조직 문화에 대한 손상 소의 꼬리 척추 디스크의 준비

Bioengineering

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Summary

이 프로토콜은을 위해 장기 문화에 대한 coccygeal 소 척추​​ 디스크 수확 기술을 보여줍니다

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Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490, doi:10.3791/3490 (2012).

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Abstract

척추 디스크 (IVD)는 척추에 척추를 연결하는 척추 관절입니다. 그것은 척추의로드를 전송하고 척추에 유연성을주는 기능을 수행합니다. 그것은 세 가지 구획의 작성할 : 환대 fibrosus (AF), 그리고 양쪽의 척추 기관에 NP와 AF를 연결하는 두 연골 endplates에 의해 포함한 내면 핵의 pulposus (NP)를. 아마도 퇴행성 척추 디스크 질환 (DDD)와 디스크 herniations에 의한 Discogenic 고통은 우리의 현대 사회의 주요 문제로 확인되었습니다. IVD 변성 가능한 메커니즘을 연구하기 위해, 라이브 디스크 세포로 체외 장기 문화 시스템에서 매우 매력적입니다. 그대로 소 coccygeal IVDs의 체외 문화가 잘 제어 생리학 및 기계적 환경에서 메카 - 생물 학적 측면의 연구를 수있는 관련 모델 시스템으로 고급하고 있습니다. 소의 꼬리 IVDs가 높은 숫자를 비교적 쉽게 구할 수 있습니다D 세포 밀도, 세포 인구 및 크기와 관련하여 인간의 허리 IVDs 매우 유사합니다. 영양 경로가 명백하게 응고된 피가에 의해 차단된 이후 단, 연골이 endplates 및 뼈다귀 endplates을 유지 이전 소 꼬리 IVD 수확 기술 문화 1-2 일 후에 실패했습니다. IVDs 가장 큰 avascular 장기 있으며, 따라서 NP에있는 세포에 영양분은 인접 척추 신체에서 모세관 꽃봉오리를 통해 확산에 전적으로 의존하고 있습니다. endplate 표면에 뼈 파편과 응고된 피가의 존재는 디스크와 손상 세포 생존의 중심에 영양 보급을 저해 수 있습니다. 우리 그룹은 오염에 대한 낮은 위험 아웃 꼬리에서 IVDs을 "균열"에 비교적 빠른 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 혈전 및 절단 부스러기를 제거하고 매우 효율적으로 영양 보급 경로를 다시 태어난다 수술 제트 세척 시스템을 사용하여 갓 컷 뼈다귀 endplate 표면을 permeabilize 수 있습니다IVD의 중심 있습니다. 척추 뼈 양쪽에 성장 플레이트의 존재는 피할 수 있으며, 문화 이전에 제거할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 준비 중에 중요한 단계를 설명합니다 무료 붓기 문화에 따라 14 일 동안 높은 세포 생존을 유지하는 성공적인 장기 문화의 열쇠를 보여줍니다. 문화 시간은 적절한 기계적 환경 기계 로딩 생물 반응기를 사용하여 유지 수있을 때 확장할 수 있습니다. 기술 여기서 보여주는 등 돼지의, 양의와 토끼 꼬리와 허리 IVD 격리와 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다.

Protocol

1. 척추 디스크 착취

  1. 피부의 존재가 오염의 가능성 (그림 2) 증가 이후 전체 길이 소 꼬리는 피부없이 가능한 경우, 로컬 도살장에서 얻은 것입니다.
  2. 대형 절단 보드를 준비하고 도마 (그림 2)의 상단에 살균 작업 스테이션과 악기를 준비합니다.
  3. 멸균 층류 후드 멸균 거즈 아래의 준비는 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened과 6 잘 플레이트의 각 우물에 넣어.
  4. 분지를 준비하고 수돗물로 1:100 Betadine 솔루션을 희석.
  5. 5 분 1 % Betadine 솔루션을 포함 분지 전체 소 꼬리 젖어.
  6. 간단히 건조 멸균 거즈와 꼬리 및 살균 작업 스테이션에 배치하십시오.
  7. 조심스럽게 메스 블레이드 # 22 꼬리 주위 근육을 제거합니다.
  8. 필요하지 않다 꼬리 부분, 비교적 크고 아주 작은 포함된 꼬리 일반적으로 양쪽을 잘라 거리IVDs (그림 3).
  9. 메스 블레이드 # 10을 사용하여 IVD 주위 더욱 근육과 힘줄을 낸다. 디스크의 바깥 고리를 잘라하지 조심.
  10. 외과 피부 마커와 IVD의 앞쪽에 표시 (이 단계는 선택 사항입니다, 우리의 생물 반응기의 축 회전의 중심을 결정하는 데 도움).
  11. 부드럽게 꼬리를 이동하여 IVD와 척추의 연결 지점을 찾습니다. 메스 블레이드의 지루한 면을 IVD와 뼈 사이의 국경을 느낍니다. cleaving 사이트는 척추쪽으로 IVD의 거리 1-2mm해야합니다. 장소 지정이 cleaving 사이트 (그림 4)에서 산업 블레이드 홀더했다.
  12. 사용자 정의 - 만든 산업 블레이드 홀더 (그림 3)의 위에 망치질로 다니엘 IVD 및 척추골.
  13. IVD - 척추골 연결의 반대편에 반복합니다.
  14. 랩은 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened 멸균 거즈로 IVD 격리.
  15. 원하는 샘플 숫자 (보통 6 주변 수있는 IVDs의 절연을 계속) 10-20mm 사이의 직경이 수확됩니다.
  16. 멸균 Lactated 울리는의 솔루션으로 제트 세척 시스템 (짐머, INC.) 연결, 5L 가방 (또는 멸균 PBS 또는 0.9 % 생리 식염수) 유용한 사이즈입니다.
  17. 짐머 Pulsavac 제트 세척 시스템 (그림 1C)을 사용 포셉 및 endplate 표면의 제트 세척 양측으로 IVD 잡아. 제트 총 30 사이의 각도로 endplate 표면에 주사한다 - 60 °의 각 면에 약 30 초. (Figs. 1, 7)
  18. 제트기가 다른 디스크 샘플을 세척하는 동안 6 잘 플레이트와 포장에 다시 IVDs 올려 것은 거즈를 moistened.
  19. IVDs는 장기 문화와 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 세포 생존 능력, 기계 로딩, 장기 문화) (그림의 1D)에 대한 준비가되어 있습니다.

2. 대표 결과

성공적인 척추 디스크 준비를 판단하는 성과 측정 확산 실험을 할 수있는 작은 분자량 형광 염료 (예 : procion 빨간색)PBS 2 1 %의 솔루션으로 준비가되어 있습니다. IVD 그러면 최소한 100 염료 솔루션의 ML과 염료가 다음 자유 팽창에 따라 24 시간을위한 IVD에 수동적으로 확산하기 위해 허용과 함께 보관됩니다. IVD 다음 액체 질소 플래시 - 냉동 및 객실 온도와 아세톤 전송 시리즈 (첫번째 -80에 ° 다음 C, -20 ° C, 후 4 ° C 마침내 실온에 미리 냉각에 의한 탈수로 다시 데려 ). 디스크 다음 폴리 - 메틸 아크릴 레이트 (PMMA)에 포함된 및 100 μm의 두께 섹션을 생산하기 위해 날카로운 칼날로자를 수 있습니다. 이 섹션은 다음 표준 brightfield 현미경으로하지만, 우선적으로 procion 빨간색은 빨간색 형광 (Figs. 5-6)를 방출 이후 형광 현미경의 사용으로 볼 수 있습니다. 뼈다귀 표면 trabeculi은 제트 lavaging 단계 (그림 7) 후 매우 깨끗하게 나타납니다.

성공적인 장기 문화에 대한 매개 변수 오염, 유지 세포 생존의 모든 부재 (Figs. 8-9), 디스크 높이의 첫 번째이며,histological 섹션 및 safranin O / 빠른 그린 얼룩이나 마이어의 Hematoxilin 3 측정 전체 "디스크 무결성". 우리는 살아 디스크 조직을 얼룩과 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 및 라이브 / 죽은 얼룩 키트 (분자 프로브, Invitrogen, 바젤, 스위스)를 사용하여 3D에서 세포 생존 능력을 검사하는 다른 4,5 출판 프로토콜 및 매크로를 개발했습니다. 우리는 더 이상 3D 조직이나 NIH ImageJ 플랫폼 4-6을 사용하여 3D 통신사 셀 가능성을 추정 계산 자동 세포를 수행하기 위해 매크로와 루틴을 개발했습니다. 대체 프로토콜 pronase 및 collagenase 형식을 사용하여 세포외 기질의 연속 소화를 사용하여 초기 소화하여 디스크 세포의 세포 생존을 결정하는 2 다음 세포 현탁액 7 얼룩이 제안되었습니다. 프로토콜의 이전 버전은 PBS 전에 디스크의 수확 기관 세제곱 후 10 분에 대한 열 배는 더 집중 페니실린 / 스트렙토 마이신 농도를 포함에 인큐베이션 단계를 참여lture. 이 단계 culturing을 위해 도움이 것 때문에 제트 세척 단계이 단계는 쓸모됩니다.

그림 1
그림 1. 방법론 단계의 개요 그대로 endplates와 뼈의 얇은 레이어 (1-2밀리미터)와 소 coccygeal 척추 디스크를 준비합니다. 척추 디스크 (IVD) 및 영양 경로의) 도식보기. B) 절차 블레이드 - 홀더 정의와 산업 날카로운 칼날로 IVD을 했구요. C) 제트 세척 단계 높은 세포 생존을 보장하고 endplates와 양쪽에 부착 뼈 1-2하셔야 지키는 영양 교환을 활성화합니다. D) 마지막 IVD은 생물 반응기의 표본 챔버에서 교양 수 있습니다 또는 다운 스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

그림 2
그림 2 TOP :. 전체 길이 신선한 소 꼬리 (이상 obta높은 세포 생존을 보장하기 위해 사후 2-3시간 이내 ined. 하단 : 뼈다귀 endplates (EP)과 척추 단체 (VB) 사이의 성장 플레이트 (GP), 골화의 보조 중심의 존재를 보여주는 육개월 주변의 세 소 꼬리 X - 선 이미지.

그림 3
그림 3.) 도구 무균 조건 하에서 소 꼬리를 해부하다 있습니다. B) 맞춤형 블레이드 - 홀더에 척추 디스크를 깎다가 행동에 소 꼬리에서 운동의 세그먼트 아웃 컷. 표준 산업 블레이드 (Lutz, 독일)와 블레이드 홀더 - 사용자 정의의 C) 측면 - 볼 수 있습니다.

그림 4
그림 4. 그리기와 운동의 세그먼트를 잘라 cleaving 사이트를 설명하는 주변 근육과 인대를 제거 후 소 꼬리 그림. 부분 척추골은 WI를 "금이"이어야합니다사용자 정의 만든 블레이드 홀더 회 이상 1~2mm 떨어진 연골 endplates에서 전체 뼈 표면을 보장합니다.

그림 5
그림 5. 전에 제트 세척 단계의 효과적인 세척의 데모 (A)과 후 (B). 분사 절차 후 척추 디스크 세그먼트의 깨끗한 뼈다귀 표면을 확인할 수 있습니다.

그림 6
그림 6. 성장 판으로 차단 효과를 보여주는 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 확산 실험. 의 디지털 X - 레이 화살보기 2 후에도 연골과 뼈가 endplate와 coccygeal 소 척추​​ 디스크 explant 통해 성장 판과 화살 컷의 뼈 형광 현미경 이미지의 두 번째 레이어를 포함한 IVD4h 무료로 확산. GP : 성장 플레이트, 2ndry CO : 골화 중심의 보조.

그림 7
그림 7. 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 실험, 제트 세척 치료의 효과를 보여주는 청소. 치료 (오른쪽) 제트 lavaged 치료하지 않고 제트 세척 치료 (왼쪽) 제어 측면을 받았습니다 ~ 1.5 mmthick 뼈다귀 엔드 플레이트와 excised 소 IVDs의 화살 굵은 부분 (~ 100mm). 입구는 스프레이 짐머 상처 debridement 시스템에서 사용되던 패턴 1 % procion의 빨간색으로 소 척추​​ 디스크 explants의 24 시간 무료로 확산 실험.을 보여줍니다

그림 8
그림 8. 공촛점 이미징 스택의 예측의 라이브 / 죽은 이미지 (250μm) bovin에서 촬영한E 척추 디스크 세그먼트는 핵 pulposus (NP), 내부 고리를 fibrosus (IA)과 바깥 고리 fibrosus (OA)에 각각 0, 14 일 무료 팽창에 따라 보관이 제트 세척 방법으로 준비했습니다. ethidium homodimer - 1에 의해 스테인드 calcein AM (아세틸 methylester)에 의해 스테인드 = 라이브 세포, 붉은 세포가 = 죽은 세포의 핵 그린 세포.

그림 9
그림 9. 살아있는 조직을 3 차원 스택 검사에 대한 현미경을 검색 공촛점 레이저를 사용하여 척추 디스크의 세포 생존 능력. 자유 팽창 상태에서 21 일 문화를 통해 본질 Pulposus (NP)와 고리 섬유증 (AF)의 세포 생존 능력. (± SEM, N = 6 평균) 통계 차이가 아닌 파라메 트릭 Kruskal - 월리스는 그룹 간의 순위 합 테스트를 체결 사용하는 테스트되었습니다. 중요한 차이점은 21 일 NP 다른 모든 시간 지점 사이에 발견되었다. AF 중요한 차이점에 일 7 일 사이 찾을 수있는 동안일 0. (* P <0.05, ** P <0.01).

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Discussion

성공적인 장기 문화에 대한 첫 번째 단계는 explant가 오염해서는 안됩니다 있는지 확인하는 것입니다. 당신이 절차를 시작하기 전에 꼬리는 피부해야합니다. 무균 실험실로 데려 모든 동물의 머리는 오염의 측면에서 문제가 될 수 있습니다. 소 꼬리가 이상 (이것은 초기 세포 생존에 영향을 미치는) 가능한 신선해야합니다. 또한 betadine의 세척 단계는 더욱 오염의 위험을 줄이기 위해 권장합니다. 대신 척추 본체에서 IVD를 구분하기 위해 사용자 정의 - 만든 블레이드 홀더와 망치를 사용하는, 이것은 histological bandsaw을 (깎다 다이아몬드 블레이드가 PBS 또는 울리는 솔루션으로 냉각한다)를 사용하여 수행할 수 있습니다. bandsaw, 샘플 홀더 및 절단 칼날은 멸균되어야한다는주의. 기술 여기서 보여주는 소 꼬리 IVD 고립에 국한되지지만 같은 돼지의, 양의와 토끼 꼬리 또는 요추 IVD 절연과 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다. IVD H에 대한척추 프로세스가 존재하는 지역의 arvest, 먼저 모든 프로세스를 제거하는 것이 중요합니다.

그림 9에서 주어진 세포 생존 데이터는 최대 21일하는 자유 팽창에 따라 수집되었으며 참조로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 자유 팽창에 따라 14 일 동안 세포 생존 능력을 유지합니다. 21일에서 세포 생존 능력의 드롭은 endplates 통해 영양 보급을 지원한 중요하고 디스크 세포 생존 세를 유지하기 위해 표시되었습니다 기계적 하중의 부족으로 인해 수 있습니다. 이것은 세포의 생존은 정압 압축 및 / 또는 추가 낮의로드 8-10에 따라 더 높은 것으로 매우 가능성 것입니다.

다른 프로토콜로, 소 디스크는 치과 버를 사용하고 연골 endplates 11 출발하여 척추의 뼈 근처를 모두 제거하여 준비하실 수 있습니다. IVD 세포 생존 능력이 방법을 사용하여 사주를 통해 유지되었다.디스크를 "잡아"에 사용할 수있는 딱딱한 뼈가 없기 때문에 그러나,이 경우에는 비틀림이 운동의 세그먼트에 대한 직접적인 방법으로 적용할 수 없습니다. 오목은 양쪽에 평행 표면 대신 endplates하면 로딩 프로필 차이 11 계정에 대해 어떠한 생물 반응기 설계에서 표본 챔버의 조정이 필요합니다. 또한, 뼈다귀 endplates 전체 분자의 확산의 평가는 이러한 explants의 가능성도 없습니다.

우리 연구의 의의

  • 컷 아웃로의 사용은 단일 사용 산업 블레이드 장기 문화 그대로 척추 디스크 세그먼트 상당히 보았다 histological 밴드와 가공 단계와 관련된 프로토콜에 비해 수확 프로토콜을 단축. 그것이 다이아몬드 연삭 운동의 경우와 같이 또한 뼈의 trabecular 구조가 영향을받지 것은 블레이드 보았다.
  • 뼈다귀 표면의 제트 lavaging은 매우 효율적이고시 응고 - 혈액 아웃 씻는다gnificantly 치료 척추 디스크에 비해 시간이 지남에 따라 핵 pulposus (디스크의 중심)의 세포 생존 능력이 향상됩니다.

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Disclosures

우리는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단 (SNF # 310030-127586/1)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin).
Pulsavac Plus AC System Zimmer inc., Switzerland 00-5150-486-01 Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient)
High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length Zimmer inc., Switzerland 00-5150-175-00 There are several spray heads available, we tested this one successfully
Scalpel blades #22 and #10 Swann-Morton #10: 0201 #22: 0208
Scalpel blade holder # 3 and #4 Hausmann, Germany #3: 06.103.00 #4: 06.104.00
Lutz industrial blade Lutz, Germany 1022.0884
Phosphate buffered Saline (PBS) Invitrogen 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO, by Life Technologies 11960-044
Lactated Ringer’s solution (without glucose) Bichsel, Switzerland 133 0002
6-well multi-well plate Techno Plastic Products 92006
Betadine solution Mundipharma, Switzerland 10055025
Surgical skin marker Porex Surgical, Switzerland 9560
Large cutting board Any brand is possible

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References

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