Numune Hazırlama

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ve metabolomik profili

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis küresel ölçekte insan mortalitenin önemli bir nedenidir. Hem çok (MDR) ve yaygın-(XDR) ilaca dirençli suşların ortaya çıkması mevcut hastalık kontrol çabalarını rayından tehdit ediyor. Böylece, şu anda mevcut olanlardan daha etkili ilaçlar ve aşılar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. M. genom tüberküloz fazla 10 yıldır bilinen, fakat gen fonksiyonu ve zorunluluk bilgimizi önemli boşluklar bulunmaktadır olmuştur. Birçok çalışma bu yana gen ifadesinin küresel desenleri ile ilgili ilaçlar, oksidanlar ve büyüme koşullarının etkisini belirlemek amacıyla Transkriptomik ve proteomik düzeyde hem de gen ekspresyon analizi kullandık. Sonuçta, bu değişikliklerin nihai yanıtını birkaç bin küçük moleküler ağırlıklı kimyasal maddeler de dahil olmak üzere bakterinin metabolik kompozisyonu yansıtılır. Tedavi edilmeyen veya tr ya da yabani tip ve mutant suşlarının metabolik profilleri KarşılaştırılmasıBelirli bir ilaç ile eated, etkili bir hedef tespit edilmesini sağlar ve antitüberküloz aktivitesi olan yeni inhibitörlerinin gelişimine neden olabilir. Aynı şekilde, metabolome üzerinde iki ya da daha fazla koşulların etkileri de tespit edilebilir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) metabolik ara tanımlamak ve ölçmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. M. hazırlanması için bu protokol, prosedürler NMR metabolomik analiz için tüberküloz hücre ekstreleri tarif edilmektedir. Metabolitlerin korunması maksimize etmek için soğuk sıcaklıkları korurken hücre kültürleri uygun koşullar ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi 3 çevreleme, 1 hasat altında yetiştirilen ve mekanik lizis tabi tutulur. Hücre lizatları kurtarıldı, steril ve ultra-düşük ısılarda saklanan filtrelendi. Bu hücre özleri alikotlar canlı hücrelerinin yokluğu doğrulamak için koloni oluşturan birim için Middlebrook 7H9 agarda kaplanır. 37 inkübasyon iki ay ° C, eğer üzerine hiçbir vimümkün koloniler gözlenir, numune üretim prosesleri için tecrit tesisine kaldırılır. Özler, liyofilize edildi döteryumlanmış tampon içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra istatistiksel analize tabi tutulur spektroskopik verileri yakalamak, NMR aleti olarak enjekte edilir. Anlatılan prosedürler (1D) tek boyutlu 1 H NMR ve iki-boyutlu (2B) 1 H-13 C NMR analizi her ikisi için de uygulanabilir. Bu metodoloji kromatografik yöntemlere göre daha güvenilir küçük molekül ağırlığı metabolit tespiti ve hücre ekstresi metabolik kompozisyonlar daha güvenilir ve duyarlı kantitatif analizler sağlar. Işlem varyasyonları hücre parçalama aşamasını takiben de tarif paralel Proteomik analizleri için adapte edilebilir.

Protocol

1. Protokol Metni

Bu protokol M. NMR metodolojisinin adaptasyonu vurgulamaktadır Tüberküloz (Sınıf III ajan). M. yaparken nedenle, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) uygulamaları takip edilmesi gereken bir yıllık sertifikalı laboratuvarda tüberküloz araştırma. Laboratuvar tarafından oluşturulan aerosoller Maruziyet bu mikroorganizmalar ile çalışan personel tarafından karşılaşılan en önemli tehlikedir. Aşağıdaki yordamlar Kurumumuzda yürütülen ve varyasyonları Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin önerilerine dayanarak mevcut olabilir. Ortak personel koruyucu ekipman, bir Tyvek elbise, kabarık kap, patik, N95 solunum, göz koruma, kollu ve nitril eldiven bir çift çifti oluşacaktır. M. içeren çalışın Açık M. tüberküloz kültürü ve / veya manipülasyon tüberküloz konteyner tipi A2 veya B2 biyolojik güvenlik kabininde yapılır. Plastik-kaplı emici kağıt w üzerine yerleştiriliryüzey akıcı iş. Bertaraf veya tesis kaldırılacak tüm malzemeler / gereçler iki biohazard torba yerleştirilir ve otoklavlanarak dekontamine edilmelidir. Çalışma yüzeyleri ve dolap (FastPrep-24 lizis homojenizatör, spektrofotometre, buz kovası, vb) içinde kullanılan ekipmanlar 1% Amphyl (tüberkülsit, bakterisid fungusid ve virüsidal ajanı) ile her çalışma oturumundan sonra dezenfekte edilmelidir. M. tüberküloz kültürleri gibi dondurucu, inkübatör, santrifüj, ve buzdolabı gibi biyolojik güvenlik kabini dışında bulunan büyük ekipman ulaşım için çifte altına alınmalıdır. Santrifüj kapalı güvenlik kapları ve O-ring vida üst tüpleri ile yapılır. BSL3 laboratuar dışında ileri analiz için, hücre içermeyen özler 15 dakika süreyle 95 ° C de öldü 0.2 um bir filtreden veya mikroorganizmalar ısı ile filtre edilir. 2 numuneler önce çevreleme kaldırılması için koloni oluşturan birim yokluğunda doğrulamak için kaplanır.

  1. 110 Polisorbat 80 (Tween 80 topaklanma önlemek için) içeren Middlebrook 7H9 ortamı ml tam çorbası (mA DC-TW) ya da bir 250 ml Erlenmeyer şişesi için uygun bir ortam. Aktarma C-metabolitler 13 kullanırken üç kat kültürlerinin rutin durum başına yetiştirilen ve on özdeş kültür 1D 1H NMR profilleme için yetiştirilir. Iki koşula (örneğin, ilaç ilavesi ile ve olmadan) çoğaltmak başına kültürünün çift hacmi büyüdü ve iki özdeş kültürlere ayrılabilir için. Bütün reaktif ve çözelti tarifleri protokolünün sonunda sağlanmaktadır.
  2. M. 0.150 ml broth inoküle tüberküloz% 50 gliserol stoku (buz çözülmesini sağlar). Aşağıdaki 1. Not bakınız.
  3. Kültürü 37 büyümesine izin ver ° C'de yaklaşık 6 gün (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm'de sallayarak. Aşağıdaki Not 2'ye bakınız.
  4. Hiçbir antibiyotikler, alternatif eklemeler veya diğer tedaviler gerekiyorsa, kültürler hasat edilmeye hazırdır. Tedaviler kullanıldığında, devamdoğrudan 5. adıma. Kirlenme testleri, fenotipik analizi, PCR testleri: Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. Aşağıdaki Not 3'e bakınız. Bu noktada, 6. Aşamaya geçin.
  5. Sallantıyı matara çıkarın ve istenen tedavi (örn., ilaç ya da metaboliti ekleyin) gerçekleştirin. Sıra bir ek süre (örneğin, 6-18 saat) için çalkalayıcı ve inkübe geri şişelerde. Bu sürenin sonunda, diğer bir 1.0 ml bir örnek alır ve OD 600 belirler. Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak.
  6. 5 dakika buz üzerine yerleştirin kültürler. Bu adımdan sonra, geriye kalan bütün protokol boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. Hasat 2,000 x g'de ve 4 de santrifüj ile kültür ° C'de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 50 ml tüp içinde 15 dakika için. Her bir kültür 25 ml her biri (1 toplam dört tüp gerektirir00 ml 2B 1 için yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek için gerekli olan H-13 C kültür başına 50 ml 1D 1 H NMR deneyleri için gerekli NMR deneyleri).
  7. Yukarıda anlatılan parametrelere göre santrifüj buz-soğuk GKD 2 O (yaklaşık olarak 15 mi, ilk kez ve 10 ml ikinci kez) ile her bir hücre peleti iki kez yıkayın. İkinci yıkama için iplik önce aynı tüp içine 10 ml alikotları birleştirir. 1.0 ml GKD 2 O (hücre peleti hacim için ayarlamak için gereken) bir nihai hacim içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Yığınlaşma serbest tek bir hücre süspansiyonu bu aşamada arzu ediliyorsa, kısa bir süre için sonike edilmiş hücreler ve / veya bir 27 gauge iğneden üç kez geçirildi edilebilir. Alternatif olarak, hücre peleti -80 ° C de donduruldu ve daha ileri işleme kadar saklanabilir. İkinci durumda ise, dondurulmuş pelet yeniden süspanse edilmesi için önce buz üzerinde çözülmüş edilir. Yukarıda belirtildiği gibi 1.0 ml GKD 2 O değerindeki bir son hacim içinde, hücre topakları yeniden süspanse edin.
  8. TransfeParçalama Matris B (0.1 mm silis küreler) ihtiva eden 2.0 ml bir vidalı kapak tüp için r, 1.0 ml hücre süspansiyonu. Biyogüvenlik kabini içindeki FastPrep-24 lizis homojenizatör yerleştirin. Tutma tüpün üstünde plaka konuştu güvence, numune tutucu içine örnekleri koyun. 6 metre / saniye hız ayarında homojenleştiricide 60 sn örnekleri işleyin.
  9. 15.000 x g'de ve 4, bir mikrosantrifüj içinde örnekleri döndürme ° C'de pellet hücre artıkları ve sağlam hücreler 10 dakika için.
  10. Steril bir tüp içine bir şırınga filtresi (0.2 mikron) ile süpernatant ve geçiş örnek çıkarın. MA DC agar üzerinde numune Plate 0.1 ml (% 10 veya örnek olarak örnek bir temsilcisi fraksiyonu) hiçbir canlı hücre olduğunu doğrulamak için. Araştırmacılar ayrıca, birden fazla filtrasyon adım yapmak ve / veya herhangi bir potansiyel biyogüvenlik endişeleri önlemek veya belirlemek amacıyla canlı-ölü boyama prosedürleri kullanarak özler canlı hücrelerin varlığını doğrulayabilir. Depolamak için bir madde, etanol-kuru buz banyosu içinde örnekleri Dondurarak-80 ° C de bir NMR tesiste liyofilize ve işlenebilir hazır oluncaya kadar.
  11. 2 ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Hiçbir CFU en bulunursa, örnekleri BSL3 laboratuar dışına alınabilir. Diğer analizler normal olarak çoklu kullanıcı sunmaktadır ve herhangi bir özel önleme şartları altında çalışan bir standart NMR odası içinde gerçekleştirilir.
  12. Kuruyana kadar Lyophilize numuneleri, daha sonra NMR tampon ve bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.7 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 13,000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.6 ml ve 5 mm NMR tüpü transfer çıkarın. Alternatif olarak, liyofilize örnekleri olmayan biyozararli düzenli örnekleri gibi harici tesisine gönderilecek olabilir.
  13. NMR verileri hemen toplanır. Tüm önlemlere rağmen, aktif enzimler hala mevcut olabilir ve örnek uzun süre için genellikle istikrarlı değildir. Örnekler m ° C ila oda sıcaklığında ve 4 'te dışında kaldığında NMR spektrum değişiklikler belirgin hale gelmektedirler1 hafta daha cevher. Ayrıca, NMR veri toplama örnekler rastgele her kategoride seçilen tedavi ve ilaç tedavi kültürler arasındaki izliyor. NMR spektrumları toplanmıştır önce belirli bir kategoriye daha uzun bir gecikme vardı çünkü bu gereksiz önyargı önler. Tüm işlem görmemiş örnekler için NMR spektrumu, ilaç tedavisi örnekleri birinci toplanmış ve daha sonra takip edildi eğer veri bir sapma meydana gelmektedir. Örnekler hemen NMR ile analiz edilmesi mümkün değilse, numuneler -80 ° C'de 1 ml Eppendorf tüpleri saklanmalıdır
  14. Örneğin, kilit, şim, ayar ve 90 ° darbe uzunluğu optimizasyonu gibi birkaç rutin adımları içeren bir BACS-120 numune değiştirici, cihaz kalibrasyonu, içine numune yerleştirdikten sonra sonuçların kalitesini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Tek bir numune 90 ° nabız süresini ayarlamak ve kalan numuneler için araç ayarlamak için kullanılır. Kilitleme shimming ve her örnek için NMR veri toplama otomatik istimal olduğunug ICONNMR ve gradshim.
  15. A 1D 1H NMR spektrumu uyarma heykel kullanarak su bastırmalı Bruker zgesgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 32k veri 5482.5Hz bir süpürme genişliği ile puan, 128 taramalar ve 16 kukla taramaları toplam kullanılmaktadır. A 2D 1 H-13 C HSQC spektrum Bruker hsqcetgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 5000.0 Hz süpürme genişliği ile 2048 veri noktalarının toplam doğrudan 1 H boyut boyunca toplanan ve dolaylı 13 C boyut boyunca 18864,9 Hz süpürme genişliği ile 64 veri noktaları edilir. Spektrum gürültü sinyali iyi almak için 128 taramalar ve 16 kukla taramaları ile tahsil edilir.

Şekil 1
Şekil 1. Deneysel prosedür bir akış şeması tasvir edilmiştir.

NMR tamponu

50 mM potasyum fosfat, soluk sarı stok solüsyonu50 uM TMSP ile er:

  • 2.17 g K 2 HPO 4 (potasyum fosfat dibazik)
  • 1.70 g KH 2 PO 4 (potasyum fosfat tekbazlı)
  • 7.86 mg Sodyum-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D,% 98))
  • "100%" D 2 O 500 ml suda eritilir
  • Nihai çözüm pH 7.2 (düzeltilmemiş) olmalıdır

MA DC-TW veya MOADC-TW (1 L)

  • 4.7 g Middlebrook 7H9 broth base
  • 900 ml GKD 2 O
  • 2 ml gliserol
  • 25 dakika boyunca kısımlar ve otoklav karıştırın. : Aşağıdaki çözümler dokunun ve eklemek için serin sıvı
  • 100 ml ADC MOADC hazırlanmasında mA DC veya 100 ml OADC hazırlanmasında
  • 2.5 ml% 20 Tween 80 (alternatif olarak, non-metabolik% 20 Tyloxapol 1 ml)
  • 10 ml% 1 sikloheksimid

ADC (1 L)

  • 20 g D (+)-glikoz
  • 50 g BSA FraksiyonuV
  • 8.5 g NaCl
  • 800 ml GKD 2 O
  • Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C'de depolayın

Alternatif olarak, OADC (1L) hazırlamak için% 1 oranında oleik asit (aşağıda tarif 250 mL'lik bir toplu hale getirir) artı 50 ml yukarıda listelenen tüm bileşenlerini ekleyin. Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. Şişe 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza sarılmış gerekmektedir

  • 2.5 g Oleik Asit
  • 250 ml 0.2 M NaOH
  • 55 ısı ile Çözünme oleik asit (soğutma üzerine katılaşan) ° 10 dakika ve 60 dakika için karıştırma ile NaOH çözeltisi ve ısı ile eklemek için C'dir. Alüminyum folyo ile sarılmış steril cam şişelerde saklayın. 4 at parafilm ve mağaza ile Seal şişeleri ° C.

Tercih ederseniz, katalaz Zenginleştirme ile ticari BD BBL Middlebrook ADC veya OADC satın alabilirsiniz.

% 1 Sikloheksimit (100ml)

  • 1 g sikloheksimid
  • 100 ml GKD 2 O

Çözülür ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C'de depolayın Dikkat: sikloheksimid son derece dikkatle ele kadar zehirli olduğunu.

% 20 (v / v) Tween 80 (100ml)

  • 20 ml Tween 80
  • 80 ml ​​GKD 2 O

% 20 w / v çözelti hazırlamak için, alternatif olarak, Tween 80 ve 20 g (yoğunluk 1.06 g / mL, yaklaşık 18.9 ml) tartın. 55 Isı çözümü ° C 30 dk erimesi ve tamamen karıştırmak için. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın.

% 20 (v / v) Tyloxapol (100ml)

  • 20 ml Tyloxapol
  • 80 ml ​​GKD 2 O

% 20 w / v çözelti hazırlamak için; Alternatif olarak, Tyloxapol 20 g (yoğunluğu 1,1 g / mL, yaklaşık 18.2 ml) tartın. Di için 30 dakika için 55 ° C ısıya çözeltissolve ve tamamen karıştırın. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın.

Not 1: M. Gliserol stokları tüberküloz aşağıdaki protokol kullanılarak hazırlanmıştır.

M. Stoklama tüberküloz

  • M. büyütün doygunluk 50 ml mA DC tüberküloz (OD 600 = 1.5 ila 2.0) 37 ° C sallayarak koşulları (100 rpm) altında. Suşu bağlı olarak, bu 7-14 gün sürer.
  • Pelet kültür için 15 dakika için 4 ° C'de 2.000 x g'da örnekleri Spin. Süpernatantı.
  • Steril% 50 gliserol 6 ml süspanse edin.
  • 4 Corning kriyojenik şişeleri ve etiket uygun içine tablet 1,5 ml.
  • -80 Etanol / kuru buz banyosu ve mağaza hemen flaş dondurma şişeleri ° C.

Not 2: aşılamak suşu H37Rv (-80 ° 1,5 yaşında C stok) mA DC medya 70 mL <bir OD 600 verir/ Bir Innova 40 Shaker sallayarak koşullar (100 rpm) altında 37 ° C'de büyüme 5 gün sonra yaklaşık 0,6 alt>.

Not 3: kültür kontaminasyon test etmek için, araştırmacılar standart zengin ortam üzerine bir kültür kısım aşılamak ve gecelik inkübasyon sonrası büyüme yokluğu doğrulamak olabilir. Rutin, kültürleri koloni morfolojisi gözlemlemek ve faz-kontrast mikroskop ile incelenmesi mA DC agarda kaplanır. Açıklandığı gibi İsterseniz, kültürler PCR kullanılarak doğrulanabilir 6110 primerler IS. 3

2. Temsilcisi Sonuçlar

Da hazırlanmış olan bir örnek, Şekil 2'de tasvir edilen bir benzer bir NMR tayfı elde edilir. Bu spektrum, M. bir temsilidir; tüberküloz vahşi tip metabolik havuzu. Metabolitleri, doğrudan ya da dolaylı olarak, D-alanin yolu ile ilişkilidir. Ayrıca, zirve yoğunlukları büyüklüğü metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır sunmakhücre özü. Bu nedenle tedavi kültürleri, ilaç tedavisi ve mutant suşlar arasındaki pik şiddetleri değişiklikleri metabolitleri ve metabolik yollar tedirginlikler gösterebilir. M. tüberküloz 1D 1 H NMR spektrası, bir üçlü-rezonans, Z-eksenine gradyanı kriyoprob ile donatılmış bir Bruker Avance 500 MHz spektrometre üzerinde elde edilmiştir. Spektrumu ca içerir. Bu amino asitler, nükleotid öncülleri ve glikolitik ve sitrik asit ara dahil olmak üzere 40-50 metabolitleri tanımlamak ve ölçmek mümkün olduğu 400 zirveleri. İkon Bruker yazılımı ile birlikte bir BACS-120, numune değiştirici NMR verileri toplama otomatikleştirmek için kullanılmıştır. 1D 1 H NMR spektrumları verimli (sonraki temel bileşenler analizi (PCA) veya dikey kısmi en küçük kareler diskriminant analizi eserler indükleyebilir temel koleksiyon için herhangi bir ihtiyacı ortadan kaldırarak, düz taban çözücü kaldırmak ve korumak için uyarma heykel 4 kullanılarak toplanmıştır OPLS- DA). A 1D 1 H-NMR spektrumu 5482,5 Hz ve 32K veri noktaları bir spektrum genişliği 25 ° C 'de toplanmıştır. 16 kukla taramaları ve 128 taramalar toplam spektrum elde etmek için kullanılmıştır. ACD Labs 1D NMR işlemci yazılım yarı-otomatik olarak her 1D 1 H NMR spektrumu işlemek için kullanıldı. Spektrumu Fourier, dönüştürülmüş aşamalı ve TMSP tepe (0.0 ppm) başvurulan idi. NMRpipe yazılım paketi, tek tek 2B 1 H-13C NMR spektrumları işlemek için kullanılan ve NMRDraw ile analiz edilmiştir. Bruker FID veri dosyasının ilk NMRpipe tarafından tanınabilir bir dosya biçimine dönüştürülür ve ardından spektrumu Fourier dönüştürüldü, faz düzeltilmiş ve sıfır doldurdu. 1D 1H NMR spektrumu ve 2D 1 H-13C NMR spektrumunda gözlenen NMR zirvelerinin 1 H ve sırasıyla 0.05 ve 0.50 ppm, 13 C kimyasal kayma toleranslar ve Madison Metabolomik Konsorsiyumu Veritabanı (MMCD kullanarak belirli metabolitlerin atanan ) 6 ve İnsan Metabolome Veritabanı. Özellikle 7, 1D ve 2D NMR spektrumları NMR kimyasal vardiya pik liste daha sonra İnsan Metabolome Veritabanı yüklenen nerede, elle pik toplanmış bulunmaktadır. İnsan Metabolome Veritabanı tarafından tanımlanan metabolitleri NMR rezonansı eşleşen ve metabolik ağa mensup sayısını maksimize hem esas NMR spektrumu atanır. Her bileşik veya metabolit genellikle birden CH çiftleri ve buna birden NMR rezonansı vardır. Bu nedenle deneysel NMR spektrum gözlenmiştir, bu NMR rezonansı ve daha çok, daha çok metaboliti bulunmaktadır. Benzer şekilde, aynı yol ile ilişkilendirmek birden metabolitleri tanımlamak doğru atamaları olasılığını artırır. Metabolitleri ve metabolik yolların varlığı Genlere ve genoma (KEGG) 8 Kyoto Ansiklopedisi ve MetaCyc veritabanları ile doğrulanır. 9 Mycobacterium smegmAtis M. için kullanışlı bir model sistemi tüberküloz ve diğer mikobakteriyel patojenler. M. başka yerde tanımlandığı gibi, örnek smegmatis'in da sonication tarafından bozulmuş olabilir. 10.

Şekil 2,
Şekil 2. Mycobacterium tuberculosis hücre ekstresi 1D 1H NMR spektrumu. Metabolitlerinin temsili ile ilişkili NMR zirvelerinin etiketlenir. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: AMP, adenozin mono fosfat, α-Kg, α-ketoglutarat, Glu, L-glutamat ve Ala, alanin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çalışmaların önemli bir kısmı M. Transkriptomik ve proteomik profilleri analiz var in vitro ve in vivo koşullarında çeşitli altında tüberküloz. 11-16 Sonuçta, gen ekspresyonu ve enzim aktivitesinde değişiklikler küçük molekül ağırlıklı moleküllerin konsantrasyonları değişikliklere yol açmaktadır. Bu bileşiklerin tam açıklaması metabolome oluşturmaktadır. Böylece, metabolik yolaklar uyuşturucu ve değişen büyüme koşullarına etkileri metabolomik analizi takip edilebilir. 17,18 Birkaç çal M. metabolik yollar incelemek için bu yöntemin avantajı almış tüberküloz (aşağıya bakınız) ve diğer mikobakteriler, veya M ile enfekte farelerde metabolik değişiklikleri analiz etmek tüberküloz. 19.

Bu metodolojinin bir potansiyel hatadır örnek bazı mikroorganizmalar tamamen lize olmayabilir olmasıdır. Eğer gerekirse, parçalama adım veya bir tekrarlanıriki kez daha. Lizis verimliliği standart bir protein tayini (örneğin, BioRad DC Protein Testi) yaparak izlenebilir. Düşük konsantrasyonlarda mevcut metabolitleri için algılama hassasiyeti artırmak için, pekçok benzer örnekleri (Aşama 8 toplandı), toplanmış liyofilize edildi, ve daha düşük bir hacim içinde tekrar süspanse edilebilir.

Mikobakteriler içinde metabolomik çalışmalar için alternatif numune hazırlama işlemleri tarif edilmiştir. Örnekler, hücre sonication tarafından bozulması, 10,20 boncuk dayak, 20 ve Zirkonya 21 boncuklar ile homojenizasyon bulunmaktadır. Aynı şekilde, ekstraksiyon prosedürleri varyasyonlar asitleştirilmiş asetonitril ve / veya diğer organik solventler kullanılmıştır. 20,22-24 Metabolit kimlik da gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS) dahil olmak üzere çeşitli analitik prosedürler ile, 24 sıvı kromatografisi ile elde edilmiştir kütle spektrometresi (LC-MS), 21,23 ve ters-faz yüksek performans sıvı krommikobakterilerin sitozolik özleri beklenen toplam metabolitlerin sayısı bilinmemesine rağmen matography (rp-HPLC). 25 metabolitlerin sınırlı sayıda da tespit ve direkt enzimatik tayinleri ile ölçülebilir. 26 ve 22 bunu 1,692 metabolitleri Bacillus saptanmıştır olduğunu kaydetti kapiler elektroforez ve MS ile subtilis özler. 27.

Analitik tanımlama ve miktar tayini prosedürlerine ilişkin önemli konular Metz ve ark tarafından gözden geçirilmiştir. NMR teknolojisinin 28 Avantajları numune hazırlama kolaylığı ve işlem tahribatsız doğası vardır. Ancak, sürekli genişleyen olsa bileşiğin tanımlanması için kullanılabilir spektrumları, veri tabanları tam metabolit tespiti için hala yetersizdir. GC-MS ve LC-MS yöntemleri daha ayrıntılı numune hazırlama prosedürleri gerektiren ve büyük sapmalar, zor resul karşılaştırmak için yapım olabilirfarklı laboratuardan ts. Buna ek olarak, GC-MS daha az hassas ölçümü yol açan madde olarak sonuç olarak ortaya çıkan bir kayıp ile birlikte metaboliti türevlendirme gerektirir. Ayrımları geliştirmek ve LC-MS iyonizasyon supresyon ortadan kaldırmak için yöntemler bu problemlerin bazılarının üstesinden gelmek için söz veriyorum. Bununla birlikte, bizim düşüncemize göre, bu dezavantajı yine yakın gelecekte önemli bir sorun olmaya devam edecektir. Ayrıca, bu tür 2D HSQC, 2D J-giderilmiş ve STOCSY deneyler gibi NMR metodolojiler zaten metaboliti teşhisinde artan verimlilik ve doğruluk elde edilir. 29. Bununla birlikte, NMR ve LC-MS prosedürleri tamamlayıcı prosedürler ve kombine bir analizini entegre olması muhtemeldir Bir sistem metabolome. 28

Numune hazırlama işlemleri gibi başka bir yerde tarif, proteomik analizi adapte edilebilir, FastPrep-24 lizis sonrası tampon sistemler ve adımların uygun değişiklikleri, burada açıklanan. 30. Böylece, tüberküloz researchers vahşi tip ve kombine sistem biyolojisi yaklaşımları kapsayacak prosedürleri kullanarak çeşitli koşullar altında yetişen mutant suşlar örnekler analiz edebilir. 31 Bu teknolojiler M. merkezi metabolizma yolları incelemek için vazgeçilmez olduğunun ortaya çıkması tüberküloz, 32 gecikme mekanizmaları ortaya çıkarmak için, daha iyi bir aşı ve antimikobakteriyel ajanlar geliştirmek için gerekli olabilir ki anlaşılması. Bu ihtiyaç özellikle MDR ve XDR tüberküloz kontrol ve tedavi bağlamında, acil. 33,34

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar protokolü geliştirirken yararlı yorumlar için Dr Barletta ve Dr Güçlerin laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz el yazması yararlı tartışmalar ve redaksiyon için Wendy Austin ederim. Bu yazıda anlatılan çalışma Nebraska-Lincoln Redoks Biyolojisi Merkezi (ebeveyn hibe # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) University of Yukarıda listelenen her bir araştırmacı için tohum Pilot hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, araştırma malzemeleri ve bu yayına dahil NMR teknikleri standardize Bay Halouska en kısmi maaş desteği için ona R21 hibe (1R21AI087561-01A1) fon sağlamak için Dr Ofelia Chacon ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics