La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

Neuroscience
 

Summary

Aquí se describe un método para visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón

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Polesskaya, O., Sun, A., Salahura, G., Silva, J. N., Dewhurst, S., Kasischke, K. Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence. J. Vis. Exp. (60), e3466, doi:10.3791/3466 (2012).

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Abstract

La capacidad del cerebro para funcionar a un alto nivel de la demanda metabólica depende de la oferta continua de oxígeno a través del flujo sanguíneo y la difusión de oxígeno a los tejidos. Aquí se presenta un protocolo experimental, visualizar y metodológicos para visualizar directamente la hipoxia tisular y microrregional para inferir gradientes perivasculares de oxígeno en la corteza del ratón. Se basa en la relación no lineal entre dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) la intensidad de fluorescencia endógena y la presión parcial de oxígeno en el tejido, donde observó tejido NADH fluorescencia aumenta bruscamente en los niveles de oxígeno del tejido por debajo de 10 mmHg 1. Utilizamos dos fotones de excitación a 740 nm que permite la excitación simultánea de fluorescencia intrínseca del tejido NADH y el plasma sanguíneo en contraste con Texas-Red de dextrano. Las ventajas de este método sobre los métodos existentes incluyen los siguientes: toma ventaja de una señal de tejido intrínseco y se puede realizar utilizando el estándar de dos fotones en vivo imenvejecimiento de equipos, sino que permite la vigilancia continua en el campo de la vista con una resolución de profundidad de aproximadamente 50 micras. Se demuestra que las zonas de tejido cerebral más alejados de los vasos sanguíneos cerebrales corresponden a las cuencas hidrográficas vulnerables que son los primeros que se desempeñe con la hipoxia debido a una disminución en el suministro de oxígeno vascular. Este método le permite a uno la imagen cortical oxigenación microrregional y por tanto es útil para examinar el papel de la oferta tisular de oxígeno inadecuada o restringida en las enfermedades neurovasculares y los accidentes cerebrovasculares.

Protocol

1. Preparación del animal para obtener imágenes

Nota: Nosotros usamos ratones C57BL adultos. Diferentes cepas transgénicas se pueden utilizar dependiendo de la pregunta de investigación. Cirugías microvasculares y oximetría de pulso se facilitan en los ratones con pelaje blanco (por ejemplo, cepa FVB).

  1. Preparar el lugar de la cirugía en el banco. Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse en autoclave o desinfectada con etanol al 70%.
  2. Insertar una sonda rectal, y medir continuamente la temperatura corporal del animal durante todo el procedimiento
  3. Se anestesia el ratón usando inicialmente 5% de isoflurano. En 15 a 30 s, cuando el animal no se mueve, colóquelo en una almohadilla térmica (37 ° C), y aplicar una mascarilla para el suministro continuo de aire que contiene 1,3-1,5% de isoflurano). Asegúrese de que el animal no está respondiendo a un estímulo doloroso (por ejemplo, pizca de cola).
  4. El uso de gel de lágrimas artificiales para cubrir los ojos del ratón, para evitar la exposición al aire seco.
  5. Utilizando una máquina de afeitar eléctrica, quitar el pelo fesde la cabeza y de ambos muslos. Aplique removedor de pelo (por ejemplo, Nair) en el muslo durante 2 minutos, y luego pase cuidadosamente para eliminar el resto del cabello. Este muslo se utilizará para la oximetría.
  6. Desinfecte el cuero cabelludo con un 10% de povidona-yodo solución y 70% de etanol.

2. Preparación de la ventana abierta del cráneo del cráneo

  1. A partir de 5 mm caudal a la cabeza, hacer una incisión en el cuero cabelludo con unas tijeras, y avanzar un centímetro. Mover la piel a los lados para exponer el cráneo.
  2. Para quitar las membranas en la parte superior del cráneo se aplican 10% de solución de cloruro férrico a la parte superior del cráneo. Limpie el exceso de solución, y raspar las membranas de distancia con 45 ° de ángulo # 5 pinzas. Es importante para preparar el sitio cuidadosamente, con el fin de asegurar que la placa de cabeza puede estar firmemente sujeto al cráneo (pasos # 4 a 6).
  3. Utilizando un microscopio de disección, identificar el área de interés. Tenga en cuenta que las suturas del cráneo debe ser evitado debido a que el cráneo de cromper una manera impredecible a lo largo de estas líneas.
  4. Aplicar una capa delgada de cola rápida (por ejemplo Locktite 454) alrededor de los bordes de la ventana de la placa de cabeza (Figura 1). Colocar la placa de cabeza de tal manera que el área de interés está expuesto en la ventana. Aplique una ligera presión en la placa de la cabeza. Aplicar una pequeña cantidad de cemento dental para polimerizar el pegamento rápidamente. Mantenga esta posición durante 10 segundos, mientras que el pegamento se polimeriza.
  5. Aplicar una pequeña cantidad de pegamento rápido a los bordes de la ventana para sellar la placa de cabeza y el cráneo. Atornille la placa de la cabeza al titular del animal en el ámbito de disección.
  6. Con el taladro Microtorque II estableció a 6000 rpm y un IRF 005 broca, retire todo el pegamento extra del cráneo y de la placa de la cabeza. Cualquier pegamento que queda en la placa de cabeza debe ser eliminado, ya que de lo contrario va a interferir con la unión de la cubierta de vidrio.
  7. Establecer el taladro a 1000 rpm, y comenzar a perforar el cráneo haciendo un círculo dentro de la ventana placa de cabeza, diámetro ~ 5 mm. El uso de luz los movimientos radicales como si estuviera dibujando con un lápiz muy suave. Deje de perforar cada 20-30 segundos para quitar el polvo de huesos con aire comprimido.
    Nota: La forma de la abertura en la placa del cabezal permite un acceso adicional para la broca (para el cirujano de izquierda y derecha con las manos), lo que hace que sea más fácil para crear una ventana craneal circular. Además, los dos orificios en forma de impares proporcionar el espacio necesario para insertar un electrodo de Clark-o-electrodo de vidrio en el tejido cerebral debajo de la ventana craneal para mediciones adicionales polarográficos o electrofisiológicos.
  8. A medida que la perforación avanza, una madriguera se forma alrededor del cráneo intacto en el centro. Tenga cuidado de no perforar el cráneo adelgazado, pero para hacer esta madriguera de un grosor uniforme. Tenga cuidado extra alrededor de los vasos sanguíneo grande-que no debe ponerse en peligro y, si es posible, no tocó siquiera.
  9. Utilizar una "pata" de pinzas # 3 para levantar ("Flick off") del hueso en el centro de la ventana. Aplique una gota de Artificial del líquido cefalorraquídeo (ACSF) en la ventana.
  10. Limpie suavemente con aCSF una esquina de un pañuelo de papel suave (por ejemplo, Kimwipe). Por lo general, la duramadre está dañado en uno o más lugares alrededor del borde de la ventana. A partir de uno de estos sitios, levante suavemente y luego retire la duramadre de la superficie del cerebro, utilizando pinzas ángulo de 45 ° N ° 5. Al elegir el sitio donde se va a empezar a eliminar la dura, evitar las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos grandes. Si hay sangrado, aplique una gota de aCSF y esperar 2-3 minutos para la sangría de menor importancia que parar.
  11. Preparar un 0,07% bajo punto de fusión de agarosa disuelta en ACSF) Llevar la agarosa fundida a la temperatura corporal. Limpie el exceso de aCSF desde la superficie del cerebro. Verter la agarosa en la ventana, y se cubre con una lámina de vidrio. Presione el vaso suavemente para hacer un contacto entre el vidrio y la placa de cabeza, y esperar 10-20 segundos hasta que la agarosa es sólido.
  12. Eliminar el exceso de agarosa de la cubierta de vidrio con unas pinzas y papel de los tejidos blandos.
  13. Ponga una pequeñacantidad de pegamento rápido alrededor del vaso para pegar el vidrio a la placa de cabeza. Aplicar una pequeña cantidad de cemento dental para solidificar el pegamento (Figura 1).

3. La inyección intravenosa y el control oxigenación de la sangre

Nota: Se utiliza rutinariamente la vena femoral para la aplicación intravenosa de Texas rojo en lugar de la vena de la cola. Esto es debido a inyecciones vena femoral proporcionar inyecciones en bolo seguras y reproducibles de la tintura.

  1. Gire el animal parcialmente para dejar al descubierto el interior del muslo izquierdo. Use cinta para asegurar el animal en esta posición.
  2. Aplicar fregado antiséptico, y luego 100% de etanol a la piel.
  3. Hacer una incisión a lo largo del muslo desde la rodilla hasta la sínfisis del pubis. Separe los tejidos blandos por disección roma utilizando pinzas # 5.
  4. Llenar jeringa de 1 ml con 130 l de Rojo Texas (2,5 mg / ml). Coloque una nueva aguja (calibre 30), y doble con cuidado a los 30 °, manteniendo el bisel hacia arriba. Llene el wi agujaª Rojo Texas solución.
  5. Bajo un microscopio de disección, inserte la aguja en la vena femoral e inyectar 100 l de Texas Red. Se retira la aguja y presione suavemente la vena con una gasa para detener el sangrado.
  6. Cierre la piel con sutura 4-0.
  7. Para el monitoreo continuo de la sangre de SpO 2 (para asegurar la adecuada oxigenación de la sangre) coloque la sonda del oxímetro en el muslo derecho (de la cual el pelo se retiró previamente).

4. De dos fotones de imágenes

Nota: Usamos una Olympus Fluoview1000 multifotónica sistema de imágenes (vertical) con una Spectra-Physics Maitai HP femtosegundo DeepSee Ti: Sa láser como una fuente de excitación. Para imágenes, usamos x 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), o 25 × NA 1,05 (Olympus XLPlan N) los objetivos de inmersión en agua. Tomamos imágenes de 12 bits de profundidad con una resolución de 512 × 512 píxeles con un píxel tiempo de permanencia de 2 mS. El NADH y Texas-Red de dextrano-se al mismo tiempo emocionado a 740 nm, y flúorescencia está separada de la luz de excitación mediante un espejo dicroico / infrarrojo cercano de bloqueo de combinación de filtros (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, EE.UU.), dividido en dos canales a través de un espejo dicroico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, Vermont, EE.UU.), y de paso de banda filtrada (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Potencia láser mide después de que el objetivo era 10-20 mW para formación de imágenes en la capa I y 20-50 mW para formación de imágenes en la capa II.

  1. Transferir el ratón preparado quirúrgicamente a la platina del microscopio. Tomar una imagen inicial del sitio ventana craneal uso de la iluminación de campo claro con un aumento de 4x para usar como un mapa de referencia para el registro en un aumento mayor de dos fotones de angiografías.
  2. Haz zoom en el área de interés utilizando × 10 aumentos. Seleccione un área de interés en las capas corticales I o II (hasta 150 m por debajo de la superficie pial). Si se desea mayor aumento, el uso objetivo × 25
  3. Inicio de la serie de tiempo (Figure 2). Le recomendamos que utilice un promedio de 3-5 cuadros para aumentar la calidad de la imagen.
  4. Inducir la hipoxemia mediante la adición de un 50% de N2 a la atmósfera que el animal está respirando. Esto hará que el nivel de O2 al 10%. Verifique la hipoxemia mediante el control de los datos de oxímetro.
  5. Continuar para grabar la serie de tiempo a través de la hipoxemia (por ejemplo, durante 30 segundos), y después de nivel normal de O2 es restaurado.
  6. Recopilar datos para el cálculo de la distribución de oxígeno mediante la detección, medición y cuantificación de la zona de los cilindros de hipoxia tisular y oxigenada alrededor de los vasos sanguíneos.

5. Proceso de datos

  1. Determinar la Krogh tejido cilindro radio R. Esto puede hacerse manualmente (Figura 3) mediante la medición de la distancia entre el centro del vaso sanguíneo y el límite en el que se detecta alta fluorescencia de NADH.
  2. También puede utilizar el cálculo por el investigador independiente de la determinación semi-automático de la investigación del tejido y el radio del cilindro central de blor od buque que ha sido descrito previamente una forma complementaria y se resumen en la sección de discusión de este protocolo.
  3. Determinar el área de la hipoxia con libre acceso al software de análisis de imagen, por ejemplo, ImageJ. Para ello, utilice la señal de NADH, definir un umbral que delimita el área de alta intensidad de NADH, y luego medir el área con elevada fluorescencia de los tejidos NADH.

6. Los resultados representativos

La figura 2 muestra un video de NADH / angiografía imágenes durante la hipoxemia transitoria (para la versión en PDF de esta figura, una selección de imágenes fijas se han utilizado). La concentración de oxígeno inspirado se redujo de 21% a 10% durante un período de 3 minutos. Este nivel de hipoxemia inducida experimentalmente es suficiente para inducir la hipoxia severa en la corteza cerebral. La hipoxia condujo a un aumento de la fluorescencia de NADH, inicialmente en las zonas que estaban más alejado del suministro de sangre arterial. Tenga en cuenta que el tejido NADH agudalímites, que representan los límites observables de tejido de difusión de oxígeno a partir de la microcirculación corticales. La imagen de la Figura 3 se muestra la geometría de los límites de la difusión de oxígeno que rodean los vasos cerebrales. Es posible deducir Krogh diámetros de los cilindros de estos límites, como se ha descrito anteriormente 1.

Figura 1
Figura 1. (A) de ratón con ventana craneal preparado para imágenes. (B) Dimensiones de la placa de la cabeza.

Figura 2
Figura 2. Endógeno NADH fluorescencia verde visualiza con dos fotones de imágenes a través de la ventana del cráneo, de aproximadamente 50 m por debajo de la superficie pial. Los vasos sanguíneos se visualizan con Rojo Texas dextrano. El oxígeno en el aire inhalado se redujo a 10% durante 3 min, y luego restaurado el 21%. Barra de escala: 50 micras.

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Figura 3. Geometría de los límites de NADH fluorescencia. Esquema amarillo muestra el límite de la hipoxia funcional; círculos azules muestran proyectadas oxigenados (Krogh) cilindros. Las líneas azules muestran los radios del cilindro, los números muestran radios en micrómetros.

Discussion

Información de alta resolución espacial sobre la difusión de oxígeno es importante para entender cómo el flujo sanguíneo en el cerebro se regulan para suministrar oxígeno a las células cerebrales, y para satisfacer la demanda metabólica. Tradicionales mediciones de oxígeno polarográfico con Clark al estilo de los electrodos de vidrio son altamente invasivos y tienen baja resolución espacial de 2-3 y el tiempo de respuesta significativa (segunda serie). Hasta el momento el único método no invasivo para medir la PO 2 en el tejido cerebral es apagar la fosforescencia, donde la tasa de descomposición de la sonda de excitación es proporcional a la concentración de oxígeno 4. Este método proporciona concentraciones exactas de oxígeno, sino que requiere un colorante específico y un técnico sofisticado sistema de vida de la fosforescencia de imagen. Este sentido, demuestran un enfoque directo, más simple que se puede realizar en un sistema de imágenes estándar de dos fotones con dos canales flurescence. Nuestro enfoque tiene la ventaja de una señal intrínseca del tejido 5 aª sólo requiere la visualización de contraste de la microcirculación cortical. Debido a la no-lineal, aumento esencialmente binaria de NADH fluorescencia a funcionalmente limitar las concentraciones de oxígeno 1, el aumento de la fluorescencia intrínseca NADH se observó sólo en áreas con hipoxia significativa, metabólicamente limitante. Una consecuencia importante es que los límites del tejido de la difusión de oxígeno de los microvasos corticales son directamente observables por los cambios de intensidad de forma cilíndrica de la fluorescencia endógena NADH. Nos referimos a estas estructuras como cilindros Krogh, porque el concepto de estructuras de forma cilíndrica que definen el volumen oxigenada del tejido que rodea los vasos sanguíneos fue presentado por August Krogh y ha sido recientemente observado experimentalmente con dos fotones NADH imagen 1. Cilindros Krogh imágenes se pueden recoger en 3D, a una z pila de cuadros de imagen. Son especialmente prominente en la vecindad de las arteriolas penetrantes y son congruentes ingenioh capilar agotadas cilindros periarteriolares tejidos 1,4.

Para proporcionar una determinación objetiva de la R tejido Krogh radio del cilindro (véase la sección 5.2) que mide los valores de intensidad de pixel radiales dentro de un segmento bien definido entre el centro del cilindro y el límite exterior mediante la función de Matlab "improfile". El límite exterior del segmento debe ser elegido para extender con un margen de seguridad más allá del límite visible. Para mejorar el nivel de señal a ruido nos averageed sobre todas las líneas radiales necesarios para cubrir el segmento visible del cilindro en pasos de 1 °. El perfil medio resultante intensidad radial dentro del segmento exhibió un aumento pronunciado que correspondía a la R tejido límite visible. El encajamos una función sigmoidal (por ejemplo, la función de Boltzmann) para el perfil de intensidad radial promediada y se utiliza su punto de inflexión (también conocido como x 0) como una definición de R. El correspondiente dos-pHoton microangiography (Texas-rojo) reveló la sección transversal de un vaso sanguíneo solitario central en el centro del cilindro. El diámetro del vaso sanguíneo central puede aplicarse directamente para determinar r.

Dos fotones de NADH imágenes proporciona la misma resolución espacial como la concurrente de alta resolución de imagen de la microangiography cortical. Una característica importante para la aplicación cuantitativa de este método es que p 50 del aumento de fluorescencia de NADH se ha medido a ser de 3,4 ± 0,6 mm de Hg 1 y que la intensidad de fluorescencia de NADH como una función del tejido microrregional PO 2 puede ser matemáticamente descrito con una función sigmoidal. . Se demuestra que esta técnica permite una para identificar las áreas del cerebro que son más vulnerables a la hipoxia (por disminución del contenido de oxígeno en el aire a 10%). También se muestra que la difusión de oxígeno sigue un patrón simple perivascular geométrica.

Un críticoiCal paso para este método es la calidad de la preparación ventana craneal. La cirugía debe producir un daño mínimo a fin de no perturbar el flujo sanguíneo a la zona expuesta. Una preocupación es que en una preparación quirúrgicamente comprometida, la corteza debajo de la ventana puede ser hipóxico, para empezar, lo que impide cualquier experimentos significativos. Una ventana craneal bien preparado debe tener intactos los vasos sanguíneos mayores y menores, con el flujo de sangre viva en todos los tipos de buques y no hay hemorragia significativa a lo largo de los bordes. En condiciones normoxic (PaO 2 80-100 mmHg, Sp. O2 97-99%) el parénquima cerebral que presentan fluorescencia uniforme, homogénea y sin NADH parches conspicuos, los tejidos brillantes con fluorescencia de NADH elevado.

Una restricción física fundamental de nuestro enfoque se limita la profundidad de penetración. La fluorescencia azul-verde de NADH en el cerebro es rápidamente atenuada por la absorción de la hemoglobina y la dispersión del tejido en estas longitudes de onda. Incluso con apertura numérica alta (por ejemplo 1,05) aguaobjetivos de inmersión de dos fotones NADH imagen se limita actualmente a las capas corticales I y II. Esta limitación es científicamente relevante porque el metabolismo energético en o en la proximidad de la materia blanca es probable que difieren de la materia gris. Sin embargo, la investigación de las estructuras corticales profundas, tales como capas IV-VI o estructuras subcorticales tales como tractos de sustancia blanca o cuerpo estriado del requeriría el uso de microlentes especializados como se describe en la corteza del ratón in vivo 6.

NADH basado en la medición de los límites de la difusión de oxígeno puede ser especialmente útil cuando se combina con otras mediciones tales como análisis de hiperemia funcional, y la detección de las tasas de flujo capilar 7. Por ejemplo, esta técnica se puede adaptar para visualizar la hipoxia en el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Alzheimer (EA) modelos. La geometría simple de difusión de oxígeno permite predecir el gradiente de oxígeno en los lechos microvasculares en circunstancias donde la densidad capilar es deaumentó 8 (por ejemplo, AD 9) y para examinar si las regiones de tejido cerebral con reducción de la densidad capilar tienen un mayor riesgo de daños debido a la hipoxia microstrokes. La capacidad de imagen microregionally también permite una para examinar la geometría y el tamaño de microstrokes tejido y determinar el volumen de tejido en el que se produce la hipoxia, así como la relación entre la hipoxia del tejido y posterior muerte neuronal o remodelación capilar 10.

Por último, dado el aumento de la fluorescencia endógena NADH son la consecuencia directa de la disfunción mitocondrial aguda, este método crea la oportunidad de utilizar imágenes de NADH como un reportero en particular para el metabolismo energético neuronal 11 y un proxy para la disfunción mitocondrial.

En conclusión, de dos fotones de imágenes de fluorescencia de NADH endógeno es una herramienta sencilla, poco exigente que se puede utilizar para comprender el aporte de oxígeno y el consumo en el cerebro en tanto normalesy en estados patológicos.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Maiken Nedergaard (Universidad de Rochester Medical Center) para el diseño de la placa de la cabeza. El trabajo ha sido financiado por el NIH premios a SD (R01DA026325 y P30AI078498 y donaciones de fundaciones a KK (DANA cerebro bases y el programa de Immunoimaging, Asociación Americana del Corazón y la Asociación 0635595T ELA [# 1112)]).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heating pads Beyond Bodi Heat
Ophthalmic ointment (Artificial tears) Pfizer Pharma GmbH
Povidone-iodine 10% solution Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution
Cement Stoelting Co. 51456

Cyanoacrylate 454

Loctite

aCSF Harvard Apparatus 597316
Microtorque II handpiece kit Pearson Assessments R14-0002
IRF 007 drill bits Fine Science Tools 19008-07
Forceps #5 Fine Science Tools 11295
Forceps #5/45 Fine Science Tools 11251-35
#0 glass coverslip Electron Microscopy Sciences 63750-01
Photomultiplier tube Hamamatsu Corp. HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai Newport Corp.

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References

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