و خارج الحي متفرقة التحضير Microvessel الهيكل العظمي للتحقيق في التفاعل الأوعية الدموية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

و

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity. J. Vis. Exp. (62), e3674, doi:10.3791/3674 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إعداد microvessel المعزولة هو إعداد الجسم الحي السابق الذي يسمح للفحص من مساهمات مختلفة من العوامل التي اوعية السيطرة، وبالتالي، مقاومة نضح 1-5. هذا هو إعداد الكلاسيكية التجريبية التي كانت، إلى حد كبير، وصفت في البداية من قبل يوشيدا وآخرون. 15 قبل عدة عقود. قدم هذا الوصف الأولي أساسا للتقنيات التي تم تعديلها على نطاق واسع وتعزيزه، في المقام الأول في مختبر الدكتور برايان Duling في جامعة فرجينيا 6-8، ونحن تقديم النهج الحالي في الصفحات التالية. وهذا إعداد تشير بالتحديد إلى شرين الناحلة في الفئران كما microvessel من خيار، ولكن يمكن بسهولة إعداد الأساسية يمكن تطبيقها على السفن معزولة عن الأنسجة الأخرى أو أي ما يقرب من الجهاز عبر الأنواع 9-13. ويمكن بسهولة الميكانيكية (أي الأبعاد) التغييرات في microvessels معزولة يمكن تقييمهاردا على مجموعة واسعة من الفسيولوجية (على سبيل المثال، نقص الأكسجين، والضغط داخل الأوعية الدموية، أو القص) أو التحديات الدوائية، ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة العناصر الميكانيكية التي تضم استجابات متكاملة في حالها، على الرغم من الأنسجة السابقين، الجسم الحي. أهمية هذا الأسلوب هو أنه يتيح للتلاعب السهل من التأثيرات على تنظيم متكامل لقطر microvessel، في الوقت الذي تسمح أيضا للسيطرة على العديد من المساهمات من مصادر أخرى، بما في ذلك الضغط داخل الأوعية الدموية (عضلي)، تعصيب اللاإرادي، الدورة الدموية ( على سبيل المثال، إجهاد القص)، تعتمد على البطانية المنبهات أو مستقل، هرمونية، والتأثيرات متني، لتقديم قائمة جزئية. في ظل الظروف التجريبية المناسبة ومع أهداف مناسبة، وهذا يمكن أن تكون بمثابة ميزة على في الجسم الحي أو في الأعمال التحضيرية للنسيج / عضو في الموقع، التي لا تسمح بسهولة لمراقبة سهلة من المتغيرات أوسع النظامية.

أماهالحد الأردن من إعداد هذا هو في الأساس نتيجة لقوتها. بحكم التعريف، وتجري دراسة سلوك هذه السفن في ظل الظروف التي تم فيها إزالة كثير من أكبر المساهمين في تنظيم مقاومة الأوعية الدموية، بما في ذلك العصبية، الخلطية، التمثيل الغذائي، وما إلى ذلك وعلى هذا النحو، وحذر المحقق لتجنب الإفراط في تفسير واستقراء البيانات التي يتم جمعها باستخدام هذا الإعداد. منطقة أخرى كبيرة من القلق فيما يتعلق بهذا الإعداد هو أنه يمكن أن يكون من السهل جدا إلى تلف المكونات الخلوية مثل بطانة بطانة الأوعية الدموية أو العضلات الملساء، ويمكن عرض هذه أن مصدر متغير من الخطأ. فمن المستحسن أن المحقق فرد الاستفادة من القياسات المناسبة لضمان جودة إعداد، سواء في البدء في التجربة وبشكل دوري طوال فترة بروتوكول.

Protocol

1. قبل التجربة

  1. قبل اليوم تجربة، يتم سحب أنابيب زجاجية الشعرية للأبعاد المناسبة للمحطة في بال micropipettes (إما يمكن استخدام مجتذب أفقي أو عمودي). ويمكن لقطر طرف تعديلها بسهولة اعتمادا على سفينة يجري عزل، على الرغم من أننا عموما استخدام طائفة وقطرها بين 50-150 ميكرون. ويعكف هؤلاء بعد ذلك إلى التكوين المناسب للتدفئة محطة التالية microvessel على لهب غاز البوتان. يتم تقسيم بدنيا نصائح Micropipette إلى القطر التقريبية (مع ملقط غرامة) لmicrovessel في مسألة ويمكن. الأرض أو مصقول على التشكل المناسبة، حسب الضرورة لتطبيق محدد لإجراء استعراض شامل والتي لم يبت في هذه الإجراءات، ويوجه القارئ الى ديفيس وآخرون. 16. ثم توضع في بال micropipettes اثنين من المعارضة في حملة ماصة للغرفة microvessel. يجب أن توجه هذه مثل هذه النصائحهي في نفس الطائرة العمودية والأفقية داخل غرفة السفينة.
    غرفة microvessel المستخدمة في هذه المخطوطة (الشكلان 1 و 2) هو واحد هو أن العرف الذي بناه السيد ديفيد ايك في قسم علم وظائف الأعضاء في كلية الطب في ويسكونسن ( http://www.phys.mcw.edu/ و شبكة الاتصالات العالمية . eicktech.com ). ومع ذلك، تكوينات أخرى عدة من غرفة microvessel متوفرة تجاريا، مع تلك التي وضعتها الأجهزة أنظمة المعيشة ( http://www.livingsys.com/ ) وIonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) كونها شائعة جدا. باستخدام هذه الأنظمة الأخرى، قد يكون من الضروري استخدام مجهر مقلوب بدلا من واحد التقليدية تستقيم، على الرغم من أن هذا يعتمد على تجربة محددة، والاحتياجات من المعدات. فإن استخدام المجاهر المقلوب يكون من الأفضل للprotoc التجريبيةعملية شريان الحياة التي تتطلب التصوير فلوري أو متحد البؤر.
  2. تحضير محلول ملحي الفسيولوجية (PSS؛ المبينة أدناه)، وضمان ضبط درجة الحموضة إلى المستويات الملائمة للظروف تجريبية معينة (7،38-7،42 هو نموذجي ويقع ضمن نطاق الفسيولوجية). قد تكون على استعداد لحل جهاز الأمن الوقائي قبل والمبردة ولكن يجب أن يتم التحقق في درجة حرارة مناسبة للحموضة قبل استخدامها. يمكن أن تحتوي على جهاز الأمن الوقائي الزلال إذا المجرب أو بروتوكولات محددة تتطلب ذلك، على الرغم من أن هذا ليس إلزاميا عالميا.
  3. يجب معايرة الفرجار الفيديو الرقمية المستخدمة لقياس قطر السفينة باستخدام عدادة الكريات أو مجهر ميكرون المرحلة. لمعايرة دقيقة، فمن الأهمية بمكان أن توضع ميكرومتر في الطائرة نفس بال micropipettes تدفق / تدفق في قاعة السفينة.
  4. وينبغي أن الحلقات التعادل لربط microvessel إلى ماصات تكون مستعدة ويمكن الوصول إليها بسهولة لاستخدامها لاحقا. ويمكن بسهولة هؤلاء على استعداد 8-0 أو أصغر ق العيونuture. يمكن إعداد حلقة واحدة التعادل مسبقا وتخزينها في طبق بيتري غطت على شريط صغير من شريط عكس المحيطة شريحة المجهر لحين الحاجة إليها (وهذا سوف تبقي لهم من الضياع). (الشكل 3).

2. يوم من التجربة

  1. وينبغي أن تتحول جميع المعدات في دعم والتحقق من وظيفة مناسبة. ويشمل هذا الجدول anti-vibration/floating وتعميم حمام الماء الساخن (وضعت لتوفير درجة الحرارة المناسبة في حمام السفينة - 37 عادة درجة مئوية)، وجميع محولات الضغط وهجرة غرفة مضخة السفينة (الشكل 1A و 1B). بدوره على موازنة الغازات في قاعة السفينة في وسائل الإرواء والخزانات superfusate.
  2. شغل كل من الخزانات والأنابيب، وغرف مع حل جهاز الأمن الوقائي. يجب أن يكون خط سائل الإرواء مما أدى إلى تدفق ماصة تملأ تماما لتجنب وجود فقاعات الهواء في هذا الخط الذي يمكن أن طرد وتلف زارة شؤون المحاربين القدامىscular البطانة (الشكل 1C). إذا لزم الأمر، واستخدام حقنة لدفع بلطف جهاز الأمن الوقائي على طول الطريق من خلال ماصة للتأكد من أنه كامل تماما ودون أي انسداد التي يمكن أن تعرقل تدفق سائل الإرواء. ينبغي إبقاء الضغط تدفق ضمن حدود معقولة لتجنب إتلاف محولات الضغط.

3. Microvessel حصاد

  1. بعد التخدير للحيوان منه microvessel هو الواجب اتخاذها، ينبغي أن تكون معزولة في مسألة السفينة وفقا للإجراءات التي هي الأنسب لالأوعية الدموية لدراستها. في بعض الحالات، وهذا قد يتطلب إزالة الجهاز نفسه (على سبيل المثال، microvessels الدماغي أو الشريان التاجي)، بينما في حالات أخرى، يمكن إزالة السفن مباشرة من الحيوان تخدير (على سبيل المثال، العضلات). ويقدم مثالا على التوجه للسفينة داخل العضلات الناحلة في الشكل 4. ويقدر طول السفينة في الجسم الحي قبل إزالة مع لCEPS أو الفرجار الصغيرة. قبل ازالة السفينة من الحيوان / الجهاز، ويمكن ان يكون مفيدا جدا لأداء واحد الاختيار النهائي للتأكد من أن الغرفة السفينة جاهز ويعمل بشكل صحيح (بما في ذلك جميع الحلقات التعادل في مكان).
  2. إزالة وعاء من الحيوان / الجهاز بواسطة استيعاب الجانب الخارجي من السفينة في نهاية واحدة مع غرامة ملقط والقطع على طول السفينة حتى أنها حرة، مع الحرص الشديد على تجنب أي الجر أو سحب على متن السفينة. الافراج عن مرة واحدة، ووضع على الفور في أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل مليئة PSS ولكن لا تتركها للسفينة. هذا هو أن نتذكر التوجه، فإن مثل هذا الاتجاه سائل الإرواء في الحمام يكون مطابقا لاتجاه تدفق الدم في الحيوانات.

4. Cannulating سفينة

  1. وضع السفينة في حمام تملأ ويقني؛ يدخل القنية نهاية الداني على تدفق ماصة. إن أفضل طريقة لهذا أن يتحقق مع معدل نضح متواضع من خلال قنية (~ مم زئبق ضغط 50) وتستخدم زوج من ملقط غرامة لاجراء كل جانب من جدار الوعاء الدموي التجويف الداني (أي زوج واحد من الملقط في كل يد). في مختبرنا، ونحن نستخدم ملقط غرامة من أدوات العلم الجميلة ( http://www.finescience.com/Home.aspx )، على الرغم من أن أي ملقط شيدت بشكل مناسب سوف تعمل على نحو فعال. تنزلق السفينة على نصائح قنية ودفع السفينة على الطرف إلى النقطة التي حلقتين التعادل يمكن تأمين السفينة.
  2. رفع ضغط تدفق إلى زئبق 75 ~ لتضخيم مزيد من السفينة وتسهيل إقناء؛ إدخال القنية على الحافة البعيدة ماصة. وينبغي أن ينظر من خلال تدفق السفينة تشويها في الخزان superfusate في تدفق البعيدة للسفينة (تحت المجهر). يقني؛ يدخل القنية نهاية البعيدة للسفينة على ماصة تدفق وضمان الحصول عليها مع حلقات التعادل 2 (وهذه الحلقات النهائية يجب أن تكون في مكان قبل إقناء؛ إدخال القنية، الشكل 5).
  3. ضبط قنية حتى في إحداثيات XYZ كما needeد حتى يكون هناك الحد الأدنى من التشويه في السفينة، والسفينة يقارب في طول الجسم الحي. رفع ضغط تدفق حتى يتم يقارب نسبة الضغط الشرياني يعني شهدت عادة ذلك الجزء السفينة (مختبرنا ويستخدم 80٪ من الضغط الشرياني يعني لالشرايين مقاومة كبيرة من العضلات الناحلة 8).
  4. وضع حجر صغير محتدما تقديم خليط الغاز المناسبة في حمام ومكان غلاف بلاستيكي أو غطاء زجاجي على الحجرة لتجنب الرش على عدسة المجهر. نستخدم حجر محتدما التي تتوفر عادة في جميع الحيوانات الأليفة / متاجر حوض السمك وحوالي 1 سم في القطر، وعلى الرغم من أن حجم أصغر وسوف تعمل بشكل فعال كذلك. وجود حجر محتدما يؤمن المناسبة توافر الغاز الى السفينة في جميع الأوقات، وسوف تمتد صلاحية السفينة. تتم إزالة هذا الحجر خلال جميع فترات القياس (أو تدفق الهواء من خلال حجر توقف مؤقتا) لمنع تشويه للصورة. الافراج عن المشبك على تدفق ماصة وتسمح من خلال تدفق السفينة لمدة 30 دقيقة. دوريا، ينبغي فرضت التدفق في أنابيب تدفق لتحديد ما إذا كانت السفينة تقوم بتطوير نغمة يستريح. يجب فحص جميع السفن من وجود تسرب الضغط في هذه المرحلة. وسوف يكون واضحا التسريبات عن طريق إدخال الضغط المعروفة في الإناء (التي نستخدمها عادة 100-120 مم زئبق)، وتحامل على تدفق، يليه تدفق، وخطوط. إذا كان الضغط داخل اللمعة غير مستقرة، ليست هناك تسريبات واضحة. ومع ذلك، إذا ضغط يبدأ في الانخفاض، تسرب كبير موجود، ويجب أن تكون مغلقة. يمكن عادة التسريبات في تدفق إما أو ماصات تدفق تصحيحه عن طريق إضافة حلقة إضافية حول ربط السفينة على ماصة. بدلا من ذلك، إذا كان وعاء يحتوي على فرع جانب صغير يتم السماح للتسرب، وهذا سوف يؤثر على قدرة السفينة لاحتواء الضغط على نحو فعال، ويمكن أن نقدم مصدرا إضافيا للخطأ. إذا تم تحديد هذا التسرب يمكن، وعادة ما تكون مرتبطة قبالة ثإيث حلقة واحدة من خاط البصريات 10-0. بدلا من ذلك، ضفيرة واحدة مثار 6-0 خياطة لجعل حلقة التعادل هو أيضا فعالة للغاية. إذا لا يمكن أن تسرب الكشف عن هويته، أو لا يمكن أن تكون مرتبطة فعليا (على سبيل المثال، لا يوجد الجذع إلى فرع جانبي ومجرد ثقب في جدار الوعاء الدموي)، وهذا قد يؤدي إلى إنهاء مبكر للتجربة واستخدام وعاء البديل أصبح من الضروري (وهذا هو عموما السفينة متطابقة في الساق الأخرى - أو الجانب المقابل إذا لزم الأمر - من الحيوان).

    وينبغي أن يسمح للسفينة لكي تتوازن تحت أي ظروف تدفق مدة لا تقل عن 30 دقيقة. ويتم إجراء جميع التجارب تحت أي ظروف تدفق. وبمجرد أن السفينة قد وضعت لهجة مرضية وتستجيب لمعايير الاشتمال للتجربة في مسألة ما، والسفينة ليست على استعداد لدراسة لاحقة.

    ويمكن لهذه المعايير تختلف تبعا لتضمين بروتوكول التجريبية محددة ومحقق. في مختبرنا، ونحن بشكل روتيني التحريرilize ما يلي:
    1. نشط لهجة من> 30٪ (الحد الأقصى المحسوبة على النحو X ΔD / D 100، حيث ΔD هو زيادة في تصلب قطر الجدار الداخلي من القيم تحت ضغط موازنة ردا على التعرض لكا 2 + خالية من جهاز الأمن الوقائي والحد الأقصى هو الحد الأقصى D قطر يقاس في موازنة الضغط في جهاز الأمن الوقائي الكالسيوم + خالية 2).
    2. عضلي التنشيط (صيانة، أو يفضل أن يكون التخفيض في القطر شريني مع الضغط المتزايد داخل اللمعة) وذلك في مؤشر قابلة للحياة وعائي طبقة العضلات الملساء.
    3. بطانة صالحة البطانية، كما يتضح من استجابة موسع السريع إلى أستيل كولين (10 -6 M في الحمام).
    4. يمكن إضافة معايير الاشتمال إضافية لتتناسب مع بروتوكول معين التجريبية حسب الحاجة، بما في ذلك ردود المضيقة إلى منبهات الأدرينالية مثل فينيليفرين (10 -7 M)، والاستجابات الموسع للمحفزات إضافية مثل الأدينوزين (10 -5 2 في موازنة غاز).
  5. المقطع التالي هو مثال على "تجربة وهمية". وتعد كل الحلول المطلوبة حسب الاقتضاء، مع الاهتمام الاعتبار عامل تخفيف من جهاز الأمن الوقائي في قاعة السفينة. كمثال على ذلك، بالنسبة لبعض المعدات لدينا، وحجم الدائرة السفينة هو 20 مل. كما ميكرولتر، مثل 20 من 10 -2 النتائج M حل الأوراق المالية في تركيز فعال من M -5 10 في السفينة غرفة حمام. بعد إزالة السفينة، وموازنة، إقناء؛ إدخال القنية والمصادقة على النحو الموصوف أعلاه، فإن التجربة هي على استعداد لبدء. تفاصيل مثل التوزيع العشوائي العلاج وفعالية محددة التجربة، وسوف تستهلك مساحة المفرط لهذا الجهد. على هذا النحو، لا يتم تضمين هذه بالتفصيل.

    ويتم تحديد الاستجابات الرقابة الأولية. للحصول على حافز سبيل المثال الفسيولوجية مثل تفعيل المنشأ العضلي (الضغط الناجم عن انقباض)، intralumenal العلاقات العامةيتم تبديل عشوائيا essure على المدى المطلوب، ويتم السماح للسفينة فترة مناسبة من الوقت للرد (في هذه الحالة، فإننا سوف تسمح لفترة دقيقة 5-7). للحصول على حافز سبيل المثال الدوائية مثل التحدي مع أستيل، يضاف المخدرات إلى الجزء الخلفي من الحلول الأوراق المالية في ترتيب عشوائي. في هذه الحالة، ونحن عادة استخدام مجموعة من 10 -9 م -5 إلى 10 في الحمام، مع إخفاق يتم تعريفه على أنه إعادة موازنة قطر. كما أستيل كولين هو وكيل يتصرف بسرعة، ويمكن بسهولة الردود موسع القصوى أن يتحقق في بضع ثوان فقط. يمكن للعوامل أخرى (مثل الببتيدات) يستغرق وقتا أطول للحصول على رد والقصوى. هذا كثيرا أن تؤخذ بعين الاعتبار، وكذلك الفترة الزمنية التي اتخذت لتبييض فعال مرة واحدة وقد تم جمع استجابات السيطرة، ولا يمكن فرضها تدخلات محددة على النظام، بما في ذلك حضانة للسفينة مع مستقبلات / الخصوم، والوكلاء الذين يتصرفون في القنوات الأيونية محددة، وبتحريض منداخل اللمعة الضغط تتغير الاختلافات في موازنة الغازات أو وكلاء الدوائية التي تستهدف النظم الأنزيمية محددة، وهذا غيض من فيض من التدخلات الأكثر شيوعا.

    بعد الوقت المناسب للتدخل لتكون فعالة (والتي يجب أن تختبر بشكل مناسب)، يمكن الشروع في جولة لاحقة لجمع البيانات. اعتمادا على بروتوكول التجريبية محددة، ولا يمكن فرضها تدخلات لاحقة على متن السفينة أو يمكن إزالة أول (إما عن طريق تبييض - إزالة أو بسيطة من التحدي الفسيولوجية - عندما يكون ذلك ممكنا). وبمجرد أن السفينة قد عادت الى الدولة موازنة لها (والتي ينبغي التحقق منها)، يمكن تطبيق تدخلات لاحقة حسب الحاجة مع البيانات الإضافية التي تم جمعها. من الممكن أن يستمر هذا الإجراء العامة حتى انتهاء التجربة أو حتى نوعية إعداد السفينة إلى أقل من عتبة المعايير التي سبق تحديدها (على سبيل المثال، ردا على ناهض أو القدرة على تطوير لهجة نشطة كافية). في هذه النقطة، يتم إما خلصت التجربة، أو المحقق قد ترغب في جمع البيانات التي هي مستقلة عن التفاعل من السفينة معزولة (مثل الميكانيكا من جدار الوعاء الدموي، والتي يمكن أن تتم باستخدام الإجراء متطابقة تفعيل المنشأ العضلي، فقط مع سفينة تفتقر إلى كل نغمة نشط 14).
  6. التنظيف المنتظم لجميع معدات ضرورية لإزالة تراكم الملح ومنع نمو أي كيانات البيولوجية غير مرغوب فيه. في نهاية كل يوم تجربة، كحد أدنى، يتم مسح كل الخطوط تماما وغرف جهاز الأمن الوقائي مع كميات وفيرة من الماء المقطر أو دي المتأينة، وسمح لتجف تماما. بعد كل 2-3 أيام من الاستخدام، ويتم تنفيذ عملية غسيل مع الكحول الإيثيلي، وكذلك يسمح للمعدات لتجف تماما. في نهاية كل أسبوع من الاستخدام المتواصل، تمتلئ جميع خطوط وغرف مع حمض الهيدروكلوريك 0،1 متر، يسمح لل"احتضان" لمدة 30 دقيقة ثم يغسل بالماء تماما على النحو الوارد أعلاه. وأخيرا، فيبعد نهاية 2-3 أسابيع من استخدام متتالية، يتم استبدال جميع قطاعات الأنابيب مع الجديد ويتم تنظيف الغرفة والخزانات مع 1.0 M حمض الهيدروكلوريك واسعة النطاق من قبل الشطف مع المقطر / دي المتأينة المياه. إذا كان أي تغيير اللون من إنشاء أنابيب أو المرئية من النمو في الأنابيب أو أي عنصر من عناصر الدائرة / الخزانات، واستبدال هذه فإما أن تكون أو تنظيفها، حسب الاقتضاء. مع التنظيف المنتظم والصيانة العامة، لا يمكن للمعدات تستمر لفترة طويلة جدا. في وقت كتابة هذا التقرير، وغرف السفينة لدينا جميعا في ال 8 أو 9 سنوات عشر من الاستخدام الروتيني والتي شهدناها لا يجد صعوبة كبيرة معهم.

5. ممثل النتائج

رقم 1A
رقم 1A. وهذا الرقم يمثل محطة microvessel الأساسية الإعداد. وتلفزيون = لسفينة يشاهدون؛ B = الفرجار الرقمية؛ حقنة = C لدفع superfusate عبتي ough ماصة تدفق حسب الضرورة؛ D = عمود الهيدروستاتيكي لتغيير سائل الإرواء ضغط تدفق؛ E = المجهر، F = microvessel غرفة، G = superfusate خزان، H = مراقبة ضغط (يمكن أن تضاف متعددة حسب الضرورة)، وأنا = استنزاف غرفة microvessel مضخة لل superfusate؛ J = خليط الغاز خزان موازنة، K = النفايات الواردة (على superfusate)؛ L المياه المتداولة = سخان؛ M جدول anti-vibration/floating =.

الشكل 1B
1B شخصية. وهذا الرقم يمثل أقرب نظرا للإعداد غرفة microvessel. في هذا الرقم، E = المجهر، F = microvessel غرفة؛ H مراقبة ضغط = (في حين نعرض واحدة فقط عن البساطة، ويمكن أن تضاف إلى العديد من مواقع مختلفة حسب الضرورة)، وأنا = استنزاف غرفة microvessel مضخة، ن = الأنابيب التي تعلق على منذ بداية ماصة تدفق سائل الإرواء (استمرارا من "دال" في الشكل 1A)، O = الأنابيب التي تعلق على ماصة تدفق سائل الإرواء.

الطبقة = "jove_content"> رقم 1C
رقم 1C. وهذا الرقم يمثل الأقرب نظرا لغرفة microvessel. في هذا الرقم، N = خط سائل الإرواء (أي الأنابيب يعلق مباشرة على ماصة تدفق سائل الإرواء)؛ O = أنابيب يعلق مباشرة على ماصة تدفق سائل الإرواء، P = الضوابط موقع الأفقي والرأسي للماصة تدفق؛ س = للsuperfusate استنزاف للحمام الماء (متصلة "أنا" في 1A أرقام و1B)؛ R = تدفق للحمام المياه القادمة من الخزان (متصلة 'G' في 1A الشكل).

الشكل 2
الشكل 2. وهذا الرقم يمثل التمثيل التخطيطي لتدفق السوائل والغازات في النظام. في هذا الشكل، خط = superfusate PSS تدفق، B = خط سائل الإرواء PSS إلى ماصة تدفق؛ C = استنزاف superfusate PSS من حمام إلى حاوية النفايات، D = PSS سائل الإرواء من تدفق تدفق ماصة؛ E = إدخال الماء الساخن إلى سترة غرفة؛ F = خرج الماء الساخن من غرفة سترة.

الشكل (3)
3 الرقم وهذا الرقم يمثل التعادل فرد حلقات مصنوعة من خاط العيون (ينظر اليها من خلال مجهر تشريح مع العدسات 10X والتكبير 4.5x زوم قابل للتعديل، لوحة أ) التي يتم استخدامها في إعداد لدينا وتخزين متعددة الحلقات التعادل 8-0 و10-0 خياطة على الشريط عكس حول شريحة المجهر التي يتم تخزينها في طبق بيتري المغطاة (لتجنب فقدان لهم؛ لوحة B).

الشكل 4
4 الشكل. وهذا الرقم يعطي صورة (ينظر من خلال المجهر معيار تشريح) من مقاومة الناحلة شرين العضلات قبل العزلة الجراحية وإزالة للسماح التوجه المكاني المناسب.

ve_content "> الشكل 5
الشكل 5. وهذا الرقم يوفر صورة ممثل microvessel مقنى. لوحة ويظهر على طول السفينة، مع كل من تدفق (A) وتدفق (B) الماصات وكذلك حلقات التعادل (C) هو مبين. لوحة (ب) يقدم صورة في تضخم عالية، والتي تبين بشكل واضح عزم قطر الداخلية شريني مع الفرجار الرقمية (في هذه الحالة القطر هو 112 ميكرون).

الشكل (6)
الشكل (6). وهذا الرقم يمثل صورا ممثل موازنة microvessel التالية مقنى. صورة أعلى هو وعاء تحت السيطرة، unstimulated الظروف في الضغط موازنة، الصورة في المنتصف هو من السفينة نفسها بعد تمدد لتحدي مع أستيل كولين (10 -6 M في الحمام)، والصورة النهائية هي تلك السفينة بعد constriction لتحدي مع فينيليفرين (10 -7 M في الحمام).

الشكل 7
. الشكل 7 هذا الرقم يلخص ردود 1 microvessel المعزولة في الاستجابة لتحدي مع: نقص الأكسجة (لوحة A، انخفاضا في وسائل الإرواء superfusate ص 2 في نظامنا من 135 مم زئبق ~ 40 ~ لملم زئبقي)، زيادة تركيزات أستيل (لوحة B)، والتغيرات في الضغط داخل الأوعية الدموية في ظل ظروف الرقابة وحضانة التالية للسفينة مع جهاز الأمن الوقائي خالية من الكالسيوم (لوحة C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول قدم يصف إقناء؛ إدخال القنية العزلة، وإزالة مزدوج من microvessel العضلات والهيكل العظمي، على الرغم من أن هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة العامة لمعظم الأنسجة. لمخطوطة الحالية، وقد استخدم مصطلح "شرين" من قبل المؤلفين لوصف سفينة مقاومة تتراوح بين 70-120 ميكرون في القطر تحت نغمة نشط الراحة، والتي هي أيضا مساهما رئيسيا في تنظيم مقاومة نضح لجهاز أو الأنسجة.

مع بعض التعديلات، ويمكن تركيب هذا النظام على العديد من التطبيقات للمحقق معين، ويسمح بسهولة لدمج تقنيات إضافية لتوفير مزيد من التجريب في عمق (على سبيل المثال، واستخدام الأقطاب الكهربائية عبر الغشاء لتحديد إمكانية غشاء 17). وثمة خطوة حاسمة في إعداد الأساسية وتأمين دائما أن يقابل جيدا الماصات تدفق وتدفق التي يتم استخدامها ليقني؛ يدخل القنية السفينة، لا تزال واضحة، والسماح للإلى الإبقاء على التدفق والضغط بطريقة سهلة. عندما الماصات انسداد مع قطعة دقيقة من الحطام، قد يكون من الضروري أن تقطع قطع صغيرة جدا من النصائح لاستعادة التدفق. إذا كان الباحث غير دقيق، يمكن إعادة استخدامها الماصة عدة مرات حتى وصولها إلى نقطة حيث أنهم إما لا يمكن unclogged أو بأقطار كبيرة بما فيه الكفاية أن إقناء؛ إدخال القنية من السفينة يصبح من الصعب للغاية. ومع ذلك، مع التمكن من إعداد هذه العمليات الجراحية والتجريبية، والحرص على الاهتمام بالتفاصيل، وإدخال التعديلات المناسبة التي تتناسب مع الظروف والمتطلبات المحددة، يمكن للمحققين تقييم بسهولة تحديد مسارات تفاعل الأوعية الدموية في استجابة لعدد لا يحصى من التحديات الفسيولوجية والدوائية. هذا سوف يسمح أيضا إعداد المحقق إلى إجراء تحليلات أساسية عن التعديلات في الميكانيكا جدار الأوعية الدموية في ظل ظروف لا توجد نغمة نشط 14. هذا هو في الواقع تقنية قوية جدا وقابلة للتكيف واحد هو أنويمكن بسهولة أن تستخدم للتطبيقات التي تغطي مجموعة من دراسة الآلية التفصيلية إلى الإنتاجية العالية عروض من استجابات أكثر الأساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأميركية (EIA 0740129N)، والمعاهد الوطنية للصحة T32 HL90610.

References

  1. Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. 1-18 (2009).
  2. Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
  3. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
  4. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
  5. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
  6. Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  7. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  8. Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
  9. LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
  10. Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
  11. Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
  12. Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d'Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
  13. Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
  14. Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
  15. Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. solated Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. 32, CRC Press, Inc. 435-456 (1995).
  16. Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics