Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Medicine
 

Summary

Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faratian, D., Christiansen, J., Gustavson, M., Jones, C., Scott, C., Um, I., Harrison, D. J. Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (56), e3334, doi:10.3791/3334 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Morfolojik heterojenlik içinde bireysel bir tümör cerrahi pratikte histopathologists tarafından iyi bilinmektedir. Bu genellikle tanınan histolojik alt tiplere belirgin farklılaşma alanları şeklinde, ya da farklı patolojik notu alırken, çoğu zaman doğru sınıflandırma (Şekil 1) meydan fenotip daha ince farklar vardır. Sonuç olarak, altta yatan moleküler fenotip morfolojisini tarafından dikte olduğundan, gözle görünür farklılıklar olduğu bölgelerde hücre fonksiyonu ve davranışı orkestra proteinlerin ifade farklılıkları, ve bu nedenle, görünüm eşlik etmesi muhtemeldir. Prognoz için görünen ve görünmeyen (moleküler) heterojenliğin önemi bilinmemektedir, ancak en azından genetik düzeyde, heterojenlik primer tümörün 1,2 var ve bu alt-klonlar bazı metastatik doğuran, son kanıtlar göstermektedir ( ve bu nedenle öldürücü) hastalığı.

Ayrıca, bazı proteinlertedavi hedefleri (örneğin tamoksifen ve trastuzumab (Herceptin) ER ve HER2 sırasıyla) çünkü biyobelirteçleri olarak ölçülür. Bu proteinlerin bir tümör içinde değişken ifade Eğer tedavi yanıtları da değişken olabilir. Immünohistokimya için yaygın olarak kullanılan histopatolojik skorlama düzenleri ya göz ardı veya protein ekspresyonu miktarının sayısal olarak homojenize. Benzer şekilde, tümör örnekleri homojenize edilir (örneğin, gen ekspresyonu gibi) yıkıcı teknikleri, nicel bilgi açıklanamamıştır, ancak mekansal bilgi kaybı olmaz. Pankreas kanseri genetik heterojenite haritalama yaklaşımları tek bir hücre süspansiyonu 3 nesil ya güvendi, veya macrodissection 4 vardır. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, prostat kanseri dokusunun 5 morfolojik ve moleküler heterojenite harita için morfolojisi ve moleküler haritalama mümkün olduğunu ispat ilke, kuantum noktaları, ama düşüyorheterojenite nicel hort. Immünohistokimya olduğundan, en azından, sadece yarı-kantitatif ve intra-ve inter-gözlemci önyargı, daha duyarlı ve kantitatif metodolojileri tabi doğru in situ doku heterojenite harita ve ölçmek için gereklidir.

Biz sistematik Otomatik Kantitatif Analiz (AQUA) sistemi 6 dayalı tüm tümör dokusu bölümlerde protein ekspresyonu, heterojenite ölçmek amacıyla geliştirilen ve uygulanan deneysel ve istatistiksel metodoloji var. Doku bölümler fluorofor etiketli sekonder antikor cytokeratins ve ilgi hedeflere karşı spesifik antikorlar ile etiketlenmiş. Slaytlar bütün bir slayt floresans tarayıcı kullanarak görüntülü. Görüntüler yüzlerce binlerce çini bölünmüştür ve her bir çini sonra epitel doku (tümör) bileşeni içinde protein konsantrasyonunun bir ölçüsüdür AQUA puan atanır. Heatmaps Simpson biyolojik çeşitlilik indeksi 7 dayalı orijinal ekoloji heterojenite kullanılan istatistiki bir ölçüttür, kullanarak, proteinlerin ve atanmış bir heterojenite puan doku ifadesini temsil etmek için üretilir.

Histolojik preparatlar, bugüne kadar sistematik bir protein ekspresyonu ile birlikte bu değişkenliği harita ve ölçmek için hiçbir girişim olmamıştır. Burada, ER ve yumurtalık kanseri HER2 biyomarker ifade için uygulanan yöntemin ilk kullanımı göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak, prognoz ve tedaviye yanıtları tahmin heterojenite önemini kurmak için heterojenite translasyonel çalışmalarda biyomarker ifade çalışmalarında bağımsız bir değişken olarak analiz etmek için yolu açıyor.

Protocol

1. Doku hazırlanması

  1. Microtomy
    1. Bölüm formalin sabit parafin döner mikrotom kullanarak 4 mikron kalınlığında tümör bloklar gömülü.
    2. Pozitif yüklü mikroskobik Slaytlarınıza bölümleri yerleştirin.
    3. 37 ° C fırında gecede slaytlar inkübe edin.
  2. Depolama
    1. Mağaza bölümlerinde -18 ° C -25 ° C derin dondurucu, antijenik kaybını önlemek için.

2. Doku kesitlerinde immünofloresan

  1. Dewaxing ve rehidrasyon
    1. Mumunu gidermek için iki kez 5 dakika ksilen slaytlar.
    2. % 99,% 99,% 80,% 50 etanol ve musluk suyu için her 2 dakika süreyle çalışan slaytlar rehidrate.
  2. Antijen Alma
    1. 0.15 mM sodyum sitrat, pH 6.0 tamponu mi 5 dakika için bir düdüklü tencere kullanarak, ısıya bağlı antijen alımı gerçekleştirincrowave.
    2. 20 dakika için slaytlar serinleyin.
    3. Rocker 5 dakika için% 0.05 PBST slaytlar durulayın.
  3. Prosedürü Engelleme
    1. 10 dakika için% 3 hidrojen peroksit bölümleri davranın.
    2. Rocker 5 dakika için% 0.05 PBST slaytlar durulayın.
    3. Sequenza immün rafa bölümleri ekleyin.
    4. 10 dakika süreyle serum protein blok bölümler davranın.
  4. Primer antikor inkübasyon
    1. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe İlköğretim antikor Dako antikor seyreltici optimum seyreltme seyreltilir.
    2. 5 dakika her biri için üç kez PBST% 0.05 durulayın.
  5. Epitel maskesi (sitokeratin) inkübasyon
    1. 4 geceleme Dako antikor seyreltici ile 1:50 seyreltilmiş inkübe fare anti-pan sitokeratin ° C.
  6. Epitel maske gösterimi
    1. Keçi anti-fare Alexa555 s 1:25 seyreltme hazırlayınön seyreltilmiş econdary antikor keçi tavşan HRP antikor çözüm imgeleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca karanlıkta inkübe slaytlar.
    2. 5min her üç kez PBST% 0.05 durulayın.
  7. Hedef görselleştirme
    1. Sequenza nem odasına slaytlar aktarın.
    2. 01:50 konsantrasyon Hedef sinyal amplifikasyon seyreltici (HistoRx küvet E) ve Cy5 Tyramide (HistoRx tüp F) birleştirin. Vorteks iyice karıştırın. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin.
    3. 5 dakika her biri için üç kez PBST% 0.05 durulayın.
    4. 1 dakika boyunca% 80 etanol slaytlar dehydrate.
    5. Hava karanlık, kuru kayar.
  8. Counterstaining ve coverslipping
    1. DAPI montaj orta lamelleri uygulayın ve doku bölümleri üzerinde lamelleri.
    2. Karanlık bir gecede Kuru slaytlar.
    3. Slaytlar oje ile en güvenli, kuruduktan sonraemin uzun vadede korunması ve 4 ° C'de buzdolabında tutun.

3. Tüm bölümü tarama kullanarak görüntü yakalama

  1. Aperio ScanScope FL slayt tarayıcı slayt kaset beş slayt yükleyin.
  2. Her slayt için, görüntü ScanScope Konsol arabirimini kullanarak genel bölgenizi seçin. Ne olursa olsun tüm doku, desen veya diğer gözlemlenebilir yönlerini örnek boyama, slayt kapsayacak şekilde bölgeyi seçin.
  3. (DAPI Cy3 ve Cy5) her kanal aşağıdaki gibi bir optimum pozlama belirlemek için ScanScope Konsolu'nu kullanarak:
    1. Doku sorgulamak için bir bölge seçin - bu alanda, en iyisi, en iyi temsilini sağlamak için doku tümör bölgede olmalıdır.
    2. ScanScope Console otomatik diyafram özelliğini kullanarak görüntü odaklanma ile birlikte, her bir kanal için önerilen maruz kalma süresi değerlendirmek.
    3. Işbirliği için her numunenin 3-5 bölgelere kadar üzerinde tekrarlayın.değeri istikrar nfirm.
  4. Her filtre için düz alan düzeltme görüntüleri elde edilecek bir arka plan alanını tanımlamak için, hala slayt dakika muamele bölge içinde henüz uzak doku (ScanScope konsol görüntü üzerinde mavi bir elmas tarafından gösterildiği gibi), ek bir bölge seçin.
  5. Görüntü elde etme önce bu görüntüleri inceleyin. Görüntüleri, yüksek arka plan veya diğer görüntü eserler görünüyorsa, görüntü bölgeye taşınmış ve yeni görüntüleri elde edilmelidir.
  6. Elde edilen dijital slayt görüntüleri Aperio Spectrum veritabanına otomatik olarak yüklenir.

4. AQUA otomatik görüntü analizi

  1. Spectrum veritabanı görüntüleme ve dijital tüm slayt görüntüleri, tüm doku ve boyanma paterni (lar) bağlamında tümör ilgi alanlarına açıklama.
  2. Başparmak çift tıklayarak Spectrum veritabanında dijital slayt listeden AQUAnalysis kullanarak analiz etmek için slaytı seçin.tırnak resim (alternatif olarak, resmin yanındaki onay kutusunu seçin ve ardından seçmek listenin en üstündeki menüden 'Görüntüleri'). Bu ImageScope yazılım ve doku örneği renk birleştirilen görüntü otomatik olarak açılır.
  3. Sunulan araçları kullanarak görüntüyü gitmek için bu yazılımı kullanın.
  4. Eşlik eden H & E (fiziksel slayt veya açıklamalı bir görüntü ya) kullanarak, floresan görüntü faiz bölgede açıklama. Ilgi birden fazla bölgede, bireysel daire alanlar, tek bir örnek üzerinde seçilebilir. Seçilen bir bölgenin içindeki alanlarda (yani hasarlı doku alanları, fakir histoloji, tümör olmayan alanlarda, moloz vb.) Dışlamak için kullanılan bir 'negatif' aracını da vardır.
  5. Resmin üzerine açıklama katmanındaki (ler) kaydedin.
  6. Spektrum ana menüye geri dönün ve sadece açıklamalı resmin yanındaki onay kutusunu işaretleyin. Listenin üst kısmında menü şerit 'analiz' seçin.
  7. Analiz penceresinde, sele gelecekct açılan menüden "HistoRx AQUA Analizi".
  8. Açıklamaların çoklu katmanlar varsa, analiz için uygun bir katman (lar) seçmek için onay kutularını kullanabilirsiniz.
  9. 'Analiz' düğmesine başlamaya hazır tuşuna basın.
  10. Bu noktada, Windows görev çubuğunda küçültülmüş bir konsol penceresi görünecektir. Bu görüntü transferi Spectrum veritabanından yerel PC ('çekme' operasyonu) ilerleme gösterecektir.
  11. Veri transferinden sonra, AQUAnalysis başlatacak. Kullanıcı daha sonra görüntü, gezinmek ve analiz etmek için yazılımın tüm iç fonksiyonları kullanabilirsiniz.
  12. Spectrum veritabanı görüntü açıklamalı bölge, 512x512 piksel görüntü karoları ayrılır, tek tek atılır, her biri.
  13. Bu çalışma için, veri kümeleme dayalı bir denetimsiz AQUA puanlama algoritması, 8 kullanılmıştır. Bu algoritma, AQUA puanları aşağıdaki gibi oluşturulur:
    1. Pan-sitokeratin görüntü signal arka plan üzerinde eşiklenir ve bu piksel daha sonraki hesaplamalar için kullanılan bir 'maske' tümörü tanımlamak için kullanılır. Yüksek ifade pan-sitokeratin piksel tümör hücrelerinin sitoplazmik / nükleer olmayan bölgelerde de tanımlar.
    2. Nükleer tümör maske içinde DAPI kanal yüksek sinyal Piksel olarak tanımlanır.
    3. Kümeleme algoritması da DAPI boyama veya sitokeratin ekspresyonu ve nükleer veya sitoplazmik bölmeleri, ya da arka plan kısmen ya da bunları atfetmek girişimleri için düşük yoğunluklu piksel inceler.
    4. Bir zamanlar tüm pikselleri bir tümör bölme ya da arka plan, hedef protein (ER veya HER2) sinyal yoğunluğu atanır böylece AQUA puanları üreten, her bölmeleri ve bölmelerin boyutunu normalize içinde hesaplanır.
    5. Yeterli tümör temsil yoktu Görüntüler (le birlikte olanlar tarafından tanımlandığı gibi gol değildiss% 5'inden tümör temsil piksel). Bu bölgeler de 'başarısız' olarak adlandırılan bir 'Final Sonucu' değer üretmek ve böylece sonraki istatistiksel analizler silinebilir.
    6. Ayrıca, gözden geçirildikten sonra, bir operatör, örnek veya görüntüleme eserler (örneğin katlanmış doku, enkaz) nedeniyle puanlama için uygun olmayan alanlar tespit, bu alanlardaki puanlama redacted ve "Final Sonucu '' Başarısız 'denilen üretti.
  14. AQUA puanlama sonuçları, ilgi, bir bütün doku bölümde örnek içinde bölgede her 512x512 piksel çini ile ilişkili puan tabloları. Bu dosyalar, CSV formatında, daha sonra sonraki istatistiksel analiz için kullanılan olabilir.

5. İstatistiksel Analiz: Tüm istatistiksel analizler SPSS (IBM)

  1. Mümkün olan yerlerde, büyük işlemler için, veri manipülasyonlar ve analiz adımları gerçekleştirmek için SPSS sözdizimi kod dosyaları (sps) oluşturmak. Örnek sözdizimi kodu ek dosyaları olarak sağlanır.
  2. Bölgelerde 'başarısız' bir 'Nihai Sonucu "(yukarıya bakınız) varsa, sayısal analizler onları kaldırır SYSMIS olarak bu değerleri işaretleyin.
  3. Agrega tüm slaytlar için tüm verileri SPSS formatında tek bir ana veri her bir marker (ER veya HER2). Sonraki tüm hesaplamalar için bu ana dosyasını kullanın.
  4. ER veya HER2 (bkz. ek sözdizimi dosyaları) veri daha da doğrulanmış ve çeşitliliğin Simpson Endeksleri aşağıdaki gibi hesaplanır: bir SPSS sözdizimi dosya (her bir belirteç için kullanılması
    1. Daha önce oluşturulan ayarlamak ana verilerin düzenlenmesini engellemek için, ana analitik bir dosya oluşturun.
    2. Üretilen ham veri ve görüntü karşı ana verileri doğrulamak.
    3. AQUA puanları (alanların sayısı, her bir örnek için özet istatistikleri üretmek ortalama puanı, ortalama puanı, Minimum skoru, maksimum puan ve puan örnek için standart sapma).
    4. Rastgele bir örnek orijinal ham veri çıktı dosyaları karşı sonuçlar ve puan ham görüntü verileri karşı kontrol edin.
  5. Isı haritası görüntüleri (Şekil 2 ve 3 de gösterildiği gibi) oluşturmak için:
    1. 'Bin' sekiz ayrı seviyeleri AQUA skor verilerini (SPSS 'Görsel binning' işlevini kullanarak). ER, nükleer puanları HER2, sitoplazmik puanları kullanılmıştır.
    2. Her bin edinilebilir durumlarda veri kümesinin tamamını eşit oranda temsil ettiği gibi kutuları türet.
    3. Sonraki tüm çıkış, 'başına bir slayt / örnek' düzeyde olacağını, böylece SPSS 'Split File' fonksiyonunu kullanın.
    4. Tahsis edildi bin içine karşılık gelen bir değere sahip x, y koordinatlarını ve renk (bkz. Şekil 2 ve 3) (512x512 kiremit karşılık gelen) tarafından her bölge çizilir.
  6. Heterojenite puanları üretmek için, kodu bir Simpson oluşturmak için yazılmıştırAQUA puanları kullanarak çeşitliliği indeksi.
    1. Burada kullanılan Simpson çeşitlilik indeksi, olarak tanımlanır:
      Denklem 1
      N, verilen bir örnek için kullanılan ve n belirli bir grup standardize edilmiş skorlar (aşağıda açıklandığı gibi üretilen) puanları / alanların sayısı puanları / alanların toplam sayıdır.
  7. Ana analitik dosya veri kaynağı için yukarıda açıklanan kullanın. Gösterilen örnekler, tüm ER hesaplamaları, nükleer AQUA puan ve sitoplazmik AQUA skoru kullanılan HER2 hesaplamalar kullanılmıştır. , Her bir örnek / slayt için aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin.
  8. Floresans verileri varyans istikrarsızlık tabi olduğundan, bu hata büyüklüğü yoğunluğu ile yayar, tüm AQUA puanları logaritmik (2 tabanında) normalleştirme geçerlidir.
  9. Ayrıca normalize (log dönüştürülmüş) verileri z (standart) puanları dönüşmek.
    1. Z-skoru dönüşüm hesaplanır.s aşağıdaki gibidir: Z = (AQUA puan - bir örnek için tüm puan ortalaması) / standart sapma örnek için puan. Bu sapmaların bir dağıtım merkezi sıfır sapma değeri etrafında puan dağılımı çevirir.
  10. Bin bu Z-skoru değerleri altı grup (-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2> 2).
  11. Her bin için her bin ve toplam ayrıldı değerlerin sayısını hesaplayın. Her bir dizin için kullanılan altı kutuları değerini hesaplamak için, alanların toplam sayısı ile birlikte, bu değeri kullanın.
  12. Bu değerlerin toplamı ve çeşitlilik endeksi üretmek için bir çıkarma.
  13. Çeşitlilik endeksi, belirli bir örnek için ortalama etrafında puan yayılmasının bir göstergesi sağlar. Böylece, daha yüksek endeksleri puan daha geniş yayılması, ya da ifade artış heterojenite göstermektedir. Tersine, alt endeksleri, ifade ölçümü daha az varyasyon ve örnek homojen ifade gösterir. Bu Figür gösterilmiştir.2 ve 3 ler.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Hedefe yönelik tedavi, tamoksifen ve trastuzumab gibi nispeten düşük toksisite ajanlar, yumurtalık kanseri hastaları için bakım standart değildir. Platin taksan ilk basamak kemoterapi, yumurtalık kanseri 9-13 diğer kemoterapi rejimlerinin daha üstün olduğunu ve başlangıçta hastaların% 70-80 cevap en nüks edecektir ve onların hastalık nedeniyle ölmektedir ise iyi bir kanıt yoktur . Alternatif tedavilere yanıt tahmin olabilir biyobelirteçleri ölçümü, her hasta için bireyselleştirilmiş tedavi seçiminde faydalı olacağını ve hayatta kalan tümör hücrelerinin bir tümörün kemoterapi uygular seçim baskısı bu yana, farklı özelliklere sahip ve tedavi öncesi tümörün ICSI'nin temsil, bu niceleme değişim bu nedenle yararlı olabilir. Biz orde, kemoterapi öncesi ve sonrası yumurtalık kanseri örneklerinde ER ve HER2 ifade heterojenite haritalama yaklaşımı uygulamıştırr nicel ifade değişiklikleri ölçmek ve tedavi öncesi ve sonrası biyomarker ifade arasındaki ilişkiyi nasıl değerlendiriyorsunuz. ER ve HER2 Her ikisi de bireysel tümörler içinde işaretlenmiş heterojenite gösteren ve bazı tümörlerde, tedavi sonrası düşük heterojenite nispeten yüksek heterojenite Simpson indeksi değişiklikleri, azalan Simpson endeks puanları (bkz. Şekil 2 ve 3) tarafından temsil edilen. Bu klonal seçim sitotoksik kemoterapi yanıt oluşur fikrini destekler; daha da önemlisi, bu kanser hastaları için daha iyi tedavi kişiselleştirmek için, kalan nüfusa karşı hedeflenen tedavi kullanılarak istismar olabilir.

Şekil 1
Şekil 1 farklı alanlarında aynı yumurtalık kanseri değişken morfolojisi gösteren Hematoksilen ve eozin lekeli fotomikrografı. (A) x40 yüzey elde morfolojisi değişen tümör iki bitişik olan alanlarda gösterir. Yüksek güç manzarası (x20Doku (C) alt kısmında daha homojen eozinofilik sitoplazma ve papiller büyüme deseni 0) iken, hücreleri sitoplazmik takas ve tümör (B) üst kısmında sağlam bir büyüme modeli ile ortaya koymaktadır. Ancak, bu tümör, daha fazla yönetim amaçlı seröz papiller histolojik alt tip olarak sınıflandırılır.

Şekil 2
Şekil 2 ER protein ifadesi, sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu heterojenite heatmaps önce (üst panel) ve tedavi sonrası (alt panel).

Şekil 3
Şekil 3 HER2 proteini sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu ifade, önce (üst panel) ve sonrası (alt panel) tedavisi heterojenite heatmaps.

Discussion

Bu yöntem, tümörün malzemenin standart formalin ile fikse, parafine gömülü histolojik kesitler moleküler heterojenite izin kantifikasyon burada nitelendirdi. Yöntemi, bu biyomarker geliştirme ve analiz bir değişken olarak dikkate alınması olabilir, böylece bir doku bölümünde heterojenlik derecesi atanacak bir değer izin verir. Genel olarak doku biyobelirteçleri tahlil örnekleme hatası veya yanlılık daha az duyarlıdır, böylece ifade bakımından homojen olması tercih edilir olsa da, bazı koşullar altında, bir parametre olarak heterojenite ölçmek için yararlı olabilir. Örneğin, ER ve HER2 için örnek gösterildiği gibi, ortak biyobelirteçleri ifade hatırı sayılır bir heterojenlik göstermek ve bunun klinik sonuç veya tedaviye yanıt açısından, bağımsız bir prognostik veya akıllı faktör sırasıyla temsil edip etmediği henüz bilinmiyor. Aynı şekilde, gösterildiği gibi, tedavinin kendisi dinamik olarak değiştirebilirhedef zenginleşme oluşturan hücre popülasyonları ve bu nedenle ölçüm tedavi kararları rehberlik yararlı olabilir.

Ancak, bu teknik, geleneksel histopatolojik veya biyomarker (immünohistokimyasal olarak) analizleri sınırı aynı faktörler ile sınırlıdır. Sonuç türü, boyutu, ve analiz edilen doku kalitesi ve bu nedenle tek bir doku bölümünde bağlıdır tümörün tamamını yansıtmıyor olabilir. Gerçekten de, Simpson indeksi aşırı derecede doku boyutu (AQUA puanları ölçülen ve yakalanan kare sayısı) önyargılı olabilir. Ölçülen epitoplar immünojenite artifactually doku bölümü (soğuk iskemi zamanı, fiksasyon uzunluğu ve kenar artifakı gibi) arasında kendi ifadesini değiştirmek kontrol edilemeyen pre-analitik faktörler tabi olabilir. Bu, özellikle herkesin bildiği gibi labil 14, 15 fosfor epitopu bir sorundur . Bu nedenle bu tekniğin daha uygun olabilirrezeksiyon örneklerinde ziyade küçük biyopsiler, ve sadece bir yerine birden çok bölüm yapılan. Sonuç olarak, 3D görüntüleme teknikleri Bu parametre daha iyi ölçmek için bir fırsat sunabilir.

Olarak sunulan teknik sitokeratin maskeleme epitop ifade değişkenlik gibi biyolojik faktörler, aynı zamanda sınırlı olabilir. Bu, yumurtalık ve meme kanseri, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi veya non-epitelyal bileşenleri veya kök hücreler 16 zenginleştirilmiş dahil olmak üzere, bu kanserlerin özellikle endişe gibi son zamanlarda meydana geldiği görülmüştür olabilir kemoterapi- in vitro 17, yumurtalık kanseri ve tedavisi 18 yanıt meme kanserli hastalarda tedavi edildi. Bu sınırlama, sitokeratin artı vimentin, EMT 16 upregüle gibi alternatif maskeleme antikorları (antikorlar kokteyller) kullanarak üstesinden olabilir . Buna ek olarak, doku diğer bileşenleri (mikrofon bu yanaroenvironment), fibroblastlar ve vasküler endotelyal hücreler gibi, biyolojik tedaviler de giderek tarafından hedef alınıyor, teknik vasküler endotelyal hücreler için leke gibi PECAM / CD31 gibi ilgi bölmeleri, özel maskeler kullanarak, bu bileşenleri puan için genişletilmiş olabilir .

Simpson indeksi adaptasyon sadeliği nedeniyle mevcut protokol heterojenlik bir ölçüsü olarak kullanılıyor olmasına rağmen, diğer önlemler heterojenlik (ortalama, varyans, medyan, vb) gibi merkezi eğilim basit ölçümler, kullanılan olabilir. Ayrıca, Simpson endeksi hesaplamalarında, belirli bir test nüfusun daha iyi uyacak şekilde değiştirilmiş olabilir. Z-skoru dönüşümleri heterojenite bir veri kümesi için ortalama etrafında sapma dayalı olduğu puanlama birden fazla belirteçler için daha geçerli olmak üzere izin verir. Ancak, genel olarak çeşitli puanlama dönüşüm bu tip sınırlı olabilir. Bazı tasarımlar daha uygun olabilirsadece belirli bir marker kümesinin tüm örnekler için gerçek AQUA puanları bin. Kutuları ve kesilecek sayısının seçimi de neden olabilir değerler aralığında bir sınırlama ve alternatif deneysel tasarımlar için optimize edilmiş olabilir.

Biz zaten klinikte kullanılan bu yana, ER ve HER2 aday biyobelirteçleri olarak bu çalışmada kullanılan hedeflenmiş tedavilerin etkinliği saygı ile ilgili klinik soruları yanıtlamaya yardımcı ve hatırı sayılır bir heterojenlik ve değişim göstermez bilinen birincil ve uzak 19 hastalıktır. Ancak, heterojenlik optimal marker tespit edilmesi kalır. Diğer olasılıklar klonalite sitogenetik belirteçler, interfaz FISH çalışmaları 20, daha önce kullanılan bu gibi içerebilir. Bu yaklaşım, daha fazla kanser biyolojisi bu parametre alaka kurmak için büyük, iyi açıklamalı klinik kohortlarında veya klinik araştırmalardan daha fazla doğrulama gerektirir.

Disclosures

JC, MG, CJ, ve CS HistoRx, Inc. 'Çalışanları

Acknowledgments

Bu çalışma, İskoç Finansman Konseyi (Hibe Numarası HR07005 tarafından kısmen desteklenen http://www.sfc.ac.uk/, Tıbbi Araştırma İskoçya ( ) http://www.medicalresearchscotland.org.uk/), Kanser Research UK Deneysel Tıp Kanser Merkezi ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) ve Atılım Meme Kanseri ( http://breakthrough.org.uk/ ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ScanScope FL Aperio Technologies ScanScope FL Used as equipped from vendor
Spectrum Aperio Technologies Spectrum Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure.
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment HistoRx V2.3 The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum.
HER2 Dako A0485 1 in 400 dilution
mouse anti-pan cytokeratin Dako M3515 1 in 50 dilution
Antibody diluent Dako S0809
Envision goat-rabbit HRP Dako K4003
Protein block Dako X0909
Goat anti-mouse Alexa555 Invitrogen A21422
DAPI mounting medium Invitrogen P36931
Cy5 Tyramide HistoRx AQ-EMR1-00001
Sequenza Immunostaining Center Thermo Fisher Scientific, Inc. 73300001 Used here for bench-top immunofluorescence staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  2. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  3. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  4. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  5. Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots. ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).
  6. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).
  7. Simpson, E. H. Measurement of biodiversity. Nature. 163, 688-68 (1949).
  8. Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).
  9. Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial. Lancet. 360, 505-515 (2002).
  10. McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer. N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).
  11. Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study. J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).
  12. Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results. J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).
  13. Cannistra, S. A. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).
  14. Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).
  15. Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).
  16. Klymkowsky, M. W., Savagner, P. Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe. Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).
  17. Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells. Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).
  18. Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).
  19. Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases. Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).
  20. Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis. J. Pathol. 221, 308-319 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics