संयंत्र जीन समारोह की संयुक्त जीनोमिक्स, Metabolomics और सूचना के माध्यम से व्याख्या

Biology
 

Summary

जीनोमिक्स, सह अभिव्यक्ति जीन विश्लेषण और लक्ष्य यौगिकों की पहचान की चयापचय के माध्यम से संयोजन जीन कार्यात्मक टिप्पणी दे.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tohge, T., Fernie, A. R. Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics. J. Vis. Exp. (64), e3487, doi:10.3791/3487 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

मॉडल संयंत्र प्रजातियों के लिए जो पूरा जीनोम अनुक्रम उपलब्ध हैं और जैव - पीटकर म्यूटेंट, जंगली accessions और उन्नत प्रजनन आबादी के रूप में संसाधनों की प्रचुरता के कभी विस्तार संख्या को देखते हुए, वहाँ जीन कार्यात्मक एनोटेशन के लिए एक बढ़ती बोझ है. इस प्रोटोकॉल में, संयंत्र जीन संयुक्त सह अभिव्यक्ति जीन विश्लेषण का उपयोग कर समारोह का एनोटेशन, metabolomics और सूचना (चित्रा 1) प्रदान की जाती है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जाना जाता है समारोह के लक्ष्य जीन गैर एनोटेट जीन की पहचान के लिए एक निश्चित चयापचय की प्रक्रिया में शामिल metabolomics के माध्यम से लक्ष्य यौगिकों की पहचान के साथ, की संभावना की अनुमति के सिद्धांत पर आधारित है. रणनीतियाँ आगे इनमें से कोई भी के बावजूद दोनों आगे और रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण से उत्पन्न आबादी पर इस जानकारी को लागू करने के लिए डाल रहे हैं सरल कर रहे हैं. इस दृष्टिकोण के परिणाम से भी एक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अज्ञात नई या विशिष्ट से प्रतिनिधित्व चोटियों विशेषताएँसीमित ऊतकों, प्रजातियों के पौधे या तनाव इलाज है, जो वर्तमान में संयंत्र चयापचय को समझने के लिए महत्वपूर्ण परीक्षण में condary चयापचयों.

Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. संयंत्र सामग्री काटा और तुरंत जमे हुए हैं.
  2. मिक्सर चक्की से जमे हुए संयंत्र सामग्री पाउडर (या मोर्टार) और -80 डिग्री सेल्सियस पर फाल्कन ट्यूब या Eppendorf ट्यूब में संग्रहीत

2. Metabolite रूपरेखा के लिए निकालना

  1. अशेष भाजक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में संयंत्र सामग्री जमे हुए.
  2. ताजा जमे हुए संयंत्र सामग्री के वजन के मिलीग्राम प्रति निकासी बफर के 5 μl जोड़ें.
  3. एक (या gilconia) धातु गेंद जोड़ें और 25 -1 लोकसभा में 2 मिनट के लिए मिल मिक्सर के साथ जमे हुए पाउडर के homogenize.
  4. 12,000 rpm पर 10 मिनट अपकेंद्रित्र.
  5. सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण केन्द्रापसारक फिल्टर NANOSEP.
  6. +४,००० Rpm पर 2 मिनट अपकेंद्रित्र.
  7. नई Eppendorf ट्यूब, -20 डिग्री सी का उपयोग करें जब तक पर दुकान करने के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.

3. LC-एमएस द्वारा metabolite रूपरेखा

  1. HPLC सेट और स्तंभ ओवन और नमूना ट्रे के तापमान की जाँच करें.
  2. एमएस हालत सेट और वैक्यूम और केशिका हीटिंग की स्थिति की जाँच करें.
  3. एमएस डिटेक्टर मी / z अंशांकन प्रदर्शन करते हैं.
  4. LC-एमएस के लिए अर्क के 50 μl की गिलास शीशी स्थानांतरण.
  5. LC-एमएस के अर्क के 5 μl इंजेक्षन.

4. डेटा विश्लेषण

  1. Xcalibur या Metalign 4 कॉन्फ़िगर और डेटा विश्लेषण का चयन करने के लिए संसाधित किया जाना है.
  2. मैं टेबल में मिश्रित वर्ग के अनुसार में आपकी रुचि का पता लगाया चोटियों की एक तालिका तैयार करते हैं.
  3. सह मानक यौगिकों की क्षालन द्वारा चोटियों को पहचानें.
  4. एनोटेट एमएस विश्लेषण 2, साहित्य सर्वेक्षण, metabolite, डेटाबेस खोज (चित्रा 2, 12,13) ​​का उपयोग चोटियों का पता चला.

5. मेटाबोलिक मार्ग की भविष्यवाणी

  1. पाया यौगिकों के साथ एक संभव मार्ग का निर्माण. शिखर एनोटेशन का उपयोग करते हुए मार्ग की भविष्यवाणी पता चला परिसर के रासायनिक संरचना के आधार पर किया जाना चाहिएचयापचय मार्ग 13 पर enzymatic कार्य को जोड़ने की भविष्यवाणी के द्वारा है. संरचना biosynthetic कदम सटीक पीक एनोटेशन के साथ आयोजित किया जाना चाहिए. लेकिन विस्तृत रासायनिक संरचना का निर्धारण, उदाहरण चीनी आधा भाग के लिए, इस चरण में अपरिहार्य नहीं है, क्योंकि चीनी आधा भाग और adducted स्थिति की भविष्यवाणी एमएस विश्लेषण के द्वारा की पहचान बहुत मुश्किल है. Hexoside और pentoside जैसे चीनी प्रकार का निर्धारण परियोजना के अंतिम चरण में चीनी दाता के enzymatic परख द्वारा पहचाना जाएगा. अधिकतर मार्ग की भविष्यवाणी के निर्माण के रूप में छोटे अणु निर्जलीकरण प्रतिक्रिया के रूप में कुछ मामलों में छोड़कर बड़े अणु के मध्यवर्ती है किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए परमाणु आणविक वजन की सूची 16 / एच के बीच अंतर के लिए z मीटर और ओह आधा भाग (ऑक्सीकरण), 14 मीटर z / (कार्बन परमाणु) अंतर के लिए के बीच ओह और OME (मेथिलिकरण) और 162 मी / z ( मेगावाट hexose (ग्लाइकोसिलेशन) के लिए एच 2) हे, भविष्यवाणी के लिए उपयोगी है. का दृढ़ संकल्पऊतकों specificities के सहसंबंध विश्लेषण के साथ संशोधन प्रकार चयापचय मार्ग की भविष्यवाणी में मदद करता है. सामान्य चयापचय मार्ग के रूप में KEGG (डेटाबेस का डेटाबेस http://www.genome.jp/kegg/ ) और PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), अपने हित के चयापचय मार्ग की भविष्यवाणी के लिए बहुत प्रभावी है.

6. Arabidopsis Orthologous जीन आईडी के साथ जीन की सूची तैयार

  1. जीनोमिक डेटाबेस से जीन आईडी सूची डाउनलोड करें.
  2. Arabidopsis orthologous जीन जीन आईडी जोड़ने के लिए, अपने लक्ष्य संयंत्र के मामले में में Arabidopsis नहीं है.
  3. आपके मार्ग के हित में जीन की एक सूची तैयार करते हैं. Arabidopsis मार्ग डेटा और जीन परिवार डेटा की व्याख्या TAIR वेबसाइट (में उपलब्ध हैं http://www.arabidopsis.org/~~V ). यदि आप Arabidopsis orthologous जीन की एक सूची तैयार है, आप combi बाद में कर सकते हैंउन्हें पूर्वोत्तर.

7. सह व्यक्त जीन विश्लेषण

  1. टेस्ट जीन आईडी तैयार अपने मार्ग ब्याज की (टेबल द्वितीय) में अच्छी तरह से ज्ञात जीन जोड़े का उपयोग सहसंबंध की जाँच करके अपने मार्ग के लिए सबसे अच्छा डेटाबेस खोज सूची का उपयोग. यदि सह अभिव्यक्ति डेटाबेस या जीन की अभिव्यक्ति डेटाबेस अपने हित के संयंत्र में उपलब्ध नहीं हैं, में Arabidopsis डेटाबेस सह अभिव्यक्ति Arabidopsis orthologous जीन की एक सूची के साथ किया जाना चाहिए. जौ के मामले में, चावल, चिनार, गेहूं, Medicago और सोयाबीन, संयंत्र प्रजातियों के सह अभिव्यक्ति विश्लेषण (टेबल द्वितीय) इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. अपने मार्ग के हित में अच्छी तरह से ज्ञात जीनों के कनेक्शन के आधार पर अपने लक्ष्य नेटवर्क सह अभिव्यक्ति के लिए रूपरेखा का निर्माण.
  3. सहसंबद्ध उम्मीदवार जीन (आर 0.4 <~ अपने मार्ग के हित में अच्छी तरह से ज्ञात जीनों के कनेक्शन के बीच गुणांक मूल्य के अनुमानित मूल्य के भीतर 0.90) को जोड़ें और अपने जनसंपर्क में उनके जीन एनोटेशन की जांचसबसे अच्छा उम्मीदवार जीन (चित्रा 3) को खोजने के लिए इस नेटवर्क के कनेक्शन के लिए edicted परिवारों. गुणांक मूल्य की सीमा नेटवर्क और सहसंबद्ध जीनों की संरचना और घनत्व के अनुसार समन्वित किया जाना चाहिए.
  4. जीन है जो आप अपने लक्ष्य मार्ग के लिए विशेष होने के रूप में नीचे संकीर्ण करने में सक्षम हैं की सूची बनाओ.
  5. अंग और specificities के अपने उम्मीदवार जीन के तनाव प्रतिक्रियाओं के जीन की अभिव्यक्ति की जाँच करें.

8. सभी जानकारी के एकीकरण के लिए नए रास्ते की भविष्यवाणी

  1. अच्छी तरह से विशेषता जीन है जो भविष्यवाणी चयापचय मार्ग सह अभिव्यक्ति विश्लेषण की क्वेरी के लिए इस्तेमाल किया गया है जोड़ें.
  2. इस मार्ग में uncharacterized भागों की जाँच करें, उदाहरण के लिए enzymatic कदम, परिवहन प्रोटीन और प्रतिलेखन कारक uncharacterized.
  3. इन लापता uncharacterized कदम के लिए सबसे उपयुक्त जीन एनोटेशन का अनुमान है.
  4. सिलिको जीई में metabolite, रूपरेखा और उम्मीदवार जीनों के परिणाम का मिश्रणपूर्वोत्तर अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी मार्ग पर आधारित है.
  5. भविष्यवाणी जीन समारोह के अनुसार उदाहरण के लिए, मार्ग, acetylated metabolite है, ग्लाइकोसाइड के लिए glycosyltransferase, oxidised परिसर के लिए P450 के लिए acetyltransferase पर अपने उम्मीदवार जीन की व्यवस्था करें. जातिवृत्तिक पेड़ विश्लेषण के एमिनो एसिड दृश्यों के कुछ विस्तृत P450 और glycosyltransferase के रूप में जीन परिवार के लिए उपयोगी है.
  6. ऊतक या specificities के metabolite का संचय और जीन उम्मीदवार जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर के बीच तनाव प्रतिक्रियाओं की निरंतरता की जाँच करें.
  7. सब्सट्रेट और तनाव उत्तरदायी जीनों को प्रदान करने के लिए अन्य चयापचय के लिए कनेक्शन की जाँच करें.

9. जीन की पहचान के लिए जैव संसाधनों का उपयोग प्रयोगों

  1. उम्मीदवार जीन की पहचान के लिए प्रयोग की सुविधा के लिए जैव संसाधनों की उपलब्धता की जाँच करें.
  2. जीन समारोह की पहचान को उत्परिवर्ती पुस्तकालय और पूर्ण लंबाई सीडीएनए लाइब्रेरी के रूप में जैव - संसाधनों का उपयोग करने के लिए एक प्रयोग करें. टीoverexpression के पौधों और पीटकर म्यूटेंट, एंजाइमी परख और प्रमोटर बंधन परख की तैयारी के साथ वह कार्यात्मक जीन की पहचान के लिए प्रयोग के लिए अपनी भविष्यवाणी में सबसे अच्छा उम्मीदवार जीन के लिए प्रदर्शन किया जाना है. प्रोटीन गुणों के लक्षण वर्णन और overexpression के पौधों की तैयारी बेहतर metabolite का प्रोफ़ाइल को उत्परिवर्ती का उपयोग कर के बाद से यह अब काफी लेता परिवर्तन के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन और जीन क्लोनिंग तैयार की पुष्टि के बाद किया जा के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन परख.

10. प्रतिनिधि परिणाम

एकीकृत इस प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण की प्रक्रिया कई निर्दिष्ट प्रयोगात्मक उद्देश्य और जैविक और विश्लेषणात्मक संयोजनों की पसंद पर निर्भर करता संभावनाएं है. प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक डिजाइन की पसंद ठीक से अपने लक्ष्य मार्ग, यौगिकों और संयंत्र प्रजातियों के आधार पर किया जाना चाहिए. एकीकरण इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीति एफ ओ सी है संयंत्र जीन और कई जैव और डेटा संसाधन की एक कुशल उपयोग के साथ उपन्यास जीन के कार्यों की खोज समारोह की टिप्पणी पर इस्तेमाल किया है. की उम्मीद परिणाम लिए निर्णायक भविष्यवाणी की ही मामले के साथ उपलब्ध कराने का वादा किया है. इस तथ्य को इंगित करता है कि अगर पर्याप्त सबूत संयोजन प्रोफाइल द्वारा नहीं दिया जा सकता है, प्रयोग शुरू किया जा नहीं करना चाहिए. इस कारण से, किसी भी मामले में, RT-पीसीआर द्वारा लक्षित जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के रूप में अतिरिक्त प्रारंभिक प्रयोगों, जीन समारोह की आपकी भविष्यवाणी का समर्थन कर सकते हैं. और भविष्यवाणी की सटीकता और शुद्धता के उच्च गुणात्मक और संयोजन की भिन्नता का अंतर संख्या के आधार पर संबद्ध है. इसके अलावा, अच्छे उम्मीदवारों और वैध परिणाम केवल रास्ते में से एक सटीक भविष्यवाणी से आ सकता है. पीक एनोटेशन कई दृष्टिकोण के संयोजन के द्वारा आयोजित किया जाना चाहिए, उदाहरण साहित्य सर्वेक्षण, संदर्भ संयंत्र निकालने, एमएस n विश्लेषण, अंग विशिष्टता और उत्परिवर्ती 13 विश्लेषण के लिए.

1 "src =" files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg / "/>
आकृति 1. संयुक्त दृष्टिकोण के माध्यम से जीन एनोटेशन की प्रयोगात्मक प्रवाह का अवलोकन. कुछ मामलों में, परियोजनाओं के एक उपन्यास शिखर जो विशेष परिस्थितियों या ऊतकों में पाया जाता है, और अपनी चयापचय के भीतर अपनी भूमिका को समझने की इच्छा की खोज के साथ शुरू करते हैं. अन्य मामलों में परियोजना का उद्देश्य जीन या प्रतिलेखन कारक के रूप में महत्वपूर्ण नियामक कारकों की पहचान की खोज है. एक डेटा सेट है जो अपने लक्ष्य के मार्ग में metabolite का स्तर की स्पष्ट मतभेद हैं, विभिन्न अंगों से ऊतकों के नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर दिखाता है के साथ प्रयोग के डिजाइन के लिए planed जाना चाहिए, और विभिन्न बड़े पौधों या पौधों तनाव की स्थिति के लिए संपर्क के लिए, और सामग्री को subjecting metabolite है रूपरेखा. उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक पौधों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से QTL शरण प्रजनन सामग्री भी इन अध्ययनों के लिए उपयुक्त आनुवंशिक सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं. उपन्यास मार्ग की भविष्यवाणी सही के साथ सावधानी से किया जाना चाहिएशिखर और अंग प्रतिभूतियों जीन अभिव्यक्ति डेटा के लिए अपने मार्ग के हित के अनुसार तनाव प्रतिक्रियाओं के रूप में metabolotype के विभिन्न प्रकार के साथ संयोजन दृष्टिकोण एनोटेशन. अंतिम चरण में, metabolite, और प्रतिलिपि रूपरेखा प्रदर्शन किया जाना चाहिए जो कि अंत में, जब, सिलिको वेब - संसाधनों का विश्लेषण में और जीन अभिव्यक्ति के heterologous अभिव्यक्ति के माध्यम से इन विट्रो में लक्षण वर्णन के साथ संयुक्त जीन और अपने कार्य के उम्मीदवार व्याख्या की पुष्टि करने के लिए नेतृत्व और एक चयापचय मार्ग के भीतर स्थिति. लघुरूप: QTL, मात्रात्मक विशेषता loci.

चित्रा 2
चित्रा 2. शिखर एनोटेशन के लिए संयोजन दृष्टिकोण का प्रवाह काम शिखर पहचान और मानक परिसर से एनोटेशन, जंगली प्रकार की तुलना और बाहर म्यूटेंट दस्तक के लिए एक प्रक्रिया, बहु - आयामी लक्ष्य चोटी के मास स्पेक्ट्रोमेट्री शुद्ध कॉम के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के लिए बात12 डेटाबेस से पाउंड. लघुरूप: DB, डेटाबेस, को, तोड़े बाहर, 1-D, एक आयामी, 2 - डी, दो आयामी, एनएमआर, परमाणु चुंबकीय अनुनाद, IR, बुनियादी लाल, एमएस पता, जन जन spectrometries.

चित्रा 3
चित्रा 3. उदाहरण सह anthocyanin मार्ग के विनियमन नेटवर्क विश्लेषण Coexpression के विश्लेषण. (प्रधानमंत्री का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index साथ) डेटा ATTEDII संस्करण के सेट पर आधारित 8,2 3 pajek कार्यक्रम ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). सकारात्मक सहसंबंध (नि. 0.5 <) नेटवर्क कनेक्शन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. लाल नोड: बारह anthocyanin एंजाइमी (जीन At5g13930, CHS, TT4, chalcone synthase, At3g55120, सीहाय, TT5, chalcone isomerise, At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3 - hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoid 3'-hydroxylase At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid 3 - हे glucosyltransferase At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, डीएफआर, TT3, dihydroflavonol रिडक्टेस, एएनएस, At4g22880 / LDOX, TT18, anthocyanidin synthese; At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 हे glucosyltransferase है; At5g54060, A3G2 "XT, ख्यात 3 anthocyanin - 2 हे glucoside" हे - xylosyltransferase, At3g29590, A5GMaT, 5 anthocyanin - - glucoside 6'' 'हे malonyltransferase At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - 6 हे glucoside - - पी coumaroyltransferase) और anthocyanin उत्पादन के लिए दो प्रतिलेखन कारकों (At1g56650, PAP1, PAP2 At1g66390) उम्मीदवार जीन खोज के लिए इस्तेमाल किया गया था उम्मीदवार जीन सेट के प्रतिच्छेदन "द्वारा पाए गए आर के गुणांक के साथ एक मूल्य सीमा के साथ खोज <./ Em 0.50 सभी पूछे जीन (चौदह anthocyanin biosynthetic जीन) के द्वारा सेट के प्रतिच्छेदन द्वारा पूछे >>. एक सह अभिव्यक्ति सहसंबद्ध उम्मीदवार (68 जीन) जीन और पूछे जीन (14 जीनों) के नेटवर्क, सेट की एक दूसरे का संबंध "के द्वारा पुन: निर्माण r> 0.50 प्राइम डाटाबेस का उपयोग कर के साथ खोज. आउटपुट फाइल है कि प्राइम डेटाबेस और नेटवर्क से एक 'शुद्ध' फ़ाइल के साथ स्वरूपित किया गया Pajek सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तैयार किया गया. ब्लू नोड उम्मीदवार जीन जो से anthocyanin जीन के साथ सहसंबद्ध इंगित करता है.

प्रजातियों प्रमुख metabolite है माध्यमिक
Arabidopsis thaliana Glucosinolate, flavonol, anthocyanin, sinapoyl व्युत्पन्न
Populus trichocarpa Flavonol, anthocyanin, सैलिसिलेट व्युत्पन्न
द्राक्षा Flavonol, anthocyanin, टनीन, stilbene
रक्तवृतांक्त संबंधित chrologenate flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid,,
तमाखू Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, संबंधित chrologenate, acylsugar
धान्य Glycoflavone, anthocyanin, स्टेरोल डेरिवेटिव
ज़िया कर सकते हैं Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinone, स्टेरोल डेरिवेटिव
Medicago truncatula Isoflavone, anthocyanin, सैपोनिन
बिही कमल Isoflavone, flavonol, anthocyanin, सैपोनिन,

तालिका I. मॉडल संयंत्र प्रजातियों में प्रमुख माध्यमिक चयापचयों.

सह - अभिव्यक्ति डेटाबेस पता
संयंत्र पार कल्पनाएँ
COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V
ग्रह http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/
प्रजातियों के पौधे
ATEED-II http://atted.jp/
बार http://142.150.214.117/welcome.htm
COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop
GeneCAT http://genecat.mpg.de/
Arabidopsis
अधिनियम http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser
AthCoR@CSB.DB http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html
CressExpress http://cressexpress.org/~~V
प्रधान http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index
धान्य
RiceArrayNet http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V
चावल ऐरे डेटाबेस http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml

टेबल द्वितीय उपलब्ध जीन अभिव्यक्ति डेटाबेस लिए सिलिको विश्लेषण सह अभिव्यक्ति में.

Discussion

यह देखते हुए कि transcriptomics और metabolomics प्रौद्योगिकियों के कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया, जीन एनोटेशन metabolomics सहायता के लिए डेटा एकीकरण की प्रक्रिया आम तौर पर एक उपन्यास एक अज्ञात metabolite का प्रतिनिधित्व शिखर की पहचान के साथ शुरू होता है. इस तथ्य है जो metabolite का चोटियों में मात्रात्मक विचरण या उपन्यास उम्मीदवार जीन उनके biosynthesis के लिए जिम्मेदार होगा सोचा मूल्यांकन अगले चरण की ओर जाता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीति है, तथापि, तीन प्रमुख मैं समस्याओं) चोटी टिप्पणी की कठिनाई, द्वितीय) मार्ग भविष्यवाणी की जटिलता, iii) जीन और जीन अभिव्यक्ति डेटा की जानकारी की गुणवत्ता का संकल्प है. पहली समस्या का मुकाबला करने के लिए, शिखर एनोटेशन मानक यौगिकों या एमएस n विश्लेषण, संदर्भ निकालने, उत्परिवर्ती विश्लेषण, metabolite, डेटाबेस खोज और साहित्य सर्वेक्षण (चित्रा 2, 12) से मिश्रित दृष्टिकोण का उपयोग जानकारी के सह क्षालन के साथ बाहर किया जाना चाहिए. एस के लिएecond समस्या, मार्ग भविष्यवाणी ही सही शिखर एनोटेशन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, ऊतक विशिष्टता के metabolite का रूपरेखा भी समर्थन शिखर एनोटेशन, क्योंकि metabolite का संचय संबंधित जीन जीन अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध किया जाना चाहिए कर सकते हैं. इसलिए विभिन्न ऊतकों और विकास की स्थिति के संयोजन प्रोफाइल यह दूसरी समस्या के लिए उपयोगी हो सकता है. तीसरे जीन जानकारी के संकल्प के विषय में समस्या अनुक्रम डेटा की प्रगति पर निर्भर करता है. जीनोम अनुक्रम के पूरा होने के बिना मॉडल संयंत्र के मामले में सह अभिव्यक्ति अन्य मॉडल पौधों में orthologous जीन विश्लेषण का उपयोग उपयोगी है. विस्तृत संरेखण और अमीनो एसिड अनुक्रम की तुलना वंशावली पेड़ विश्लेषण के लिए अन्य प्रजातियों के लिए मॉडल जीवों को जोड़ने का समर्थन कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल सभी metabolisms के लिए उपयुक्त है. यह जो अच्छी तरह से मजबूत transcriptional ग के अधीन होने की विशेषता है मध्यवर्ती और माध्यमिक metabolisms का विश्लेषण में सबसे अधिक कुशल है1,5,11,16 ontrol. कुछ उदाहरणों, सह अभिव्यक्ति का विश्लेषण के सल्फर आत्मसात में प्रदर्शन किया जा सफल, β ऑक्सीकरण, branched श्रृंखला एमिनो एसिड गिरावट, क्लोरोफिल टूटने, और lysine 3 अपचय के लिए जीन, कोशिका दीवार चयापचय 10,7 और 14 झरना संकेत प्रकाश. संयुक्त जीनोमिक्स, metabolomics और सूचना के माध्यम से जीन समारोह की व्याख्या न केवल biosynthetic और प्रतिलेखन कारक के प्रत्यक्ष नियामक जीन के लिए, लेकिन यह भी शारीरिक प्रक्रिया और प्रतिक्रिया को समझने के लिए है (उदाहरण के लिए चित्रा 3 14. देखें).

मॉडल पौधों से फसल प्रजातियों के लिए इस दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए, संयंत्र प्रजातियों भर के चयापचय तुलना कुछ सामान्य metabolisms में शक्तिशाली दृष्टिकोण है. उदाहरण के लिए, अगर एक ही परिसर में विभिन्न प्रजातियों के पौधे में पाया जाता है, और कुछ orthologous जीन इन प्रजातियों के पौधे में पाए जाते हैं, पार प्रजातियों सह अभिव्यक्ति के orthologous जीन विश्लेषण का उपयोग stron प्रदान कर सकते हैंअपनी भविष्यवाणी के लिए जी का समर्थन करते हैं. इस दृष्टिकोण Arabidopsis में प्रदर्शन किया जा सकता है, इसके अलावा में चिनार, Medicago, जौ, चावल, गेहूं, और संयंत्र प्रजातियों में से सह अभिव्यक्ति विश्लेषण (6, ग्रह द्वारा सोयाबीन, जैसे महत्वपूर्ण फसलें हैं: http://aranet.mpimp-golm.mpg , डी. , / 9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ , एक 15, उदाहरण देखें).

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम आरआईकेईएन पीएससी और डॉ. Bjoern Usadel के में उपयोगी विचार - विमर्श के लिए MPIMP में प्रो Kazuki Saito धन्यवाद. टीटी अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट नींव से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water ULC/MS grad BIOSOLVE 23214102
Acetonitrile (ACN) ULC/MS grade BIOSOLVE 01204102
Methanol (MeOH) ULC/MS grade BIOSOLVE 13684102
Formic acid (HCOOH) ULC/MS grade for liquid chromatography BIOSOLVE 06914131
Standard compounds EXTRASYNTHESE
Linear ion trap (IT) ESI-MS system FINNIGAN-LTQ Thermo Fisher Scientific, Inc.
HPLC system Surveyor Thermo Fisher Scientific, Inc.
Analytical column Luna C18(2), 2.0 mm diameter, 150 mm length, 100 Å pore size and spherical particles of 3 mm Phenomenex 00F-4251-B0
Xcalibur software Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays. Plant Cell. 12, 647-661 (2000).
  2. Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics. In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).
  3. Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria. Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).
  4. De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat. Protoc. 2, (2007).
  5. Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).
  6. Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species. Plant Cell. 23, 895-910 (2011).
  7. Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis. Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).
  8. Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).
  9. Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants. Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).
  10. Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).
  11. Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes. Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).
  12. Tohge, T., Fernie, A. R. Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide. Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).
  13. Tohge, T., Fernie, A. R. Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function. Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).
  14. Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation. Plant Signal Behav. 6, Forthcoming (2011).
  15. Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole. Plant Physiol. (2011).
  16. Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).

Comments

1 Comment

  1. First of all, thank you for your scientific share in joVE. It consists profitable informations for me and other young scientists. I want to ask a question about your video. I couldn't find the extraction buffer in your experiment. If it is possible, can you say me which components did you use in your extraction buffer.
    Yours sincerely,
    Fahriye

    Reply
    Posted by: Fahriye î
    November 21, 2013 - 5:49 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics