Diabète de type 2 est caractérisé par un défaut dans l'action d'insuline. La pince hyperinsulinémique-euglycémique, ou pince à l'insuline, est largement considéré comme le «gold standard» pour évaluer la méthode action de l'insuline in vivo. Lors d'une pince à l'insuline, l'hyperinsulinémie est réalisé par une perfusion d'insuline constant. Euglycémie est maintenue par une perfusion de glucose concomitante à un taux variable. Ce taux de glucose variables perfusion (GIR) est déterminée en mesurant la glycémie à intervalles brefs long de l'expérience et en ajustant le RIF en conséquence. Le RIF est indicatif de l'action d'insuline du corps entier, comme des souris avec action de l'insuline améliorée exigent une plus grande RIF. La pince d'insuline peuvent intégrer l'administration de 2 isotopique [14 C] désoxyglucose pour évaluer tissu-spécifique et la captation du glucose [3 - 3 H] glucose pour évaluer la capacité de l'insuline à supprimer le taux d'apparition de glucose endogène (Endora), un marqueur de production hépatique de glucose et de stimuler lataux de disparition du glucose du corps entier (Rd).

    La miniaturisation de la pince d'insuline pour une utilisation dans des modèles murins de maladies métaboliques génétiques a permis des avancées significatives dans la recherche de diabète. Méthodes pour effectuer des colliers d'insuline varient entre laboratoires. Il est important de noter que la manière dont une pince d'insuline est effectuée peuvent affecter significativement les résultats obtenus. Nous avons publié une évaluation exhaustive des approches différentes pour effectuer pinces d'insuline chez des souris conscientes 1 ainsi que l'évaluation de la réponse métabolique de quatre couramment utilisés souches de souris consanguines en utilisant des techniques de serrage différents 2. Nous présentons ici un protocole pour la réalisation de l'insuline sur pinces consciente, souris effrénée développé par le Centre Vanderbilt souris métaboliques phénotypage (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC). Cela comprend une description de la méthode d'implantation des cathéters utilisés lors de la pince d'insuline. Le protocole employé par leVanderbilt MMPC utilise un système unique 3 deux-cathéter. Un cathéter est inséré dans la veine jugulaire pour des infusions. Un deuxième cathéter est inséré dans l'artère carotide, ce qui permet de prélèvement de sang, sans la nécessité de restreindre ou de manipuler la souris. Cette technique offre un avantage important à la méthode la plus courante pour obtenir des échantillons de sang pendant pinces insuline qui est de l'échantillon de l'extrémité de la queue coupée. Contrairement à cette dernière méthode, l'échantillonnage à partir d'un cathéter artériel n'est pas stressant de la souris 1. Nous décrivons également des méthodes d'utilisation des perfusions traceurs isotopiques pour évaluer action de l'insuline des tissus spécifiques. Nous fournissons aussi des directives pour la présentation appropriée des résultats obtenus à partir pinces insuline.

    Protocol

    1. Préparation de cathéters et d'antenne pour l'accès à l'échantillonnage de la souris (MASA tm)

    1. Préparer cathéter artériel en insérant un morceau de 1,3 cm de PE-10 (0.011 pouces de diamètre interne) dans un morceau de 6 cm de tube de silastic (0,012 pouces de diamètre interne) comme dans la Figure 1A. Biseau l'extrémité de la PE-10 avec un scalpel afin de la longueur de la fin de l'silastic à la pointe du biseau est de 0,9 cm.
    2. Préparer un cathéter veineux en glissant une pièce de 1 mm de tube en silastic (0,020 pouces de diamètre interne) 1,1 cm de l'extrémité biseautée d'une pièce de 6 cm de tube de silastic (0,012 pouces de diamètre interne) comme indiqué dans la figure 1B. La pièce de 1 mm de silastic est utilisé comme une retenue de billes.
    3. Pour préparer un tm MASA, insérez chacune des deux pièces 1,3 cm de 25 connecteurs en acier inoxydable de calibre dans chacun des deux 3 pièces cm de PE-20 (0.015 pouces de diamètre interne).
    4. Fixez le PE-20/connectors les uns aux autres en glissant une pièce de 5 mm de silastictube (0,040 pouces de diamètre interne) sur la zone où les tubes d'acier et PE-20 se rencontrent.
    5. Pliez les tubes d'acier à un angle de ~ 120 ° et séparer chaque tube par ~ 45 °.
    6. Placez complété plate-forme dans une cuillerée de colle silicone médical tel que le PE-20 tube est vertical et les extrémités des tubes en acier inoxydable au-delà de l'adhésif (figure 1C). Permettre que cette définir pour 24h.

    2. Cathétérisme chirurgicale

    1. Avant la chirurgie, stériliser les cathéters à l'éthanol 70%, les remplir avec du sérum physiologique hépariné (200 U d'héparine / ml de sérum physiologique) et mettez les bouchons en acier inoxydable.
    2. Anesthetize souris, de préférence en utilisant une méthode qui fournit en permanence l'agent anesthésique (par exemple, l'isoflurane en inhalation).
    3. En utilisant une technique stérile, enlever les poils de sites d'incision utilisant une tondeuse et / ou une crème dépilatoire et désinfecter la peau avec de l'alcool suivi d'un gommage bétadine. Pour l'insertion du cathéter, enlever les poils sur lerégion qui s'étend de la mâchoire inférieure au sommet de la cage thoracique et entre les clavicules. Pour l'externalisation des cathéters derrière la tête, enlever les poils dans la zone entre la base du crâne et de la région interscapulaire et désinfecter la peau avec de l'alcool suivi d'un gommage bétadine.
    4. Posez la souris sur son dos sur une surface de réchauffement et sous la zone de visualisation d'un microscope chirurgical. Fixez la queue et les extrémités avec du ruban adhésif chirurgical. Fixez la tête dans le cône de nez offrant l'anesthésie.
    5. Faites une petite incision verticale médiane de 5 mm céphalique sur le sternum. En utilisant des pinces, émoussé disséquer les tissus pour exposer le muscle sterno-gauche. Refléter ce muscle pour exposer l'artère carotide gauche. Doucement taquiner hors des tissus conjonctifs de l'artère. Il est important à ce stade d'isoler le nerf vague de l'artère sans endommager ni l'artère ou du nerf.
    6. Isoler l'artère et ligaturer l'extrémité céphalique avec une suture de soie. Librement noeud autremorceau de suture sur l'extrémité caudale du navire exposé.
    7. Clamp navire avec une pince micro-serrefine à l'extrémité caudale et couper juste en dessous de la fin ligaturé avec des ciseaux à ressort. Insérez soigneusement cathéter aussi loin que la pince. Avec précaution la pince micro-serrefine et faire avancer le cathéter à la jonction de silastic-PE.
    8. Attachez deux ligatures solidement le cathéter et confirmer que les échantillons du cathéter en connectant l'extrémité libre du cathéter à une seringue de prélèvement.
    9. Faites une autre incision de 5 mm vers la droite de la ligne médiane et environ 2 mm caudal à la première incision. En utilisant des pinces, émoussé disséquer les tissus afin d'exposer et d'isoler la veine jugulaire droite.
    10. Soigneusement ligaturer l'extrémité céphalique avec une suture de soie et cravate vaguement un autre morceau de fil de suture à l'extrémité caudale.
    11. Coupez juste au-dessous de la ligature céphalique avec des ciseaux à ressort et insérez le cathéter jusqu'à la retenue de billes. Attachez un fil de suture derrière le talon et confirmer que les échantillons cathéter.
    12. Turn la souris et faire une petite incision entre les omoplates.
    13. Tunnel d'une aiguille de calibre 14 sous la peau de l'incision pour le cathéter artériel, sur le devant de la souris, à l'incision interscapulaire sur le dos. Enfiler le cathéter artériel par l'aiguille de l'extérioriser à l'arrière de la souris. Répétez cette opération pour le cathéter jugulaire par effet tunnel de l'aiguille de calibre 14 sous la peau sur le côté droit de la souris à partir du site de l'incision sur la face avant de l'incision interscapulaire sur le dos.
    14. Fixer le cathéter artériel avec une pince micro-serrefine au site d'incision entre les omoplates. Couper le cathéter ~ 1 cm au-dessus de cette pince. Placez le tm MASA avec les connecteurs en acier inoxydable tourné vers la tête de la souris. Connecter le cathéter artériel au connecteur en acier inoxydable pointé vers le côté gauche de la souris. Prenez soin de s'assurer qu'il n'ya pas de trous ou anomalies dans le cathéter. Répétez l'opération pour le cathéter veineux,le connecter au connecteur en acier inoxydable pointant vers le côté droit de la souris.
    15. Insérez le tm MASA dans l'incision entre les omoplates. Le tube PE-20 correspondant à la veine jugulaire du cathéter doit être sur le côté droit de la souris et le PE-20 tube correspondant au cathéter artériel doit être vers la gauche.
    16. Fermer les incisions ventrale et dorsale avec suture de nylon. Pour la fermeture dorsale, la suture peut être exécuté à travers le silicone trempé de la TM MASA pour le fixer en place. Confirmer la perméabilité des cathéters en utilisant une solution de rinçage contenant du sérum physiologique hépariné et un antibiotique pour minimiser le risque d'infection. Placez la souris dans un réchauffé, cage propre pour la reprise immédiate. La figure 2 montre le produit fini.
    17. Laissez la souris pour récupérer pendant au moins 5 jours. Surveiller le poids et la santé globale. Utiliser le post-opératoires appropriés régime analgésique, tel qu'approuvé par les soins des animaux de l'institution etUtilisez comité.

    3. Hyperinsulinémique euglycémique-clamp

    1. Rapide de la souris pour 5-6h. Comme référence, le temps t = 0 min se réfère à la fin du jeûne et le début de la perfusion d'insuline et de glucose (c'est à dire la pince période).
    2. La ligne de temps d'installation et d'une expérience typique sont présentés dans la figure 3. Utiliser des tubes micro-Renathane ou équivalent pour l'infusion et les lignes d'échantillonnage. Suspendre un pivot double canal au-dessus de la souris. Ceci sert de plaque tournante entre la souris et perfusion / échantillonnage seringues. Pendant l'expérience, la souris reste dans une cage ou un récipient semblable et est attaché à l'émerillon.
    3. Avant de connecter la souris, remplissez la ligne d'échantillonnage artérielle avec une solution saline héparinée (10 U d'héparine / ml de sérum physiologique) et le lieu d'un connecteur en acier inoxydable à l'extrémité inférieure de la ligne. Laisser une seringue avec une solution saline héparinée (compensation seringue) connecté à la partie supérieure de la ligne d'échantillonnage. Il sera utilisé pour élaborer le sang SAMPERP.
    4. Remplissez la ligne de perfusion veineuse avec une solution saline non hépariné à partir du port d'infusion de l'émerillon (compartiment A de la figure 3A) tout le chemin vers le bas de la ligne. Branchez l'extrémité supérieure de la ligne et le lieu d'un connecteur en acier inoxydable (ou un raccord en Y si un bolus doit être administré) à l'extrémité inférieure de la ligne. Si un traceur isotopique du glucose (par exemple [3 - 3 H] glucose) est infusé, sécuriser une seringue de 1 ml contenant le traceur d'une seringue de perfusion. Remplissez la ligne de perfusion veineuse avec traceur au lieu de sérum physiologique (figure 3B).
    5. Trois heures dans le rapide, pesez de la souris et branchez le PE-20 pour la veine jugulaire et cathéters artériels à la perfusion et des lignes d'échantillonnage, respectivement.
    6. Si l'administration [3 - 3 H] traceurs du glucose, commencer une perfusion continue-traceur apprêté à t = -90 min (figure 3C). Une dose d'amorçage typique est 1 pCi. Préparer un pCi 0,05 / ul [3 - 3 H] glucose solution en non hépariné saline. Chargez la solution dans une seringue de 1 ml et sécuriser la seringue dans une pompe à perfusion. Administrer la dose d'amorçage en infusant 20 pl / min pendant 1 min. Suivre avec une perfusion continue de 0,05 pCi / min (1 pl / min) pour une période de 90 minutes d'équilibration.
    7. Préparer infusates de l'insuline et du glucose. L'insuline est préparé en non hépariné saline contenant 3% de plasma en tant que transporteur (une concentration appropriée de BSA peut également être utilisé). Infusates glucose sont commercialement disponibles dans une variété de concentrations (5%, 20 et 50).
    8. Préparer une solution saline lavés soluté erythorocyte par l'obtention de sang total d'un souris donneuse, de préférence de l'arrière-plan même souche que la souris expérimentales. Typiquement 1 ml de sang total est nécessaire par la souris d'étude. Centrifuger le sang d'hématies séparées. Laver les érythrocytes avec 10 U / ml de sérum physiologique hépariné et centrifugeuse pour éliminer la solution saline. Déterminer le volume de globules rouges et remettre en suspension dans un volume égal de 10 U / ml heparireconnu saline.
    9. Dessinez chaque soluté dans une seringue de 1 ml et sécuriser chaque seringue pour une pompe à perfusion individuels. Connectez chaque seringue à un connecteur à 4 voies (figure 3).
    10. A t = -15 min prélever un échantillon sanguin par lentement élaboration 50-100 ul de sang dans la seringue de compensation. Serrer la ligne d'échantillonnage artériel et retirer la seringue de compensation. En utilisant un glucomètre portatif, prendre une lecture de la glycémie en enlevant le collier sur la ligne de prélèvement artériel et permet au sang de circuler dans la bande de lecteur de glycémie.
    11. Une fois la mesure du glucose est prise, pince la ligne de prélèvement artériel et insérez une seringue à aiguille émoussée (seringue d'échantillonnage) dans la ligne de prélèvement artériel. Retirez la pince et tirer un volume de sang (voir note) dans la seringue de prélèvement. Serrer la ligne d'échantillonnage artériel et retirer la seringue de prélèvement. Insérer la seringue de compensation de nouveau dans la ligne de prélèvement artériel. Dresser sur le piston pour éliminer les bulles d'air et re-infuser le50-100 ul de sang qui a été établi initialement.

    Note: Le volume de sang prélevé dépend de l'analyse effectuée. Par exemple, l'analyse de [3 - 3 H] la concentration en glucose nécessite 10 ul de plasma, donc 50 pl de sang sont prélevés. Cela donne de 20 à 30 l de plasma, qui est suffisant pour l'analyse du plasma ainsi que d'autres si nécessaire. Mesures d'hormones et d'autres métabolites (par exemple l'insuline, les acides gras libres) exigent un échantillonnage de sang supplémentaire.

    1. Répartir le sang dans la seringue de prélèvement dans un microtube EDTA-enduit. Centrifuger et recueillir le plasma. Gardez le plasma sur la glace jusqu'à la fin de l'étude ou immédiatement conserver à -20 ° C.
    2. Répétez les étapes 3,10 3,12 travers à t = -5 min. Obtenir de sang supplémentaire (50 pi) pour la mesure des niveaux de référence du plasma insuline. Hématocrite de base Mesure par prise de sang dans un tube héparine ou EDTA-traitée capillaire. Les mesures obtenues frOM échantillons de plasma à t = -15 et -5 min représentent base (à jeun par exemple) des valeurs.
    3. Après l'échantillon à l'instant t = -5 min, remplissez les lignes de perfusion pour les érythrocytes de glucose, d'insuline et de solution saline échoués sur le connecteur à 4 voies. Branchez le connecteur à 4 directions pour le tuyau relié au port d'infusion pivotant (ou le tube connecté à la Y-connecteur si infusant [3 - 3 H] glucose) comme le montre la figure 3.
    4. Commencez infusant les érythrocytes de solution saline d'abord lavé. Réglez la vitesse de perfusion pour remplacer le volume total de sang étant prélevée sur la durée de l'étude (par exemple si un total de 500 pl de sang sont prélevés pendant 120 min de l'étude, réglez le débit de perfusion à 4,2 l / min). Contrairement à l'infusates autres, la solution d'érythrocytes est rouge. Infuser cette solution permet d'abord de toute résistance potentielle ou des obstructions dans les lignes de perfusion pour être identifiées et corrigées.
    5. Une fois que le soluté érythrocytes atteint la souris, commencer l'insuline etperfusions de glucose. Ceci est maintenant t = 0 min. L'insuline est perfusée à une constante, taux prédéterminé. Un taux d'insuline de 4 mU • kg -1 • min -1 sera généralement supprimer la production de glucose endogène par 80-100% et stimuler la disparition du glucose par 2-3 fois. Le taux de glucose initiale d'infusion (GIR) est estimée sur la base des niveaux de référence de la glycémie et de l'expérience précédente.
    6. Si infusant [3 - 3 H] glucose, on peut choisir d'augmenter le débit de perfusion traceur pour correspondre à l'augmentation estimée du chiffre d'affaires de glucose (généralement une augmentation de 2-3 fois).
    7. Considérant le taux élevé de roulement du glucose chez la souris, les échantillons sanguins doivent être obtenus à partir de la ligne artérielle au moins tous les 10 min pour la mesure de la concentration de glucose au cours de la durée de l'expérience. Ajustez le RIF pour atteindre et maintenir l'euglycémie cible (figure 3C). Cette cible peut varier selon le modèle ou les objectifs de l'étude. Une bonne cible glla concentration est de 150 mg ucose • dL-1 puisqu'il s'agit d'un niveau typique de 6h du glucose à jeun pendant une souris chow-alimentés C57BL/6J.
    8. L'objectif est de parvenir à euglycémie rapidement, idéalement dans le premier 40-50 minutes, et d'avoir du glucose et stable RIF par le début de la période d'état d'équilibre (t = 80 min).
    9. Si infusant [3 - 3 H] glucose, d'obtenir du sang supplémentaires à t = 80, 90, 100, 110 et 120 min pour la mesure du plasma [3 - 3 H] glucose activités spécifiques.
    10. Recueillir le sang supplémentaires à t = 100 et 120 min pour la mesure de l'insulinémie et de toute autre hormone (s) ou métabolite (s). A t = 110 min, prélever du sang dans un tube héparine ou EDTA-traitée capillaire pour la mesure de l'hématocrite pince.
    11. Après l'échantillon à t = 120 min est prise, 2 [14 C] désoxyglucose peut être administrée pour la mesure de tissu-spécifique d'absorption du glucose. Administrer un bolus 12 pCi dans la ligne de bolus connecté à la ligne d'échantillonnage jugulaire (figure 3B
    12. Obtenir des échantillons de sang (50 pi) de la ligne d'échantillonnage artérielle à t = 2, 15, 25 et 35 min après l'administration du bolus pour la mesure de plasma 2 [14 C] désoxyglucose niveaux.
    13. Après le dernier échantillon, anesthésier la souris avec une infusion de pentobarbital donnée directement dans la ligne artérielle. Vite disséquer les tissus nécessaires à l'évaluation de l'absorption du glucose (par exemple, les muscles squelettiques de divers types, les tissus adipeux, cœur, cerveau) et tout les autres tissus (par exemple le foie, rate, reins). Aligner les tissus gèle dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Tissulaire du glucose est analysée en mesurant l'accumulation de 2 phosphorylée [14 C] désoxyglucose dans les tissus congelés et la disparition des deux [14 C] désoxyglucose à partir du plasma.

    4. Les résultats représentatifs

    Un exemple de résultats obtenus à partir d'une expérience pince insuline est montré dans la figure 4.Cet exemple montre la capacité d'un régime riche en graisses résistance à l'insuline précipite chez la souris. Toutes les présentations des résultats pince insuline doit comprendre les éléments suivants pour être interprétable: un cours moment de la glycémie, un cours moment de la GIR et les niveaux d'insuline plasmatique (de base et pince). Comme le montre ici, la glycémie à jeun (figure 4A) et l'insuline (figure 4C) sont plus élevés chez les souris nourris avec un régime riche en graisses, indicatif de résistance à l'insuline. Présenter un cours à temps des niveaux de glucose à travers l'étude de serrage (figure 4A) permet au lecteur d'évaluer dans quelle mesure euglycémie a été maintenu, ce qui est révélateur de la qualité de la pince. De même, un cours moment de la RIF (figure 4B) permet au lecteur de déterminer à quelle vitesse un état ​​stable a été atteint. La présence de ces données comme les cours du temps est nettement plus instructif que la pratique conventionnelle dans la littérature pince de souris insulino de présenter une expérience de 2 heurescomme un point de référence unique représentant des valeurs moyennes à partir d'un indéfini "pince" période (4-13). Dans le présent exemple, les niveaux de glucose ont été égales entre le contrôle et la haute teneur en graisses nourris groupes, mais le RIF était significativement plus faible dans la haute teneur en graisses nourris groupe (figure 4B). Ceci est révélateur d'une déficience dans l'action d'insuline du corps entier. Les niveaux d'insuline Clamp étaient également plus élevés dans la haute teneur en graisses nourris groupe (figure 4C), renforçant la présence d'un phénotype résistance à l'insuline chez ces souris. L'utilisation des perfusions traceur isotopique permet l'évaluation de l'action de l'insuline dans les tissus spécifiques. [3 - 3 H] glucose est utilisée pour estimer la vitesse d'apparition du glucose endogène (Endora), qui est un indice de la production de glucose hépatique (HGP) et le taux de l'ensemble du corps disparition du glucose (Rd). Alors que l'insuline supprime complètement HGP chez les souris témoins, ce sont affaiblies chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (figure 4D). De même, la capacité d'enSulin pour stimuler Rd chez les souris témoins est compromise chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (figure 4E). 2 [14 C] désoxyglucose est utilisée pour évaluer l'indice de métabolisme du glucose (RG), une mesure de tissu-spécifique d'absorption du glucose. Comme vu dans cet exemple, stimulée par l'insuline absorption du glucose dans le muscle squelettique est altérée chez les souris nourris avec un régime riche en graisses (Figure 4f).

    Figure 1
    Figure 1: Préparation des artères (A) et des cathéters veineux (B) et (C) MASA tm. Cathéters artériels sont préparés par l'insertion d'une pièce de 1,3 cm de PE-10 d'environ 3 mm en une pièce de 6 cm de 0.012 "ID silastic. La pointe PE-10 est biseautée de telle sorte que la longueur du biseau à l'silastic est de 0,9 cm. Veineuse cathéters sont fabriqués en glissant un petit morceau de 0.020 "ID silastic 1,1 cm de l'extrémité biseautée d'une pièce de 6 cm de 0.012" ID silastic. Les 0.020 "ID actes morceau silastic comme une bille de retenue pour soi guérir le cathéter dans la veine jugulaire. Pour l'assemblage du MC MASA, chacune des deux 1,3 cm de calibre 25 connecteurs est inséré dans chacune des deux pièces 3 cm de PE-20. Ce sont maintenues ensemble par un petit morceau de 0.040 "ID silastic. Les connecteurs sont pliés à un angle de 120 ° et séparés à un angle de 45 °. L'ensemble est plongé dans la colle silicone médical.

    Figure 2
    Figure 2: la souris cathétérisés. Les cathéters sont implantés chirurgicalement dans l'artère carotide gauche et la veine jugulaire droite. Les extrémités libres des cathéters sont externalisés derrière la tête et relié à un tm MASA. Le MC est inséré sous la peau MASA entre les omoplates. Cela permet un accès vasculaire au cours d'expériences pince insuline sans la nécessité de limiter, manipuler ou anesthésier la souris.

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    Figure 3: Représentation de la ligne de temps d'installation et d'une expérience pince insuline. La souris est attaché à un émerillon double canal qui agit comme un hub pour perfusion et des seringues de prélèvement. Configurations typiques pour des expériences de ne pas utiliser des infusions traceur (A) et en utilisant à la fois [3 - 3 H] glucose et 2 [14 C] désoxyglucose (B) sont présentés. Une ligne du temps des procédures de mise en place et l'exécution de la pince d'insuline (C) est également représentée. Pendant le clamp, des échantillons de sang ( le sang ) Sont prises toutes les 10 min pour mesurer la glycémie. Le RIF est ajusté en conséquence pour maintenir l'euglycémie. Les échantillons destinés à base de glucose sanguin, l'insuline plasmatique, et le plasma [3 - 3 H] glucose sont prises à t = -15 et -5 min. Les échantillons de plasma pour la pince [3 - 3 H] glucose sont prises à t = 80, 90, 100, 110 et 120 et pour l'insuline pince à t = 100 et 120 min. 2 [14 C] désoxyglucose est administré après que l'échantillon à t = 120 min et blood sont collectées à t = 2, 15, 25 et 35 min après. Les tissus sont prises après que l'échantillon t = 35 min.

    Figure 4
    Figure 4: Résultats d'une expérience comparant l'insuline pince souris sur un régime de contrôle (Chow) à des souris à un régime riche en graisses (SIH). Bien sûr le temps de glucose artérielle (A) et l'insuline RIF (B), de base et pince (C), Endora (D), et Rd (E) et le muscle squelettique (gastrocnémien et vaste externe) RG (F) sont affichés. Tous les résultats indiquent l'effet de l'alimentation riche en graisses pour induire une insulinorésistance.

    Discussion

    La pince hyperinsulinémique-euglycémique, ou pince à l'insuline, est largement considéré comme le «gold standard» pour évaluer la méthode action de l'insuline in vivo. Cette technique a été appliquée à plusieurs espèces, y compris les humains, les chiens, les rats et les souris. Compte tenu du nombre croissant de modèles de souris transgéniques pour les troubles métaboliques, la miniaturisation de la technique pour une utilisation chez la souris a apporté des progrès significatifs à la recherche métabolique.

    Alors que les concepts derrière la pince d'insuline sont simples, dans la pratique, il existe différentes approches pour réaliser des expériences de serrage d'insuline. Ce n'est pas un point insignifiant, puisque la manière dont l'expérience est réalisée affecte les résultats obtenus 1. Nous présentons ici le protocole utilisé par le MMPC Vanderbilt. La distinction essentielle entre notre protocole et celle des autres est que nous utilisons un cathéter artériel pour obtenir des échantillons de sang. Ceci est en contraste avec l'approche plus largement utilisé de l'OBTaining échantillons de sang en coupant l'extrémité de la queue 4, 7, 11, 12, 14-17. L'avantage de l'échantillonnage à partir d'un cathéter artériel est que l'expérience est menée dans une souris conscient et débridée. L'échantillonnage de la queue nécessite souvent retenue et augmente les indices de stress lorsque des échantillons de sang sont grands acquis 1. Les hormones du stress stimulent la production de glucose endogène et altérer l'élimination du glucose 18, 19, pouvant donner l'apparence d'un phénotype résistant à l'insuline. L'échantillonnage de la queue coupée peut exiger spéciales de protection des animaux institutionnel et l'approbation du Comité Utilisez raison de son caractère stressant. La procédure de cathétérisme artériel a été développé pour éviter le stress à la souris de couper la queue.

    Un aspect clé de l'exécution pinces d'insuline est la capacité à maintenir l'euglycémie. Il n'y a pas d'algorithmes qui peuvent prédire correctement la manière dont le RIF doit être ajustée en fonction des lectures de glucose sanguin. Comme la chirurgie,personnel de mener des expériences de serrage d'insuline deviendra compétent dans le maintien de l'euglycémie raisonnables que par l'expérience. Il est important de noter qu'en raison de leur taux métabolique plus élevé des données obtenues à partir d'études de la souris seront intrinsèquement bruyants. Cela rend la présentation complète des données, y compris les temps de glucose et de la RGI et les valeurs absolues de l'insuline plasmatique, Endora, Rd et Rg crucial pour la capacité de tout lecteur à interpréter les résultats. Le taux élevé de flux de glucose chez la souris (environ 5 fois plus élevé que le taux chez les humains) justifient une fréquence élevée de l'échantillonnage du glucose. Alors que le volume sanguin de la souris est limitée, une fréquence d'échantillonnage minimum d'une fois toutes les 10 minutes est nécessaire pour être certain que d'une pince adéquate a été atteint.

    Comme le montre la figure 4, les niveaux d'insuline pince peut être différent entre les groupes. Des facteurs tels que les interventions alimentation, les manipulations transgéniques ou des différences dans les souches de fond peut affecter le SAFles niveaux d'insuline Ting, qui peut ensuite affecter les niveaux d'insuline pince. Interprétation des résultats lorsque les niveaux d'insuline sont différents pince peut être problématique. Cela peut être expérimentalement résolu par des expériences pilotes pour sélectionner la vitesse de perfusion d'insuline qui permettent d'atteindre des niveaux d'insuline équivalente pince entre les groupes. Alternativement, la somatostatine peuvent être utilisés pour inhiber la sécrétion de l'hormone du pancréas, l'insuline et le glucagon peut être remplacée au taux expérimentalement contrôlé. Cette dernière approche est plus communément fait dans pinces d'insuline chez les rats que les souris. Si ces approches expérimentales ne sont pas prises, le RIF état ​​stationnaire peut être normalisé au niveau d'insuline pince, ou un indice sensibilité à l'insuline (S I) peuvent être dérivées à partir des données que pince S I = GIR / (G • ΔI), où G est la concentration de glucose en régime permanent et ΔI est la différence entre le jeûne et les concentrations d'insuline pince. Une hypothèse à l'autre approche est que le niveau d'insuline pince atteint estdans la plage où sensibilité à l'insuline est linéairement liée au niveau d'insuline en fonction du groupe étudié. Cette dernière hypothèse pourrait ne pas s'appliquer si l'on compare résistants à l'insuline et les groupes sensibles à l'insuline. Idéalement, une courbe de réponse dose d'insuline doit être généré pour sélectionner la perfusion d'insuline appropriée. Toutefois, en raison de l'exigence d'expériences supplémentaires, ce qui est rarement fait.

    La polyvalence fournies par cathétérisme artériel s'étend à des approches expérimentales delà pinces euglycémique. Par exemple, les colliers hyperglycémique, dans lequel le glucose est infusée à un taux variable afin de maintenir l'hyperglycémie par rapport à la glycémie à jeun, peut être utilisé pour évaluer la fonction pancréatique endogène in vivo 2, 20, 21. La mesure de la phase de sécrétion d'insuline première fois durant ce test nécessite l'acquisition fréquente des échantillons de sang (soit toutes les minutes 2-5), ce qui n'est pas réalisable lors de l'obtention des échantillons provenant de l'extrémité de la queue. Par ailleurs,catécholamines élevées résultant de l'échantillonnage queue peut nuire à la sécrétion d'insuline et améliorer la sécrétion de glucagon 22. Le protocole de serrage d'insuline peut également être modifiée pour prévoir des niveaux de glucose de tomber à l'hypoglycémie par rapport à l'évaluation de contre-régulation de réponse de 2, 23, 24. Cathétérisme artériel peut aussi être utilisé pour évaluer la dynamique du métabolisme du glucose durant l'exercice 25-30. Ce chiffre est nettement plus avantageux que les approches conventionnelles réalisées à des moments unique de pré-et post-exercice ou ex vivo dans les muscles isolés. Les techniques présentées ici peuvent aussi être utilisés pour évaluer non seulement le glucose, mais aussi le métabolisme des acides gras à 31.

    Disclosures

    Pas de conflits d'intérêt déclarés.

    Acknowledgements

    Ce travail a été soutenu par Grant 5-U24-DK059637-10 au Centre de souris Vanderbilt phénotypage métabolique.

    References

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    31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

    Comments

    21 Comments

    Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 8:09 AM

    Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala
    Reply

    Posted by: Julio A.November 29, 2012, 8:46 AM

    Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 9:39 AM

    Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 26, 2014, 1:17 PM

    Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.March 26, 2014, 2:06 PM

    Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 28, 2014, 12:20 PM

    Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.
    Reply

    Posted by: Julio A.March 28, 2014, 3:42 PM

    Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.
    Reply

    Posted by: Joseph C.April 8, 2014, 5:11 PM

    Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.April 11, 2014, 4:15 PM

    Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.
    Reply

    Posted by: Kai M.April 15, 2014, 11:17 AM

    Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.
    Reply

    Posted by: Julio A.April 16, 2014, 10:32 AM

    Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 12:32 PM

    Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.
    Reply

    Posted by: Carlo M.October 2, 2014, 1:29 PM

    Thanks. I will try it!

    Kai
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 4:11 PM

    Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:05 PM

    Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:25 PM

    Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:38 PM

    We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:31 PM

    Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 2:56 PM

    Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:47 PM

    Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.
    Reply

    Posted by: Kai M.November 4, 2014, 1:04 PM

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