의 샘플 준비

Immunology and Infection

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의 metabolomic 프로필

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Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

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Abstract

Mycobacterium 결핵은 세계적 규모의 인간의 사망의 주요 원인입니다. 모두 다 (MDR)과 광범위하게 - (XDR) 약제 내성의 변종의 출현은 현재 질병 관리 노력을 탈선 위협하고 있습니다. 따라서, 현재보다 더 효과적인 의약품 및 백신을 개발하기 위해 긴급한 필요가있다. M.의 게놈 결핵은 10 년 이상 알려져 아직 유전자 기능과 본성에 대한 지식의 중요한 차이가 있습니다되었습니다. 많은 연구가 이후 유전자 발현의 글로벌 패턴에 마약, oxidants, 그리고 성장 조건의 효과를 결정하기 위해 transcriptomic 및 proteomic 수준 모두에서 유전자 발현 분석을 사용했습니다. 궁극적으로, 이러한 변경 사항의 최종 응답은 몇 천 작은 분자량의 화학 물질을 포함하여 세균의 대사 구성에 반영됩니다. 치료 또는 TR하거나, 야생 유형 및 돌연변이 변종의 대사 프로파일을 비교특정 약물과 함께 eated 효과적으로 목표 식별을 허용 할 수 및 안티 결절 활동으로 소설 억제제의 발전으로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, metabolome에 두 개 이상의 조건​​의 영향도 평가 할 수 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR)은 신진 대사 중간체를 식별하고 정량화하는 데 사용됩니다 강력한 기술입니다. M.의 준비를 위해이 프로토콜의, 절차 NMR metabolomic 분석을위한 결핵 세포 추출물이 설명되어 있습니다. metabolites의 보존을 최대화하기 위해 차가운 온도를 유지하면서 세포 문화는 적절한 조건 및 필요한 바이오 레벨 3 억제, 1 수확에서 성장하고, 기계 용해를 받게됩니다. 세포 lysates가 회복되며, 소독, 그리고 매우 낮은 온도에서 저장 필터링. 이러한 세포 추출물에서 Aliquots이 가능한 세포의 부재를 확인하기 위해 집락 형성 단위 미들 7H9 한천에 도금되어 있습니다. 37 번 부화 두 달 ° C, 경우에 따라 더 바이올라 없습니다수 식민지가 관찰되며, 샘플은 하류 처리를위한 밀폐 시설에서 제거됩니다. 추출물은 동결 건조 된 진정제를 맞았을 버퍼에 resuspended하고 통계 분석의 대상이되어 spectroscopic 데이터를 캡처, NMR 장비에 주입되어 있습니다. 설명되어있는 절차는 (1D) 한 차원 1 H NMR 및 2 차원 (2D) 1 H-13 C NMR 분석 모두에 적용 할 수 있습니다. 이 방법론은 크로마토 그래피 방법보다 더 신뢰할 수있는 작은 분자량 대사 식별 및 세포 추출물 신진 대사 작품보다 안정적이고 민감한 양적 분석을 제공합니다. 절차의 변화가 세포 용해 단계에 따라 설명이 병렬 proteomic 분석을 위해 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. 프로토콜 텍스트

이 프로토콜은 M.에 NMR 방법론의 적응을 강조 결핵 (클래스 III 에이전트). M.을 실시 할 때 따라서 바이오 레벨 3 (BSL3) 관행 준수해야 매년 인증 실험실에서 결핵 연구. 실험실에서 생성 된 에어로졸에 노출이 미생물과 협력 요원에 의해 발생하는 가장 중요한 위험합니다. 다음 절차는 우리 기관에서 실시하고 있습니다 및 변형은 기관 바이오위원회의 권고에 따라있을 수 있습니다. 일반 직원은 보호 장비는 Tyvek 옷, bouffant 모자, 덧신, N95의 인공 호흡기, 눈 보호, 소매 및 니트릴 장갑의 두 쌍 구성됩니다. M. 관련된 작업 오픈 M.과 결핵 문화 및 / 또는 조작 결핵 용기는 타입 A2 또는 B2 생물학적 안전 캐비닛에 수행됩니다. 플라스틱으로 덮인 흡수 종이는 w에 위치표면을 orking. 폐기 또는 시설에서 제거 할 모든 자료 / 소모품은 두 개의 생물학적 가방에 배치하고 autoclaving하여 소독해야합니다. 작업 표면과 캐비닛 (FastPrep-24 용해 균질, 분광 광도계, 얼음 양동이 등)에서 활용 장비는 1 % Amphyl (tuberculocidal, bactericidal 살균제의, 그리고 virucidal 대리인) 각 작업 세션 후 소독을해야합니다. M.는 결핵 문화가 같은 냉동고, 인큐베이터, 원심 분리기, 그리고 냉장고와 같은 생물학적 안전 캐비닛의 외부에 위치한 큰 장비 운송을 위해 이중 억제 아래에 위치해야합니다. 원심 분리는 동봉 된 안전 컵 및 O-링 나사 톱 튜브 진행됩니다. BSL3 실험실 이외의 추가적인 분석을 위해, 세포가없는 추출물은 15 분 동안 95 ° C에서 살해 0.2 μm 필터 나 미생물 열을 통해 필터링됩니다.이 샘플은 사전 봉쇄로부터 제거에 집락 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 도금입니다.

  1. 110 폴리 솔 베이트 80 (십대 초반 80 거리며 걷게을 방지하기 위해)를 포함하는 미들 7H9 전체 미디어 ML 국물 (MADC-TW) 또는 250 ML Erlenmeyer 플라스크에 적합한 매체입니다.을 전송 C-metabolites 13를 사용할 때 세중의 문화는 정기적으로 상태에 따라 재배, 10 동일한 문화는 1D H NMR 프로파일에 대한 성장하고 있습니다. 두 조건 (예를 들어, 약물의 추가로 및 제외) 복제 당 문화의 두 볼륨이 성장하고 두 개의 동일한 문화로 분할 할 수 있습니다하십시오. 모든 시약 및 솔루션 조리법은 프로토콜의 끝 부분에 제공됩니다.
  2. M.의 0.150 ML로 국물을 예방 결핵 50 % 글리세롤 주식 (얼음 해동 할 수 있습니다.) 아래 참고 1을 참조하십시오.
  3. 문화가 37 성장하자 ° C 약 6 일 (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm으로 흔들어. 아래의 2 내용을 참조하시기 바랍니다.
  4. 더 항생제 대체 추가 또는 다른 치료가 필요 없으면, 문화는 수확 할 준비가 된 것입니다. 트리트먼트를 사용하는 경우, 계속바로 5 단계입니다. 오염 검사, phenotypic 분석, PCR 검사 : 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다. 아래 3 참고를 참조하십시오. 이 시점에서 6 단계로 진행합니다.
  5. 셰이커에서 플라스크를 제거하고 원하는 치료 (예, 약물이나 신진 대사를 추가)을 수행합니다. 장소는 추가 기간 (예를 들어, 6-18 시간)에 대한 흔드는 및 배양에 다시 플라스크. 이 시간의 끝에서 또 다른 1.0 ML의 나누어지는을 가지고 OD 600 결정합니다. 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다.
  6. 5 분을위한 얼음에 장소는 문화. 이 단계 후에는 전체 나머지 프로토콜에 걸쳐 얼음에 세포를 두십시오. 수확 2,000 XG와 4에서 원심 분리하여 문화 ° C benchtop의 원심 분리기를 사용하여 50 ML 튜브에 15 분을위한. 각 문화는 25 ML 각 (1 총없이 네 튜브가 필요합니다00 ML은 2D 1 충분한 신호 대 노이즈를 얻기 위해 필요합니다 H-13 C 문화 당 50 ML은 1D H NMR 실험에 필요한 NMR 실험).
  7. 위에서 설명한 원심 분리 매개 변수에 의해 얼음처럼 차가운 ddH 2 O (약 15 ML 처음으로 10 ML 두 번째)와 각 셀 펠렛 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척의 경우 회전하기 전에 같은 튜브에 10 ML의 aliquots 조화를 이루고 있습니다. 1.0 ML ddH 2 O (세포 펠렛 볼륨을 조정해야합니다)의 최종 볼륨에서 세포 펠렛을 Resuspend. 거리며 걷게 무료로 하나의 세포 현탁액이 단계에서 원하는 경우, 전지가 잠시 sonicated 및 / 또는 27 게이지 바늘을 통해 세 번 통과 할 수 있습니다. 또한, 세포 펠렛은 -80 ° C에서 냉동 및 추가 처리까지 저장할 수 있습니다. 후자의 경우, 냉동 펠릿은 resuspension하기 전에 얼음에 해동됩니다. 위의 언급 1.0 ML ddH 2 O의 최종 볼륨에서 셀 알약을 Resuspend.
  8. TransfeLysing 매트릭스 B를 (0.1 mm의 실리카 분야) 포함 2.0 ML 스크류 캡 튜브에 R 1.0 ML 세포 현탁액. 바이오 캐비닛 내부의 FastPrep-24 용해 균질를 놓습니다. 유지는 튜브의 상단에 판을 말씀 확보, 샘플 홀더에 샘플을 놔. 6m / 초의 속도 설정에서 균질에서 60 초에 샘플을 처리합니다.
  9. 15,000 XG과 4에서 microcentrifuge에서 샘플을 돌려 ° C 펠렛 세포 파편과 그대로 셀에 10 분을위한.
  10. 멸균 튜브에 주사기 필터 (0.2 μm)를 통해 표면에 뜨는 및 패스 샘플을 제거합니다. MADC 한천의 샘플 플레이트 0.1 ML (또는 10% 예를 들어 같은 샘플의 대표 분율은) 더 실용적 세포가 있는지 확인합니다. 조사는 또한 하나 이상의 여과 단계를 수행 및 / 또는 잠재적 인 바이오 안전성 문제를 방지하거나 식별 할 수 있도록 실시간 죽은 착색 절차를 사용하여 추출물에서 가능한 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 저장하는 에탄올 드라이 아이스 욕조에서 샘플을 고정-80 ° C에서 사람들이 NMR 시설에서 동결 건조하여 처리 할 준비가 될 때까지.
  11. 2개월 후, 식민지 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 번호판을 확인합니다. 더 CFU의이 발견되면, 샘플은 BSL3 실험실에서 촬영 될 수 있습니다. 또한 분석은 일반적으로 다중 사용자를 제공하며, 특별한 억제 요구 사항에 따라 작동하는 표준 NMR 시설에서 수행됩니다.
  12. 건조에 샘플을 Lyophilize 다음 NMR 버퍼와 microcentrifuge 튜브에 전송 0.7 ML에 resuspend. 13,000 X g에서 3 분을위한 원심 분리기. 0.6 ML와 5 밀리미터 NMR 튜브에 전송을 제거합니다. 또는 동결 건조 된 샘플은 비 biohazardous 정기적으로 샘플 같은 외부 시설에 우편으로 발송 될 수 있습니다.
  13. NMR 데이터가 즉시 수집됩니다. 모든 예방 조치에도 불구하고, 활성 효소는 여전히 존재할 수 있으며 샘플은 오랜 기간 동안 일반적으로 안정되지 않습니다. 샘플 m에 대한 ° C 실온에서 또는 4에서 탈락 할 때 NMR 스펙트럼의 변화는 눈에 띄는 아르일주보다 광석. 또한, NMR 데이터 수집이 샘플을 무작위로 각 카테고리에서 선택 치료 및 약물 치료를 문화, 가끔 있습니다. NMR의 스펙트럼가 수집되기 전에 특정 범주가 더 이상 지연을 가지고 있기 때문에 불필요한 편견을 방지 할 수 있습니다. 모든 치료 샘플 NMR의 스펙트럼은 약물 치료를 샘플에서 첫번째 수집하고 원인이 된 경우 데이터에 편견이 발생합니다. 샘플은 즉시 NMR에 의해 분석 할 수없는 경우, 샘플은 -80 ° C.에서 1 ML Eppendorf 튜브에 보관해야합니다
  14. 이러한 잠금, 심, 조정하고, 90 ° 펄스 길이의 최적화와 같은 몇 가지 일상적인 단계를 포함 후퇴-120 샘플 체인저, 악기 보정,에 샘플을 삽입 한 후 검색 결과의 품질을 최대화하기 위해 필요합니다. 하나의 샘플은 90 ° 펄스 길이를 보정하고 나머지 샘플 악기를 조정하는 데 사용됩니다. , 잠금 shimming, 모든 샘플에 대한 NMR 데이터 수집이 자동으로 쓰겠다고합니다g ICONNMR 및 gradshim.
  15. 1D 1 H NMR 스펙트럼은 여기 조각을 사용하여 물 억제와 함께 Bruker zgesgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 32K 데이터 5482.5Hz의 스윕 폭 포인트 128 스캔,​​ 16 더미 스캔의 총 사용됩니다. 2D 한 H-13 C HSQC 스펙트럼은 Bruker hsqcetgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 5000.0 Hz의 스윕 폭 2,048 데이터 포인트의 총 직접 H 치수 함께 수집하고, 간접 13 C 치수를 따라 18864.9 Hz의 스윕 폭 64 데이터 포인트입니다. 스펙트럼은 소음에 좋은 신호를 얻기 위해 128 스캔 및 16 더미 스캔으로 수집됩니다.

그림 1
그림 1. 실험 절차의 흐름 다이어그램이 그려져 있습니다.

NMR 버퍼

50 MM 칼륨 인산 버프의 주식 솔루션50 μM의 TMSP과 어 :

  • 2.17 g K 2 HPO 4 (인산 칼륨 이염 기성)
  • 1.70 g KH 2 PO 4 (인산 칼륨 일 염기의)
  • 7.86 MG 나트륨-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98 %))
  • "100 %"D 2 O 500 ML에 디졸브
  • 최종 솔루션은 산도 7.2 (교정)에 있어야합니다

MADC-TW 또는 MOADC-TW (1 L)

  • 4.7 g 미들 7H9 국물베이스
  • 900 ML ddH 2 O
  • 두 ML의 글리세롤
  • 25 분의 구성 요소와 압력솥을 섞는다. 다음 솔루션을 터치하고 추가 할 수 차가운 액체
  • 100 ML ADC MOADC를 준비 할 때 MADC 또는 100 ML의 OADC를 준비 할 때
  • 2.5 ML 20% 십대 초반 80 (또는 비 metabolizable 20 % Tyloxapol 1 ML)
  • 10 ML 1 % cycloheximide

ADC (1 L)

  • 20g D (+) - 포도당
  • 50g BSA 비율V
  • 8.5 g NaCl
  • 800 ML ddH 2 O
  • 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장

또한, OADC (1L)를 준비하는 1 %의 올레 산 (아래의 제조법은 250 ML 배치하게)의 플러스 50 ML 위에 나열된 모든 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 병은 4 ° C.에 알루미늄 호일과 가게에서 포장해야

  • 2.5 g의 올레 산
  • 250 ML 0.2M NaOH
  • 55에서 가열하여 해동 올레 산 (냉장에 굳은) ° 10 분 및 60 분에 교반과 NaOH 용액 및 열 추가를위한 C. 알루미늄 호일에 싸서 아르 멸균 유리 병에 저장합니다. 4에 parafilm 및 매장과 인감 병 ° C.

선호 경우, 카탈라아제 강화와 상업 BD BBL 미들 ADC 또는 OADC을 구입할 수 있습니다.

1 % Cycloheximide (100ml)

  • 1g cycloheximide
  • 100 ML ddH 2 O

용해와 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장 주의 : cycloheximide는 극단적 인 손질 때문에 독성이 있습니다.

20 % (V / V) 십대 초반 80 (100ml)

  • 20 ML 십대 초반 80
  • 80 ML ddH 2 O

20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 십대 초반 80 20g (밀도 1.06 g / ML 약 18.9 ML)를 무게. 55 열 솔루션 ° C 30 분 분해하고, 완전히 혼합되도록. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다.

20 % (V / V) Tyloxapol (100ml)

  • 20 ML Tyloxapol
  • 80 ML ddH 2 O

20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 Tyloxapol 20 G (밀도 1.1 g / ML 약 18.2 ML)를 무게. 디에 30 분에 55 ° C까지 열 솔루션ssolve, 그리고 완전히 섞는다. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다.

참고 1 : M.의 글리세롤의 주식을 결핵은 다음 프로토콜을 사용하여 준비가되어 있습니다.

M.의 스타킹 결핵

  • M. 성장 채도 50 ML MADC의 결핵 (OD 600 = 1.5-2.0) 37의 ° C 흔들어 조건 (100 RPM)에 따라. 변형에 따라이 7~14일 소요됩니다.
  • 펠렛 문화에 대한 15 분에 대해 4 ° C에서 2,000 XG에서 샘플을 봐. 표면에 뜨는 제거합니다.
  • 살균 50 % 글리세롤 6 ML에 Resuspend.
  • 4 코닝 극저온 용 시험관 및 레이블 적절에 나누어지는 1.5 ML.
  • -80에서 에탄올 / 드라이 아이스 욕조, 매장에서 바로 플래시 동결 튜브 ° C.

주 2 : Inoculating 부담 H37Rv (-80 °까지 1.5 세 C 주식) MADC 미디어의 70 ML에이 <OD 600 산출/ Innova 40 쉐이커에 흔들어 조건 (100 RPM)에서 37 ° C에서 성장 5 일 후 약 0.6의 하위>.

3 참고 : 문화 오염을 테스트하려면 조사는 표준 풍부한 중간에 문화 나누어지는의 예방 및 야간 부화 후 성장의 부재를 확인 수 있습니다. 일상적으로, 문화는 식민지의 형태를 관찰 및 위상 대비 현미경으로 검사 MADC 한천에 도금되어 있습니다. 설명에 따라 원하는 경우, 문화는 PCR을 사용하여 검증 할 수는 6,110 프리 머입니다. 3

2. 대표 결과

잘 준비가되어 샘플도 2에 도시 된 것과 유사한 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 이 스펙트럼은 M.의 표현입니다 결핵 야생 형 신진 대사 수영장을 보유하고 있습니다. 확인 metabolites는 직접 또는 간접적 D-알라닌 경로와 연결되어 있습니다. 또한, 피크 농도의 크기는 신진 대사 농도에 비례 제시세포 추출물 인치 따라서 치료 문화, 약물 치료, 그리고 돌연변이 변종 사이의 최대 농도의 변화는 metabolites과 신진 대사 경로에 섭동을 표시 할 수 있습니다. M. 결핵 1D H NMR 스펙트럼은 트리플 공명, Z-축 기울기 저온 탐침이 장착 Bruker 이동이다 500 MHz의 분광계에서 수집되었다. 스펙트럼은 CA가 포함되어 있습니다. 이 아미노산, 뉴클레오티드 전구체, 그리고 glycolytic 및 시트르산 중간체를 포함한 40-50 metabolites를 식별하고 계량화 할 수 있었는지에서 400m 봉우리. Bruker 아이콘 소프트웨어와 후퇴-120 샘플 체인저는 NMR 데이터 수집을 자동화하는 데 사용되었다. 1D 1 H NMR 스펙트럼은 효율적으로 (후속 주요 구성 요소 분석 (PCA) 또는 직교 부분 최소 제곱 판별 분석에 유물을 유도 할 수 있습니다 기본 수집에 대한 필요성을 제거, 평면 기준을 용매 제거하고 유지하기 위해 여기 조각 4를 사용 수집 된 OPLS - DA). A 1D H NMR 스펙트럼은 5482.5 Hz에서와 32K 데이터 포인트의 스펙트럼 폭을 25 ° C에서 수집됩니다. 16 더미 스캔 및 128 스캔의 총 스펙트럼을 얻기 위해 사용되었습니다. ACD 연구소 1D NMR 프로세서 소프트웨어는 반 자동으로 모든 1D H NMR의 스펙트럼을 처리하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼은 푸리에는 변형 단계적으로, 그리고 TMSP 정상 (0.0 ppm으로)에 참조했습니다. NMRpipe 소프트웨어 패키지는 개별적으로 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼을 처리하는 데 사용하고 NMRDraw으로 분석되었다. Bruker FID 데이터 파일이 처음 NMRpipe로 인식하는 파일 형식으로 변환 한 후 스펙트럼을 푸리에는 변형 된, 단계는 수정 및 제로가 가득 찼다. 1D 1 H NMR 스펙트럼 및 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼에서 관찰 NMR 피크는 1 H 각각 0.05과 0.50 ppm으로, 13 C 화학적 이동 허용 오차, 그리고 매디슨 Metabolomics 컨소시엄 데이터베이스 (MMCD를 사용하여 특정 metabolites에 할당 ) 6과 인간 Metabolome 데이터베이스. 특히 7, 1D 및 2D NMR의 스펙트럼은 NMR 화학 변화의 피크 목록 다음 인간 Metabolome 데이터베이스에 업로드하는 위치를 수동으로 피크 선택됩니다. 인간 Metabolome 데이터베이스에 의해 식별 metabolites는 NMR의 resonances 일치하고 신진 대사 네트워크에 속하는 수를 최대화 모두에 근거하여 NMR 스펙트럼에 할당됩니다. 각 화합물이나 대사는 일반적으로 여러 CH 쌍과 상응 여러 NMR의 resonances 있습니다. 따라서, 실험 NMR 스펙트럼에서 관찰 아르 이러한 NMR의 resonances의 더 많은, 더 많은 가능성이 대사가 존재합니다. 마찬가지로, 동일한 경로와 연관 여러 metabolites를 식별하는 것은 올바른 과제 확률이 높아집니다. metabolites과 신진 대사 경로의 존재는 유전자와 Genomes (KEGG) 8의 교토 백과 사전과 MetaCyc 데이터베이스 확인했습니다. 9 Mycobacterium smegm는atis는 M.에 유용한 모델 시스템입니다 결핵 및 기타 mycobacterial 병원체. M.의 다른 설명한 바와 같이, 샘플 smegmatis도 sonication에 의해 중단 될 수 있습니다. (10)

그림 2
그림 2. Mycobacterium의 결핵 세포 추출물의 1D H NMR 스펙트럼. 대표 metabolites과 관련된 NMR 피크가 표시됩니다. 약어는 다음과 같습니다 AMP, 아데노신 모노 포스페이트, α-kg, α-ketoglutarate, GLU, Glutamate, 그리고 알라, 알라닌.

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Discussion

연구의 상당수는 M.의 transcriptomic 및 proteomic 프로필을 분석 한 체외 및 생체 조건에서의 다양한 미만의 결핵. 11-16 궁극적으로 유전자 발현 및 효소 활동의 변화는 작은 분자량 분자의 농도의 변화로 이어집니다. 이 화합물의 전체 설명은 metabolome을 구성합니다. 따라서, 신진 대사 경로에 마약과 다양한 성장 조건의 효과는 metabolomic 분석 다음 될 수 있습니다. 17,18 몇몇 연구 M.의 신진 대사 경로를 연구하기이 방법의 장점을 데리고 결핵 (아래 참조)과 다른 하나는 mycobacteria, 또는 M.에 감염된 쥐 신진 대사 변화를 분석하는 데 결핵. 19

이 방법의 잠재적 인 함정은 샘플의 일부 미생물이 완전히 lysed되지 않을 수 있습니다. 필요한 경우, 용해 단계 또는을 반복 할 수 있습니다두 번. 용해 효율은 표준 단백질 분석 (예를 들면, BioRad DC의 단백질 분석)를 수행하여 모니터 할 수 있습니다. 낮은 농도에서 현재 metabolites에 대한 검색의 감도를 높이려면 몇 가지 동일한 샘플 (8 단계에서 수집), 풀링 동결 건조, 그리고 낮은 볼륨에 resuspended 할 수 있습니다.

mycobacteria의 metabolomic 연구의 대체 샘플 준비 절차는 설명했습니다. 예를 들면, 세포 sonication에 의해 중단, 10,20 구슬 심장이 두근 두근, 20 지르코니아 21 구슬과 균질화가 포함되어 있습니다. 마찬가지로, 추출 절차에 변화가 산성화 아세토 니트릴 및 / 또는 기타 유기 용제를 사용했습니다. 20,22-24 대사 식별는 가스 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (GC-MS)를 포함하여 다양한 분석 절차,, 24 액체 크로마토 그래피 -에 의해 달성되었습니다 질량 분석계 (LC-MS), 21,23 및 역방향 상 고성능 액체 chromycobacteria의 cytosolic 추출물에서 예상되는 총 metabolites의 수는 알 수없는 남아 있지만 matography (RP-HPLC). 25 metabolites의 제한된 수의도 파악하고 직접 효소 결정에 의해 정량화. 26되었다 (22)는 그것은 1692 metabolites은 세균에서 발견 된 것으로 유명합니다 모세관 전기 영동과 MS의 subtilis 추출합니다. 27

분석 식별 및 정량화 절차에 관한 중요한 문제는 메스 외에 의해 검토되었다. NMR 기술의 28 장점은 샘플 준비의 용이성과 절차의 비 파괴적인 자연이 포함되어 있습니다. 그러나, 이제까지 확장하지만 화합​​물 식별 가능한 스펙트럼,의 데이터베이스는 전체 대사 식별 여전히 부족합니다. GC-MS 및 LC-MS의 방법은 더 정교 샘플 준비 절차를 요구하고 큰 변화를 가지고 어렵게 resul을 비교 할 수있게 할 수 있습니다다른 실험실에서 TS. 또한, GC-MS의 정확도가 다소 떨어질 정량화로 연결 재료에 결과적 손실과 신진 대사 derivati​​zation이 필요합니다. 분리를 개선하고 LC-MS의 이온화 억제를 제거하는 방법은 이러한 문제의 일부를 극복 할 것을 약속드립니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 의견이 단점은 여전히​​ 가까운 장래에 중요한 문제가 남아 있습니다. 또한, 이러한 2D HSQC, 2D J-해결 및 STOCSY 실험 등의 NMR 방법론이 이미 신진 대사 식별의 효율성 향상과 정확도의 결과입니다. 29 그럼에도 불구하고, NMR 및 LC-MS 절차가 보완 절차이며, 결합 분석에 통합 할 가능성이 높습니다 시스템 metabolome. 28

샘플 준비 절차는 다른 설명 proteomic 분석에 적용 할 수 FastPrep-24 용해 후 버퍼 시스템 및 단계의 적절한 수정, 여기를 설명했다. 30 따라서, 결핵 resea을rchers 야생 유형과 결합 된 시스템 생물학 접근 방식을 포괄 절차를 사용하여 다양한 조건에서 성장 돌연변이 변종에서 샘플을 분석 할 수 있습니다. 31 이러한 기술은 M.의 중심 신진 대사 경로를 해부하기 위해 불가결 증명해야합니다 결핵, 32 대기의 메커니즘을 명료하게하다하고, 더 나은 백신과 antimycobacterial 에이전트를 개발하기 위해 필요할 수 있습니다있는 이해. 이 필요 특히 MDR와 XDR 결핵의 통제 및 치료의 맥락에서, 긴급입니다. 33,34

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

저자는 프로토콜을 개발하면서 도움이 의견 박사 Barletta 박사의 힘 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 도움이 토론 및 교정을 위해 웬디 오스틴 감사드립니다. 이 원고에 설명 된 작업은 네브라스카 - 링컨 산화 환원 생물학 센터 (부모 부여 # NCRR 2P20RR 017675, D. 베커, PI)의 대학에서 위에 나열된 각 조사자에 씨앗 파일럿 교부금의 지원을받는되었다. 또한, 우리는 연구 용품 및 본 출판물에 포함 된 NMR 기법을 표준화 씨 Halouska의 부분 급여 지원을위한 그녀의 R21 부여 (1R21AI087561-01A1)에서 자금을 제공하기 위해 박사 오필리아 Chacon 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

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References

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