Monstervoorbereiding van

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De metaboloom profiel van

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis is een belangrijke oorzaak van sterfte in de mens op wereldschaal. De opkomst van zowel multi-(MDR) en uitgebreid-(XDR) resistente stammen dreigt te ontsporen huidige ziekte controle-inspanningen. Er is dus een dringende behoefte aan geneesmiddelen en vaccins die effectiever dan de huidige ontwikkelen. Het genoom van M. tuberculose is gekend voor meer dan 10 jaar, maar toch zijn er belangrijke hiaten in onze kennis van gen-functie en wezenlijkheid. Vele studies hebben sindsdien gebruikt genexpressieanalyse zowel het transcriptoom en proteomische niveaus om de effecten van drugs, oxidatiemiddelen en groeiomstandigheden de algemene patronen van genexpressie te bepalen. Uiteindelijk wordt de uiteindelijke reactie van deze veranderingen weerspiegeld in de metabole samenstelling van de bacterie waaronder enkele duizenden kleine molecuul gewicht. Vergelijken van de metabolische profielen van wildtype en mutante stammen, hetzij onbehandeld of treated met een bepaald geneesmiddel kan efficiënt in doelbepaling en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe remmers met anti-tbc activiteit. Ook kunnen de effecten van twee of meer voorwaarden metaboloom worden beoordeeld. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een krachtige techniek die wordt gebruikt voor het identificeren en kwantificeren metabole intermediairen. In dit protocol, de procedures voor de opstelling van M. tuberculose celextracten voor NMR metaboloom analyse worden beschreven. Celculturen worden gekweekt onder geschikte omstandigheden en vereist Biosafety Level 3 containment, 1 geoogst en onderworpen aan mechanische lysis behoud koude temperaturen bewaring van metabolieten maximaliseren. Cellysaten worden teruggewonnen, gefiltreerd gesteriliseerd en opgeslagen bij zeer lage temperaturen. Aliquots van deze celextracten worden uitgeplaat op Middlebrook 7H9 agar voor kolonievormende eenheden geen levensvatbare cellen te verifiëren. Na twee maanden incubatie bij 37 ° C, indien geen vikunnen kolonies worden waargenomen, worden monsters uit de opvangvoorziening voor verdere verwerking. Extracten worden gevriesdroogd, geresuspendeerd in gedeutereerd buffer en geïnjecteerd in de NMR instrument, vastleggen spectroscopische gegevens die vervolgens wordt onderworpen aan statistische analyse. De beschreven procedures kunnen worden toegepast voor zowel eendimensionale (1D) 1H NMR en tweedimensionale (2D) 1 H-13 C NMR analyses. Deze methode levert meer betrouwbare kleine molecuulgewicht metaboliet identificatie en meer betrouwbare en gevoelige kwantitatieve analyse van celextract metabolische samenstellingen dan chromatografische methoden. Variaties van de beschreven procedure na cellyse stap kan ook worden aangepast voor parallel proteoomanalyse.

Protocol

1. Protocol Tekst

Dit protocol benadrukt de aanpassing van NMR methodologie om M. tuberculose (klasse III agent). Daarom Biosafety Level 3 (BSL3) praktijken moeten worden gevolgd bij de uitvoering van M. tuberculose onderzoek in een jaarlijks gecertificeerd laboratorium. Blootstelling aan laboratorium gegenereerde aerosols is het belangrijkste gevaar waarmee Personen die aan deze micro-organismen. De volgende procedures worden uitgevoerd in onze instelling en variaties kunnen bestaan ​​op basis van de institutionele bioveiligheid Comite aanbevelingen. Gemeenschappelijke persoonlijke beschermingsmiddelen zal bestaan ​​uit een Tyvek pak, bouffant cap, laarsjes, N95 masker, oogbescherming, mouwen, en een dubbel paar nitril handschoenen. Werkzaamheden waarbij M. tuberculose culturen en / of manipulaties met open M. tuberculose containers wordt uitgevoerd in het type A2 of B2 biologische veiligheidskast. Kunststof bedekte absorberend papier op de werken oppervlak. Alle materialen / supplies worden verwijderd of verwijderd uit de inrichting moeten worden geplaatst in twee biohazard zakken en ontsmet door autoclaveren. Werkbladen en apparatuur gebruikt wordt binnen de kast (FastPrep-24 lysis homogenisator, spectrofotometer, emmer met ijs, enz.) moeten worden gedesinfecteerd na iedere werksessie met 1% Amphyl (tuberculocide, bactericide, fungicide en virucide agent). M. tuberculose culturen moeten worden geplaatst onder dubbele containment voor het transport naar grotere apparatuur zich buiten de biologische veiligheid kabinet, zoals diepvriezers, incubatoren, centrifuges en een koelkast. Centrifugeren wordt uitgevoerd met bijgevoegde Veiligheids bekers en O-ring schroefdop buizen. Voor verdere analyse buiten de BSL3 laboratorium worden celvrije extracten gefiltreerd door een 0,2 urn filter of micro warmte gedood bij 95 ° C gedurende 15 minuten. Twee monsters worden geplateerd om de afwezigheid van kolonievormende eenheden verifiëren vóór verwijdering van insluiting.

  1. Breng 110 ml Middlebrook 7H9 volledige media die polysorbaat 80 (Tween 80 tot klonteren te voorkomen) bouillon (mADC-TW) of een geschikt medium in een 250 ml erlenmeyer. Kweken in drievoud worden routinematig gekweekt per toestand wanneer met 13C-metabolieten, tien identieke worden gekweekt voor 1D 1H NMR profiling. Voor twee voorwaarden (bijvoorbeeld met of zonder toevoeging van geneesmiddel), dubbele kweekvolume per herhaling kunnen worden gekweekt en opgesplitst in twee identieke culturen. Alle reagentia en oplossing recepten worden aan het einde van het protocol.
  2. Inoculeer bouillon met 0,150 ml van M. tuberculose 50% glycerol voorraad (laten ontdooien op ijs). Zie hieronder Opmerking 1.
  3. Laat de cultuur groeien bij 37 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 6 dagen (OD600 0.6-0.8). Zie hieronder Noot 2.
  4. Als er geen antibiotica, alternatieve toevoegingen of andere behandelingen nodig zijn, de culturen zijn klaar om te worden geoogst. Als behandelingen worden gebruikt, blijvendirect naar stap 5. Verwijderen van een 0,5 ml monster van de kolf naar een microcentrifugebuis en staan ​​bij 4 ° C voor cultuur titratie en kwaliteitscontrole: verontreiniging tests, fenotypische analyse, PCR tests. Zie hieronder Noot 3. Op dit punt, gaat u verder met stap 6.
  5. Verwijder kolven uit shaker en voer de gewenste behandeling (bijvoorbeeld, toe te voegen geneesmiddel of metaboliet). Plaats kolven terug in de shaker en incubeer gedurende een extra periode (bijvoorbeeld, 6-18 uur). Aan het einde van deze tijd, neem een andere 1,0 ml aliquot en bepalen OD 600. Verwijderen van een 0,5 ml monster van de kolf naar een microcentrifugebuis en staan ​​bij 4 ° C voor cultuur titratie en kwaliteitscontrole.
  6. Place kweken op ijs gedurende 5 minuten. Na deze stap laat cellen op ijs door het gehele resterende protocol. Harvest kweken door centrifugeren bij 2000 xg en 4 ° C gedurende 15 min in 50 ml buisjes met een benchtop centrifuge. Elke cultuur vereist vier buizen met 25 ml elk (totaal 100 ml moet voldoende signaal-ruis verkrijgen 2D 1H-13C NMR experimenten, waar slechts 50 ml per cultuur vereist 1D 1 H NMR experimenten).
  7. Was elke cel pellet twee keer met ijskoude ddH 2 O (ongeveer 15 ml de eerste keer 10 ml tweede) door centrifugering parameters hierboven beschreven. Voor de tweede wassing, combineren 10 ml in dezelfde buis voor het spinnen. Resuspendeer de celpellet in een eindvolume van 1,0 ml ddH 2 O (moeten aanpassen voor celpellet volume). Als een enkele celsuspensie zonder klonteren gewenst is bij deze stap kunnen cellen kort gesoniceerd en / of door een 27-gauge naald driemaal. Als alternatief kan de cel pellet worden ingevroren bij -80 ° C en bewaard tot verdere verwerking. In het laatste geval worden ingevroren pellets ontdooid op ijs voor resuspensie. Resuspendeer de celkorrels in een eindvolume van 1,0 ml ddH 2 O zoals hierboven vermeld.
  8. Transfer de 1,0 ml celsuspensie aan een 2,0 ml buis met schroefdop Lysing Matrix B (0,1 mm silicabolletjes). Plaats de FastPrep-24 lysis homogenisator in de bioveiligheid kast. Plaats de monsters in de monsterhouder, waarmee de retentie spaak plaat bovenop de buis. Verwerk de monsters gedurende 60 sec in de homogenisator bij een snelheid van 6 meter / sec.
  9. Draai de monsters in een microcentrifuge bij 15.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min om celafval en pellet intacte cellen.
  10. Verwijder supernatant en passeren monster door een spuitfilter (0,2 urn) in een steriele buis. Plaat 0,1 ml monster (of een representatief deel van het monster, bijvoorbeeld 10%) op mADC agar te verifiëren dat er geen levensvatbare cellen. Onderzoekers kunnen voeren ook meer dan een filtratie stap en / of te controleren op de aanwezigheid van levensvatbare cellen in de extracten met behulp van live-dead staining procedures worden vastgesteld om te voorkomen of om eventuele bioveiligheid zorgen. Freeze monsters in een ethanol-droogijsbad op te slaanbij -80 ° C totdat ze gereed zijn gevriesdroogd en verwerkt in een NMR inrichting.
  11. Na 2 maanden controleren platen afwezigheid van kolonievormende eenheden verifiëren. Als er geen CFU's zijn gevonden, kunnen monsters worden genomen uit de BSL3 laboratorium. Verdere analyse wordt uitgevoerd in een standaard NMR inrichting, die normaliter dient meerdere gebruikers en werkt in geen specifieke inperkingsmaatregelen.
  12. Lyofiliseren de monsters tot droog, dan resuspendeer in 0,7 ml buffer NMR overgebracht in een microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 3 min bij 13.000 x g. Verwijder 0,6 ml en transfer naar een 5 mm NMR-buis. Als alternatief zou gevriesdroogde monsters worden gemaild naar een externe voorziening als niet-biologisch reguliere monsters.
  13. NMR gegevens onmiddellijk verzameld. Ondanks alle voorzorgsmaatregelen kunnen actieve enzymen nog aanwezig en het monster is typisch niet stabiel gedurende lange tijd. Veranderingen in de NMR spectrum merkbaar wanneer de monsters weggelaten bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende meer dan 1 week. Ook is NMR het verzamelen van gegevens afgewisseld tussen onbehandelde en drugs behandelde culturen, waar monsters willekeurig gekozen worden uit elke categorie. Dit voorkomt onnodige vooroordelen omdat een bepaalde categorie had een langere vertraging voor de NMR-spectra werden verzameld. Een bias in de data zou gebeuren als de NMR spectra voor alle onbehandelde monsters werden eerst verzameld en gevolgd door het geneesmiddel behandelde monsters. Indien de monsters niet onmiddellijk worden geanalyseerd door NMR moet monsters worden in 1 ml Eppendorf buisjes bij -80 ° C.
  14. Nadat de monsters in een BACS-120 monsterwisselaar, kalibratie, die enkele routine stappen zoals lock, shim, aanpassen en optimaliseren van de 90 ° puls lengte omvat, moet de kwaliteit van de resultaten te maximaliseren. Een monster wordt gebruikt om de 90 ° pulslengte kalibreren en het instrument voor de overige samples afstemmen. Vergrendelen, shimming, en NMR het verzamelen van gegevens voor elk monster is geautomatiseerd using ICONNMR en gradshim.
  15. Een 1D 1H NMR-spectrum wordt verzameld met de Bruker zgesgp pulsreeks met wateronderdrukking met excitatie beeldhouwen. Een totaal van 32k datapunten met een sweep breedte van 5482.5Hz, 128 scans, en 16 dummy scans worden gebruikt. Een 2D 1H-13C HSQC spectrum wordt verzameld met de Bruker hsqcetgp pulssequentie. Een totaal van 2048 datapunten met een sweep breedte van 5000,0 Hz wordt verzameld langs de direct 1 H-maat, en 64 data punten met een sweep breedte van 18864,9 Hz langs de indirecte 13 C dimensie. Het spectrum wordt verzameld met 128 scans en 16 dummy scans goed signaal te krijgen voor lawaai.

Figuur 1
Figuur 1. Een stroomdiagram van de experimentele procedures afgebeeld.

NMR-buffer

Voorraadoplossing van 50 mM kaliumfosfaat buffer met 50 uM TMSP:

  • 2,17 g K 2 HPO 4 (kalium dibasisch)
  • 1,70 g KH 2 PO 4 (kalium monobasisch)
  • 7,86 mg natrium-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%))
  • Los in 500 ml van "100%" D 2 O
  • De uiteindelijke oplossing moet op een pH 7,2 (ongecorrigeerde)

MADC-TW of MOADC-TW (1 L)

  • 4,7 g Middlebrook 7H9 bouillon basis
  • 900 ml ddH 2 O
  • 2 ml glycerol
  • Meng de bestanddelen en autoclaaf gedurende 25 min. Koele vloeistof aan te raken en voeg de volgende oplossingen:
  • 100 ml ADC bij het opstellen van mADC of 100 ml OADC bij het opstellen van MOADC
  • 2,5 ml 20% Tween 80 (eventueel 1 ml van niet-metaboliseerbare 20% Tyloxapol)
  • 10 ml 1% cycloheximide

ADC (1 L)

  • 20 g D (+)-Glucose
  • 50 g BSA FractionV
  • 8,5 g NaCl
  • 800 ml ddH 2 O
  • Los samen, zet het volume op 1 L en steriliseren met 0,2 um filter. Bewaar bij 4 ° C.

Alternatief, OADC (1L) te bereiden, voeg alle componenten zoals hierboven plus 50 ml van 1% oliezuur (recept hieronder maakt een 250 ml batch). Los samen, zet het volume op 1 L en steriliseren met 0,2 um filter. Fles moet worden verpakt in aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C.

  • 2,5 g Oliezuur
  • 250 ml 0,2 M NaOH
  • Thaw oliezuur (vast wordt bij koeling) door verwarming bij 55 ° C gedurende 10 min en voeg NaOH oplossing en verwarm onder roeren gedurende 60 minuten. Bewaren in steriele glazen flessen die zijn verpakt in aluminiumfolie. Seal flessen met parafilm en bewaar bij 4 ° C.

Indien gewenst, kunt u de aanschaf commerciële BD BBL Middlebrook ADC of OADC met catalase Verrijking.

1% Cycloheximide (100ml)

  • 1 g cycloheximide
  • 100 ml ddH 2 O

Los op en steriliseren met 0,2 urn filter. Bewaar bij 4 ° C. Let op: cycloheximide is giftig dus hanteer met uiterste zorg.

20% (v / v) Tween 80 (100ml)

  • 20 ml Tween 80
  • 80 ml ​​2 O ddH

Alternatief wegen 20 g Tween 80 (ongeveer 18,9 ml; dichtheid 1,06 g / ml), 20% w / v oplossing te bereiden. Heat oplossing tot 55 ° C gedurende 30 min op te lossen en meng volledig. Steriliseren vloeistof met een 0,2 urn filter. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij kamertemperatuur.

20% (v / v) Tyloxapol (100ml)

  • 20 ml Tyloxapol
  • 80 ml ​​2 O ddH

Alternatief wegen 20 g Tyloxapol (ongeveer 18,2 ml; dichtheid 1,1 g / ml), 20% w / v oplossing te bereiden. Heat oplossing tot 55 ° C gedurende 30 minuten tot dissolve, en meng volledig. Steriliseren vloeistof met een 0,2 urn filter. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij kamertemperatuur.

Opmerking 1: glycerol voorraden van M. tuberculose worden bereid met het volgende protocol.

Stocking van M. tuberculose

  • Grow M. tuberculose in 50 ml verzadigd mADC (OD 600 = 1,5 tot 2,0) bij 37 ° C onder schudden omstandigheden (100 rpm). Afhankelijk van de stam, zal dit 7-14 dagen.
  • Spin monsters 2.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min te korrelkweek. Verwijder supernatant.
  • Resuspendeer in 6 ml steriel 50% glycerol.
  • Aliquot 1,5 ml in 4 Corning cryogene vials en label op de juiste wijze.
  • Onmiddellijk flash freeze flesjes in ethanol / droog ijsbad en bewaar bij -80 ° C.

Opmerking 2: inenten stam H37Rv (-80 ° C voorraad tot 1,5 jaar) in 70 ml mADC media levert een OD 600 </ Sub> of ongeveer 0,6 na 5 dagen groei bij 37 ° C onder schudden omstandigheden (100 rpm) in een Innova 40 Shaker.

Opmerking 3: cultuur besmetting te testen, onderzoekers zou een cultuur hoeveelheid enten op standaard rijk medium en controleer afwezigheid van groei na incubatie gedurende de nacht. Routinematig worden cultures uitgeplaat op agar met mADC koloniemorfologie observeren en door fase-contrast microscopie onderzocht. Desgewenst cultures worden geverifieerd door PCR primers gebruikt, wordt 6110 beschreven. Drie

2. Representatieve resultaten

Een monster dat goed voorbereid levert een NMR spectrum lijkt op de in figuur 2. Dit spectrum is een weergave van de M. tuberculose wild-type metabole zwembad. De geïdentificeerde metabolieten zijn direct of indirect verband houden met de D-alanine pad. Ook de grootte van piekintensiteit is evenredig met metaboliet aanwezige concentratiesin het celextract. Daarom veranderingen in de intensiteit van de piek tussen onbehandelde culturen, medicamenteuze behandeling, en mutante stammen kunnen aangeven verstoringen in metabolieten en metabole routes. De M. tuberculosis 1D 1H NMR spectra werden op een Bruker Avance 500 MHz spectrometer uitgerust met een triple-resonantie, Z-as gradient cryosonde. Het spectrum bevat ca. 400 pieken, waaruit kon identificeren en kwantificeren 40-50 metabolieten, waaronder aminozuren, nucleotide voorlopers en glycolytische tussenproducten en citroenzuur. A-120 BACS monsterwisselaar met Bruker Icon software werd gebruikt om de NMR gegevensverzameling automatiseren. 1D 1H NMR spectra werden verzameld excitatie sculpting 4 efficiënt te verwijderen van het oplosmiddel en onderhouden van een vlakke basislijn, waardoor elke noodzaak voor baseline collectie artefacten kunnen veroorzaken in volgende principal component analysis (PCA) of orthogonale partial least squares discriminant analyse (OPLS- DA). A 1D 1 H NMR-spectrum wordt verzameld bij 25 ° C met een spectrum breedte van 5482,5 Hz en 32K gegevenspunten. Een totaal van 16 dummy scans en 128 scans werden gebruikt om het spectrum te verkrijgen. De ACD Labs 1D NMR processor software werd gebruikt om semi-automatisch verwerken alle 1D 1H NMR spectra. De spectra waren Fourier getransformeerd, gefaseerde, en gerelateerd aan het TMSP piek (0,0 ppm). De NMRpipe softwarepakket gebruikt om individueel verwerken 2D 1H-13C NMR spectra en geanalyseerd met NMRDraw. De Bruker FID databestand werd voor het eerst geconverteerd naar een bestandsformaat herkenbaar aan NMRpipe en daarna het spectrum werd Fourier getransformeerd, fase gecorrigeerd, en nul gevuld. De waargenomen NMR-pieken in de 1D 1H NMR spectrum en 2D 1H-13C NMR spectrum worden toegekend aan specifieke metabolieten met 1H en 13C chemische verschuiving toleranties van 0,05 en 0,50 ppm, respectievelijk, en de Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD ) 6 en de Human metaboloom Database. 7 Met name de 1D en 2D NMR-spectra zijn handmatig piek-picked, waarbij de piek lijst van NMR chemische verschuivingen vervolgens geüpload naar de Human metaboloom Database. De metabolieten die de Human metaboloom Database toegewezen aan de NMR spectrum gebaseerd op zowel maximaliseren van het aantal passende NMR resonanties die behoort tot een metabole netwerk. Elke verbinding of metaboliet heeft meestal meerdere CH paren en dienovereenkomstig meerdere NMR resonanties. Dus, hoe meer van deze NMR resonanties die worden waargenomen in de experimentele NMR spectrum, hoe waarschijnlijker de metaboliet aanwezig is. Ook identificeren meerdere metabolieten associëren met dezelfde route verhoogt de kans juiste opdrachten. De aanwezigheid van metabolieten en metabole routes worden geverifieerd met de Kyoto-Encyclopedie van genen en genomen (KEGG) 8 en de MetaCyc databases. 9 Mycobacterium smegmATIS is een bruikbaar model voor M. tuberculose en andere mycobacteriële ziekteverwekkers. Zoals elders beschreven monsters van M. smegmatis kan ook worden verstoord door sonicatie 10.

Figuur 2
Figuur 2. 1D 1H NMR spectrum van Mycobacterium tuberculosis celextract. NMR-pieken in verband met de representatieve metabolieten zijn gelabeld. Afkortingen zijn: AMP, adenosine mono fosfaat, α-Kg, α-ketoglutaraat, Glu, glutamaat en Ala, alanine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een groot aantal studies hebben de transcriptoom-en proteoomanalyse profielen van M. tuberculose onder verschillende in vitro en in vivo omstandigheden. 11-16 uiteindelijk veranderingen in genexpressie en enzymactiviteit leiden tot variaties in de concentraties van kleine moleculen molecuulgewicht. De volledige beschrijving van deze verbindingen vormt het metaboloom. Aldus kunnen de effecten van drugs en ​​wisselende groeiomstandigheden op metabolisme gevolgd door metabolische analyse. 17,18 weinig studies hebben geprofiteerd daarvan door metabole routes in M. bestuderen tuberculose (zie hieronder) en andere mycobacteriën te analyseren of metabole veranderingen in muizen geïnfecteerd met M. tuberculose. 19

Een mogelijke valkuil van deze methode is dat sommige micro-organismen in het monster niet kan volledig worden gelyseerd. Indien nodig kan de lysis stap worden herhaald een ofnog twee keer. Lysis efficiëntie kan gevolgd worden door uitvoeren van een standaard eiwittest (bijvoorbeeld BioRad DC Protein Assay). De gevoeligheid van detectie metabolieten in lage concentraties te verhogen kunnen meerdere identieke monsters (verzameld bij stap 8) worden samengevoegd, gevriesdroogd en opnieuw gesuspendeerd in een lager volume.

Alternatieve monstervoorbereiding procedures voor metabolietvorming in mycobacteriën zijn beschreven. Voorbeelden hiervan zijn, celdisruptie door sonificatie, 10,20 kraal slaan, 20 en homogeniseren met Zirconia 21 kralen. Ook zijn variaties in procedures extractie aangezuurd acetonitril en / of andere organische oplosmiddelen. 20,22-24 Afbraakproduct identificatie is ook bereikt door verschillende analytische procedures, zoals gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), 24 vloeistofchromatografie- massaspectrometrie (LC-MS), 21,23 en reverse-phase high performance liquid gechromatography (RP-HPLC). 25 A beperkt aantal metabolieten werden ook geïdentificeerd en gekwantificeerd door directe enzymatische bepaling. 26 Hoewel het totale aantal metabolieten verwacht cytosolextracten van mycobacteriën onbekend blijft, 22 wordt opgemerkt dat 1692 metabolieten werden geïdentificeerd in Bacillus subtilis extracten van capillaire elektroforese en MS 27.

Belangrijke kwesties met betrekking tot analytische identificatie en kwantificatie procedures zijn beoordeeld door Metz et al. 28. Voordelen van de NMR-technologie zijn onder andere het gemak van de monstervoorbereiding en de niet-destructieve aard van de procedure. Echter, de databases van beschikbare spectra voor verbinding identificatie, hoewel steeds groter, zijn nog onvoldoende voor volledige metaboliet identificatie. Methoden van GC-MS en LC-MS kunnen meer uitgebreide monstervoorbereiding procedures en hebben een grotere variabiliteit, waardoor het moeilijk is om Resul vergelijkents van verschillende laboratoria. Bovendien GC-MS heeft metaboliet derivatisering met een gevolgschade in materiaal dat leidt tot minder nauwkeurige kwantificering. Methoden om scheidingen te verbeteren en te elimineren ionisatie onderdrukking in LC-MS beloven aantal van deze problemen te overwinnen. Toch, naar onze mening, zal dit nadeel nog steeds een belangrijk probleem in de nabije toekomst. Bovendien NMR methodologieën zoals 2D HSQC, 2D J-resolved en STOCSY experimenten reeds resulteert in grotere efficiëntie en nauwkeurigheid in metaboliet identificatie 29. Echter NMR en LC-MS procedures complementair procedures en waarschijnlijk worden opgenomen in een gecombineerde analyse van een systeem metaboloom 28.

De monstervoorbereidingseenheid hier beschreven, met geschikte aanpassingen van buffersystemen en stappen na de FastPrep-24 lysis kan worden aangepast aan proteoomanalyse zoals elders beschreven. 30 Zo, tuberculose researchers kunnen analyseren monsters van wildtype en mutante stammen gekweekt onder verschillende omstandigheden uitgevoerd dat gecombineerde systeembiologie benaderingen omvatten. 31 Deze technologieën onmisbaar blijken de centrale metabole routes van M. ontleden tuberculose, 32 het begrip van die noodzakelijk zijn om de mechanismen van latentie toe te lichten, en betere vaccins en antimycobacteriële middelen ontwikkelen. Deze noodzaak is urgent, vooral in de context van de controle en behandeling van MDR en XDR tuberculose. 33,34

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs willen graag alle leden van de laboratoria van Dr Barletta en Dr Powers bedanken voor nuttige opmerkingen bij het ontwikkelen van het protocol. Wij danken Wendy Austin voor nuttige discussies en proeflezen van het manuscript. Het werk beschreven in dit manuscript werd gefinancierd door zaad piloot de subsidie ​​voor elke onderzoeker hierboven genoemde aan de Universiteit van Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (ouder subsidie ​​# NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Daarnaast danken wij dr. Ofelia Chacon voor het verstrekken van financiële middelen uit haar R21 subsidie ​​(1R21AI087561-01A1) voor onderzoek leveringen en gedeeltelijke salaris heer Halouska de steun aan NMR-technieken in deze publicatie te standaardiseren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics