माउस प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में Microregional Hypoxia की अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग द्वारा जांच

Neuroscience
 

Summary

यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए सीधे माउस प्रांतस्था में microregional ऊतक hypoxia के कल्पना

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Polesskaya, O., Sun, A., Salahura, G., Silva, J. N., Dewhurst, S., Kasischke, K. Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence. J. Vis. Exp. (60), e3466, doi:10.3791/3466 (2012).

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Abstract

मस्तिष्क चयापचय मांग की उच्च स्तर पर कार्य करने की क्षमता के रक्त प्रवाह और ऊतकों को ऑक्सीजन प्रसार के माध्यम से निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति पर निर्भर करता है. यहाँ हम एक कल्पना प्रयोगात्मक और methodological को सीधे microregional ऊतक hypoxia के कल्पना और के माउस प्रांतस्था में perivascular ऑक्सीजन ढ़ाल अनुमान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह गैर रेखीय nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) अंतर्जात प्रतिदीप्ति तीव्रता और ऑक्सीजन ऊतक, जहां मनाया ऊतक NADH प्रतिदीप्ति अचानक 10 mmHg एक नीचे ऊतक ऑक्सीजन के स्तर पर बढ़ जाती है में आंशिक दबाव के बीच संबंध पर आधारित है. हम 740 एनएम जो आंतरिक NADH ऊतक प्रतिदीप्ति और रक्त प्लाज्मा टेक्सास रेड dextran के साथ विषम के समवर्ती उत्तेजना के लिए अनुमति देता है पर दो photon उत्तेजना का उपयोग करें. मौजूदा तरीकों पर इस विधि के लाभ में निम्नलिखित शामिल हैं: यह एक आंतरिक ऊतक संकेत का लाभ लेता है और vivo में im में दो photon मानक का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता हैउम्र बढ़ने के उपकरण, यह देखने के पूरे क्षेत्र में ~ 50 माइक्रोन की गहराई संकल्प के साथ सतत निगरानी करने की अनुमति देता है. हम दिखाना है कि मस्तिष्क के ऊतकों को मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं से दूर क्षेत्रों के अनुरूप कमजोर जलग्रहण क्षेत्रों में जो संवहनी ऑक्सीजन की आपूर्ति में गिरावट के बाद कार्यात्मक hypoxic बनने के लिए पहली बार कर रहे हैं. इस विधि छवि microregional cortical oxygenation में एक की अनुमति देता है और इसलिए neurovascular रोगों और स्ट्रोक में अपर्याप्त या प्रतिबंधित ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति की भूमिका की जांच के लिए उपयोगी है.

Protocol

1. इमेजिंग के लिए पशु की तैयारी

नोट: हम वयस्क C57BL चूहों का उपयोग करें. अलग ट्रांसजेनिक उपभेदों अनुसंधान प्रश्न के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. Microvascular सर्जरी और नाड़ी oximetry सफेद फर के साथ चूहों (जैसे FVB तनाव) में मदद कर रहे हैं.

  1. बेंच पर सर्जिकल साइट तैयार करें. सभी सर्जिकल उपकरणों autoclaved या 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करने की आवश्यकता है.
  2. एक गुदा जांच डालें, और लगातार प्रक्रिया के दौरान पशु के शरीर के तापमान को मापने के
  3. शुरू में 5% isoflurane माउस का प्रयोग कर असंवेदनता उत्पन्न करना. 15-30 है, जब जानवर नहीं बढ़ रहा है, यह एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर जगह है, और हवा की निरंतर वितरण में 1.3-1.5 isoflurane%) युक्त के लिए एक चेहरा मुखौटा लागू होते हैं. यकीन है कि पशु एक दर्द उत्तेजना (जैसे पूंछ चुटकी) के लिए जवाब नहीं है.
  4. कृत्रिम आंसू जेल का प्रयोग करें माउस आँखों को कवर करने के लिए है, शुष्क हवा के प्रदर्शन को रोकने के.
  5. एक बिजली के रेजर का उपयोग, बाल च हटासिर रॉम और दोनों जांघों से. 2 मिनट के लिए जांघ बाल हटानेवाला (जैसे नायर) लागू करें, और फिर ध्यान से पोंछ शेष बालों को हटाने. यह जांघ oximetry के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  6. एक 10% povidone - आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल का उपयोग खोपड़ी कीटाणुरहित करना.

2. खुला खोपड़ी कपाल खिड़की की तैयारी

  1. 5 खोपड़ी के लिए दुम का मिमी शुरू, कैंची के साथ खोपड़ी में एक चीरा बनाने के लिए, और एक सेंटीमीटर अग्रिम. पक्षों के लिए त्वचा को स्थानांतरित करने के लिए खोपड़ी बेनकाब.
  2. खोपड़ी के शीर्ष पर झिल्ली को हटाने के 10% ferric क्लोराइड खोपड़ी के शीर्ष करने के लिए समाधान लागू होते हैं. दूर अतिरिक्त समाधान पोछो, और झिल्ली 45 ° कोण # 5 चिमटी के साथ दूर परिमार्जन. यह साइट सावधानी से तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्रम में करने के लिए सुनिश्चित करें कि सिर थाली सुरक्षित रूप से खोपड़ी के लिए संलग्न किया जा सकता है (कदम # 4 6 के माध्यम से).
  3. एक विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, ब्याज के क्षेत्र की पहचान. ध्यान दें कि कपालीय sutures के बचा जाना चाहिए क्योंकि खोपड़ी गइन पंक्तियों के साथ उठते तोड़ने के.
  4. तेजी से गोंद की एक पतली परत (जैसे 454 Locktite) सिर प्लेट (चित्रा 1) की खिड़की के किनारों के आसपास लागू करें. इस तरह से है कि ब्याज के क्षेत्र विंडो में उजागर हो रहा है में सिर थाली स्थिति. सिर थाली पर प्रकाश दबाव लागू करें. गोंद तेजी भाजन करना दंत सीमेंट की एक छोटी राशि लागू करें. 10 सेकंड के लिए पकड़ जबकि गोंद polymerizing है.
  5. सिर थाली और खोपड़ी सील करने के लिए खिड़की के किनारों को तेजी से गोंद की एक छोटी राशि लागू करें. पशु धारक के विच्छेदन गुंजाइश के तहत सिर थाली भाड़ में.
  6. का प्रयोग Microtorque द्वितीय 6000 rpm और एक IRF 005 ड्रिल बिट सेट ड्रिल, सभी अतिरिक्त गोंद से खोपड़ी और सिर थाली से हटा दें. सिर थाली पर कोई शेष गोंद, हटाया जाना चाहिए क्योंकि यह अन्यथा गिलास को कवर के अनुलग्नक के साथ हस्तक्षेप करेगा.
  7. 1000 rpm पर ड्रिल सेट, और सिर थाली खिड़की के अंदर एक चक्र बनाने से खोपड़ी ~ व्यास 5 मीटर ड्रिलिंग शुरूमी. प्रकाश व्यापक आंदोलनों का उपयोग के रूप में यदि आप एक बहुत नरम पेंसिल के साथ बैठक कर रहे हैं. हड्डी संपीड़ित हवा का उपयोग कर धूल हटाने के लिए हर 20-30 सेकंड ड्रिलिंग बंद करो.
    नोट: सिर थाली में खोलने के आकार ड्रिल बिट (बाएँ और दाएँ हाथ के सर्जन के लिए) है, जो यह एक परिपत्र कपाल खिड़की बनाने के लिए आसान बनाता है के लिए अतिरिक्त उपयोग की अनुमति देता है. इसके अलावा, दो अजीब के आकार का छेद करने के लिए आवश्यक मस्तिष्क के ऊतकों में अतिरिक्त polarographic या electrophysiological माप के लिए कपाल खिड़की के नीचे एक क्लार्क - इलेक्ट्रोड या कांच इलेक्ट्रोड डालने स्थान प्रदान करते हैं.
  8. के रूप में ड्रिलिंग की प्रगति, एक बिल केंद्र में अक्षुण्ण खोपड़ी के चारों ओर बनाई है. पतला खोपड़ी के माध्यम से प्रहार नहीं, लेकिन मोटाई का भी इस बिल बनाने के लिए सावधान रहें. बड़ी रक्त वाहिकाओं - वे और समझौता नहीं चाहिए, यदि संभव हो तो छुआ भी नहीं के आसपास अतिरिक्त सावधान रहें.
  9. # 3 चिमटी के "पैर" का प्रयोग करें ("बंद झटका") खिड़की के केंद्र में हड्डी लिफ्ट. Artific की एक बूंद लागू करेंial खिड़की पर मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF).
  10. ACSF पोछो धीरे नरम टिशू पेपर के एक कोने (Kimwipe उदाहरण के लिए) का उपयोग कर. आमतौर पर ड्यूरा विंडो के किनारे के आसपास एक या एक से अधिक स्थानों पर क्षतिग्रस्त है. इन साइटों में से एक में शुरू, धीरे से उठा और फिर मस्तिष्क की सतह से ड्यूरा निकालने के लिए, 45 ° कोण चिमटी # 5 का उपयोग कर. जब जिस पर ड्यूरा हटाने शुरू साइट का चयन, बड़े रक्त वाहिकाओं के लिए आसन्न क्षेत्रों से बचें. यदि रक्त स्राव होता है, aCSF की एक बूंद लागू होते हैं और मामूली रक्तस्राव को रोकने के लिए 2-3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  11. तैयार 0.07% कम पिघलने aCSF में भंग agarose) के शरीर का तापमान पिघल agarose लाओ. दूर aCSF से अधिक मस्तिष्क की सतह से साफ कर लें. विंडो में agarose डालो, और एक गिलास स्लाइड के साथ कवर. कांच धीरे प्रेस कांच और सिर थाली के बीच संपर्क बनाने के लिए, और 10-20 सेकंड रुको जब तक agarose ठोस है.
  12. चिमटी और नरम टिशू पेपर का उपयोग गिलास को कवर से अधिक agarose निकालें.
  13. एक छोटे से रखोसिर थाली कांच गोंद के लिए कांच के चारों ओर तेजी से गोंद की राशि. गोंद (चित्रा 1) जमना दंत सीमेंट की एक छोटी राशि लागू करें.

3. अंतःशिरा इंजेक्शन और रक्त oxygenation की निगरानी

नोट: हम नियमित रूप से टेक्सास लाल की नसों में आवेदन बजाय पूंछ नस और्विक शिरा का इस्तेमाल किया. इसका कारण यह है और्विक शिरा इंजेक्शन सुरक्षित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रंग की सांस में इंजेक्शन प्रदान करते हैं.

  1. आंशिक रूप से बाईं जांघ के अंदर बेनकाब अधिक पशु बारी. टेप का उपयोग करने के लिए इस स्थिति में पशु सुरक्षित.
  2. एंटीसेप्टिक साफ़, और तब 100% त्वचा के लिए इथेनॉल लागू करें.
  3. घुटने जघन सहवर्धन से औसत दर्जे का जांघ के साथ एक चीरा करें. कुंद विच्छेदन से अलग कोमल ऊतकों # 5 चिमटी का उपयोग कर.
  4. टेक्सास लाल (2.5 मिलीग्राम / एमएल) की 130 μl साथ 1ml सिरिंज भरें. एक नई सुई (30 गेज) संलग्न है, और इसे ध्यान से 30 डिग्री पर, मोड़ बेवल रखने. सुई वाई भरेंवें टेक्सास लाल समाधान.
  5. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, ऊरु नस में सुई डालने और टेक्सास लाल 100 μl इंजेक्षन. सुई निकालें और हल्के से धुंध के साथ नस प्रेस करने के लिए खून बह रहा बंद करो.
  6. 4-0 सीवन का उपयोग कर त्वचा को बंद करें.
  7. खून दो एसपीओ की सतत निगरानी (पर्याप्त रक्त oxygenation को सुनिश्चित करने के लिए) सही जांघ (जिसमें से बाल पहले से हटा दिया गया था) पर oximeter जांच जगह के लिए.

4. दो photon इमेजिंग

नोट: एक उत्तेजना स्रोत के रूप में सा लेजर: हम स्पेक्ट्रा - भौतिकी MaiTai अश्वशक्ति DeepSee femtosecond तिवारी के साथ एक ओलिंप Fluoview1000 multiphoton इमेजिंग (ईमानदार) प्रणाली का उपयोग करें. इमेजिंग के लिए, हम × 10 0.45 एनए (Zeiss सी - APOCHROMAT) के, या × 1.05 एनए 25 (ओलिंप XLPlan N) पानी विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करें. हम 12 बिट गहराई पर 512 का एक संकल्प × 512 पिक्सेल के साथ पिक्सल 2 μs के समय ध्यान केन्द्रित करना पर चित्र लेने के. NADH और टेक्सास लाल dextran समवर्ती 740 एनएम पर उत्साहित कर रहे हैं, और स्त्रावdichroic दर्पण / पास IR अवरुद्ध फिल्टर संयोजन का उपयोग कर (FF665 - Di01 escence उत्तेजना प्रकाश से अलग है, FF01-680/SP, Semrock, रोचेस्टर, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) dichroic दर्पण का उपयोग करते हुए दो चैनलों में विभाजित (505DCXRU, Chroma Rockingham, VT, संयुक्त राज्य अमेरिका), और bandpass फ़िल्टर (NADH - Semrock FF607/36 FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock). लेजर उद्देश्य के बाद मापा सत्ता परत मैं में इमेजिंग और परत द्वितीय में इमेजिंग के लिए 20-50 मेगावाट के लिए 10-20 मेगावाट था.

  1. खुर्दबीन चरण के स्थानांतरण के लिए शल्य चिकित्सा द्वारा तैयार माउस. कपाल खिड़की 4x बढ़ाई उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग उच्च बढ़ाई दो - फोटोन angiographies के साथ पंजीकरण के लिए एक संदर्भ के नक्शे के रूप में उपयोग साइट के एक प्रारंभिक तस्वीर ले लो.
  2. × 10 बढ़ाई का उपयोग हित के क्षेत्र पर में ज़ूम. Cortical परतों में ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें मैं या द्वितीय (PIAL सतह के नीचे 150 माइक्रोन). यदि उच्च बढ़ाई वांछित है, × 25 उद्देश्य का उपयोग
  3. समय की श्रृंखला रिकॉर्ड (figu प्रारंभ2 फिर से). हम 3-5 फ्रेम के एक औसत का उपयोग करने के लिए छवि की गुणवत्ता को बढ़ाने की सलाह देते हैं.
  4. हवा है कि पशु साँस ले रहा है 50% N2 जोड़कर hypoxemia प्रेरित. यह 10% के के O2 स्तर लाएगा. Hypoxemia oximeter के डेटा की निगरानी के द्वारा सत्यापित करें.
  5. Hypoxemia (उदाहरण के लिए, 30 सेकंड के लिए) के माध्यम से समय की श्रृंखला रिकॉर्ड के लिए जारी रखें, और के बाद सामान्य O2 स्तर बहाल है.
  6. ऑक्सीजन वितरण की गणना के लिए डेटा का पता लगाने, मापने और hypoxia और ऑक्सीजन रक्त वाहिकाओं के आसपास के ऊतकों सिलेंडरों के क्षेत्र बढ़ाता लीजिए.

5. डाटा प्रोसेसिंग

  1. निर्धारित Krogh ऊतक सिलेंडर त्रिज्या इस मैन्युअल रूप से किया जा सकता है और रक्त वाहिनियों के केंद्र और सीमा पर उच्च NADH प्रतिदीप्ति का पता चला है के बीच की दूरी को मापने के द्वारा (चित्रा 3) आर.
  2. वैकल्पिक रूप से, कम्प्यूटेशनल अन्वेषक स्वतंत्र ऊतक सिलेंडर त्रिज्या आर के दृढ़ संकल्प अर्द्ध स्वचालित और केंद्रीय blo का उपयोग करेंआयुध डिपो पोत आर कि पहले से वर्णित किया गया है पूरक के रूप में 1 और इस प्रोटोकॉल की चर्चा खंड में संक्षेप.
  3. खुले उपयोग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, जैसे ImageJ का उपयोग hypoxia के क्षेत्र का निर्धारण करते हैं. ऐसा करने के लिए, NADH संकेत के उपयोग, एक सीमा है कि उच्च NADH तीव्रता क्षेत्र रूपरेखा बनाती है परिभाषित, और फिर बुलंद NADH ऊतक प्रतिदीप्ति के साथ क्षेत्र को मापने.

6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2 क्षणिक hypoxemia (इस चित्रा के PDF संस्करण के लिए, चयनित अभी भी छवियों का इस्तेमाल किया गया है) के दौरान NADH / एंजियोग्राफी की छवियों का एक वीडियो दिखाता है. 3 मिनट की अवधि के लिए 21% से 10% करने के लिए प्रेरित ऑक्सीजन एकाग्रता उतारा गया. प्रयोगात्मक प्रेरित hypoxemia के इस स्तर प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में गंभीर hypoxia के प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. Hypoxia NADH प्रतिदीप्ति में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है, शुरू में जो धमनियों से रक्त की आपूर्ति से दूर थे क्षेत्रों में. तेज NADH ऊतक नोटसीमाओं, जो cortical microcirculation से ऑक्सीजन प्रसार के नमूदार ऊतक सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा 3 में छवि ऑक्सीजन प्रसार मस्तिष्क वाहिकाओं के आसपास सीमाओं की ज्यामिति को दिखाता है. यह संभव है करने के लिए इन सीमाओं से सिलेंडर व्यास Krogh परिणाम निकालना, के रूप में एक पहले से वर्णित है.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) कपाल इमेजिंग के लिए तैयार खिड़की के साथ माउस. (बी) के सिर थाली के आयाम.

चित्रा 2
चित्रा 2 अंतर्जात NADH हरी प्रतिदीप्ति कपाल खिड़की के माध्यम से दो photon इमेजिंग के साथ PIAL सतह के नीचे लगभग 50 माइक्रोन visualized. रक्त वाहिकाओं साथ टेक्सास लाल dextran देखे हैं. 3 मिनट के लिए 10% करने के लिए साँस हवा में ऑक्सीजन कम हो गया था, और फिर 21% के लिए बहाल. पैमाने पर पट्टी: 50μm.

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चित्रा 3 NADH प्रतिदीप्ति सीमाओं की ज्यामिति. पीला रूपरेखा कार्यात्मक hypoxia की सीमा से पता चलता है, नीले हलकों अनुमान से oxygenated सिलेंडर (Krogh) बताते हैं. ब्लू लाइनों सिलेंडर radii के दिखा, संख्या micrometers में radii के.

Discussion

उच्च स्थानिक संकल्प जानकारी ऑक्सीजन प्रसार के बारे में समझ कैसे मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह को नियंत्रित किया जाता है मस्तिष्क की कोशिकाओं को ऑक्सीजन प्रदान करते हैं, और चयापचय की मांग को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है. परंपरागत polarographic ऑक्सीजन क्लार्क शैली कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग माप अत्यधिक आक्रामक हैं और कम स्थानिक संकल्प 2-3 और (द्वितीय श्रेणी) महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया समय है. अब तक केवल मस्तिष्क के ऊतकों में PO 2 को मापने के लिए गैर इनवेसिव विधि स्फुरदीप्ति शमन, जहां उत्साहित जांच के क्षय की दर 4 ऑक्सीजन एकाग्रता के लिए आनुपातिक है. यह विधि सही ऑक्सीजन सांद्रता प्रदान करता है, लेकिन एक मालिकाना डाई और तकनीकी रूप से परिष्कृत स्फुरदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता है. यहाँ, हम एक सीधा, सरल दृष्टिकोण है कि दो flurescence चैनल के साथ एक मानक दो photon इमेजिंग प्रणाली पर आयोजित किया जा सकता है प्रदर्शित करता है. हमारा दृष्टिकोण एक आंतरिक ऊतक 5 संकेत एक का लाभ लेता हैएन डी ही cortical microcirculation की विषम दृश्य की आवश्यकता है. गैर रेखीय, कार्यात्मक ऑक्सीजन सांद्रता एक सीमित पर NADH प्रतिदीप्ति अनिवार्य रूप से द्विआधारी वृद्धि की वजह से, आंतरिक NADH प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है महत्वपूर्ण, metabolically सीमित hypoxia के साथ क्षेत्रों में ही मनाया. एक महत्वपूर्ण निहितार्थ यह है कि ऊतक में cortical microvessels से ऑक्सीजन प्रसार की सीमाओं सीधे cylindrically आकार अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की तीव्रता में परिवर्तन के द्वारा प्रत्यक्ष कर रहे हैं. हम Krogh सिलेंडरों के रूप में इन संरचनाओं को देखें, क्योंकि cylindrically आकार का संरचनाओं कि एक रक्त वाहिका आसपास के ऊतकों की ऑक्सीजन की मात्रा को परिभाषित की अवधारणा अगस्त Krogh द्वारा शुरू की गई थी और हाल ही में प्रयोगात्मक दो photon NADH एक इमेजिंग का उपयोग कर देखा. Krogh सिलेंडर छवियों छवि फ्रेम के z-ढेर लेने से 3 डी में एकत्र किया जा सकता है. वे मर्मज्ञ arterioles के आसपास के क्षेत्र में विशेष रूप से प्रमुख हैं और वे मुताबिक़ बुद्धिघंटे से समाप्त periarteriolar ऊतक सिलेंडर 1,4 केशिका.

Krogh ऊतक सिलेंडर त्रिज्या आर के एक उद्देश्य निर्धारण (खंड 5.2 देखें) हम अच्छी तरह से परिभाषित सिलेंडर के केंद्र और बाहरी सीमा Matlab समारोह "improfile का उपयोग कर के बीच एक खंड के भीतर उनके रेडियल पिक्सेल तीव्रता मूल्यों मापा प्रदान करते हैं. खंड की बाहरी सीमा दृश्य सीमा से परे एक सुरक्षा मार्जिन के साथ विस्तार करने के लिए चुना जाना चाहिए. संकेत से शोर के स्तर में सुधार हम सभी रेडियल 1 ° चरणों में दिखाई सिलेंडर खंड को कवर करने के लिए की जरूरत लाइनों पर averageed. खंड के भीतर जिसके परिणामस्वरूप मतलब रेडियल तीव्रता प्रोफ़ाइल एक तेजी से वृद्धि हुई है जो दिखाई ऊतक सीमा आर करने के लिए corresponded प्रदर्शन किया. हम औसत रेडियल तीव्रता प्रोफ़ाइल एक sigmoidal समारोह के (जैसे बोल्ट्जमान समारोह) फिट और आर के एक परिभाषा के रूप में इसके मोड़ बिंदु (0 एक्स के रूप में भी जाना जाता है) का इस्तेमाल किया. इसी दो - पीhoton microangiography (टेक्सास लाल) सिलेंडर के केंद्र में एक एकान्त केंद्रीय रक्त वाहिका के पार अनुभाग का पता चला. केंद्रीय रक्त वाहिका के व्यास सीधे आर निर्धारित करने के लिए लागू कर सकते हैं.

दो photon NADH इमेजिंग को cortical microangiography की समवर्ती उच्च संकल्प इमेजिंग के रूप में एक ही स्थानिक संकल्प प्रदान करता है. इस विधि का मात्रात्मक आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि पी 50 NADH प्रतिदीप्ति वृद्धि की 3.4 का होना मापा गया है ± 0.6 मिमी 1 पारा और कि microregional ऊतक 2 पुलिस के एक समारोह के रूप में NADH प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ गणितीय में वर्णित किया जा सकता है एक sigmoidal समारोह. . हम बताते हैं कि इस तकनीक से एक जो सबसे करने के लिए hypoxia के (10% करने के लिए हवा में ऑक्सीजन सामग्री कम) की चपेट में हैं मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमति देता है. हम यह भी पता चलता है कि ऑक्सीजन प्रसार एक सरल ज्यामितीय perivascular के पैटर्न के बाद है.

एक critइस विधि के लिए राजनैतिक कदम कपाल खिड़की तैयारी की गुणवत्ता है. सर्जरी कम से कम क्षति का उत्पादन क्रम में उजागर क्षेत्र में रक्त के प्रवाह को परेशान नहीं करना चाहिए. एक चिंता का विषय है कि एक शल्य चिकित्सा समझौता तैयार करने में, खिड़की के नीचे प्रांतस्था के साथ शुरू करने के hypoxic, किसी भी सार्थक प्रयोगों precluding. पोत के सभी प्रकार में उज्ज्वल रक्त प्रवाह और किनारों के साथ कोई महत्वपूर्ण खून बह रहा है के साथ एक अच्छी तरह से तैयार कपाल खिड़की बरकरार बड़ी और छोटी रक्त वाहिकाओं होना चाहिए. Normoxic शर्तों के तहत (PaO2 80-100 mmHg, सपा O2 97-99%) मस्तिष्क पैरेन्काइमा विशिष्ट ऊंचा NADH प्रतिदीप्ति साथ उज्ज्वल ऊतक पैच बिना वर्दी, सजातीय NADH प्रतिदीप्ति एक्ज़िबिट चाहिए.

हमारे दृष्टिकोण का एक मूलभूत भौतिक बाधा गहराई पैठ सीमित है. मस्तिष्क में नीली हरी NADH प्रतिदीप्ति तेजी से हीमोग्लोबिन और इन तरंगदैर्य पर ऊतक बिखरने अवशोषण द्वारा तनु है. यहां तक ​​कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ पानी (1.05 उदा)विसर्जन उद्देश्यों दो photon NADH इमेजिंग वर्तमान में cortical परतों मैं और द्वितीय के लिए सीमित है. इस सीमा को वैज्ञानिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि या सफेद बात के लिए निकटता में ऊर्जा चयापचय की संभावना ग्रे मामले से अलग होगा. हालांकि, ऐसी परतों चतुर्थ छठी या सफेद बात इलाकों या striatum जैसे subcortical संरचनाओं के रूप में गहरे cortical संरचनाओं की जांच विशेष रूप से 6 vivo में माउस प्रांतस्था में वर्णित microlenses के उपयोग की आवश्यकता होगी.

NADH आधारित ऑक्सीजन प्रसार सीमाओं की माप विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब कार्यात्मक hyperemia, और केशिका प्रवाह दर का पता लगाने के 7 के विश्लेषण के रूप में अन्य माप के साथ संयुक्त कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, इस तकनीक स्ट्रोक और अल्जाइमर रोग (ई.) मॉडल में hypoxia कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. ऑक्सीजन प्रसार की सरल ज्यामिति परिस्थितियों जहां केशिका घनत्व है के तहत में microvascular बेड में ऑक्सीजन ढाल की भविष्यवाणी करने के लिए अनुमति देता है8 (जैसे, 9 ई.) वृद्धि और जांच करने के लिए कि कम केशिका घनत्व के साथ मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों hypoxia के microstrokes के लिए वजह से नुकसान के लिए बढ़ा जोखिम में हैं. छवि के लिए क्षमता microregionally भी एक ज्यामिति और ऊतक microstrokes के आकार की जांच करने के लिए और ऊतकों की मात्रा में hypoxia होती निर्धारित की अनुमति देता है, के रूप में अच्छी तरह से ऊतक hypoxia और बाद neuronal मौत या केशिका remodeling के 10 के बीच संबंध.

अंत में, अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति में वृद्धि के बाद से तीव्र mitochondrial रोग के प्रत्यक्ष परिणाम हैं, तो इस विधि NADH इमेजिंग के तंत्रिका ऊर्जा 11 चयापचय और mitochondrial रोग के लिए एक प्रॉक्सी के लिए एक विशेष संवाददाता के रूप में उपयोग करने का अवसर पैदा करता है.

अंत में, अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग एक सरल, सादा उपकरण है कि दोनों सामान्य के तहत ऑक्सीजन और मस्तिष्क में वितरण की खपत को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैऔर वैकृत राज्यों में.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम सिर थाली डिजाइन के लिए हैं डा. Maiken Nedergaard (रोचेस्टर मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय) धन्यवाद. एसडी (R01DA026325 और P30AI078498 और नींव (दाना नींव ब्रेन और Immunoimaging कार्यक्रम, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 0635595T और ए एल एस एसोसिएशन [1112 #)] के.के. अनुदान) के लिए काम किया गया है के एनआईएच पुरस्कार द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heating pads Beyond Bodi Heat
Ophthalmic ointment (Artificial tears) Pfizer Pharma GmbH
Povidone-iodine 10% solution Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution
Cement Stoelting Co. 51456

Cyanoacrylate 454

Loctite

aCSF Harvard Apparatus 597316
Microtorque II handpiece kit Pearson Assessments R14-0002
IRF 007 drill bits Fine Science Tools 19008-07
Forceps #5 Fine Science Tools 11295
Forceps #5/45 Fine Science Tools 11251-35
#0 glass coverslip Electron Microscopy Sciences 63750-01
Photomultiplier tube Hamamatsu Corp. HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai Newport Corp.

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References

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