पूर्व vivo पृथक संवहनी जेट की जांच के लिए कंकाल Microvessel तैयारी

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Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity. J. Vis. Exp. (62), e3674, doi:10.3791/3674 (2012).

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Abstract

Protocol

1. प्रयोग करने के लिए पहले

  1. प्रयोग दिन से पहले, स्टेशन के लिए उपयुक्त आयाम के गिलास केशिका ट्यूब micropipettes (या तो क्षैतिज या अनुलंब डांड़ी इस्तेमाल किया जा सकता है) में खींच रहे हैं. टिप व्यास आसानी से किया जा रहा है अलग पोत के आधार पर समायोजित कर सकते हैं, हालांकि हम आम तौर पर 50-150 माइक्रोन बीच एक व्यास रेंज का उपयोग करें. इन तो एक ब्यूटेन लौ पर microvessel स्टेशन निम्नलिखित हीटिंग के लिए उपयुक्त विन्यास के लिए तत्पर हैं. Micropipette सुझावों को शारीरिक रूप से लगभग व्यास टूट रहे हैं (ठीक संदंश के साथ) सवाल में microvessel के लिए और जमीन या उपयुक्त रचना, के रूप में विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए आवश्यक करने के लिए पॉलिश कर सकते हैं. इन प्रक्रियाओं पर एक व्यापक और बकाया समीक्षा के लिए, पाठक डेविस एट अल के लिए निर्देश दिया है 16. दो micropipettes तो microvessel कक्ष के लिए विंदुक धारकों में विपक्ष में रखा है. इन उन्मुख होना चाहिए कि इस तरह के सुझावपोत कक्ष के भीतर एक ही ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज विमान में हैं.
    microvessel इस पांडुलिपि (आंकड़े 1 और 2) में इस्तेमाल किया कक्ष है कि फिजियोलॉजी विभाग में Wisconsin के मेडिकल कॉलेज में (श्री डेविड Eick द्वारा बनाया गया कस्टम है http://www.phys.mcw.edu/ और www. eicktech.com. ). हालांकि, कई अन्य विन्यास microvessel कक्ष के आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रहने वाले सिस्टम (एएमयू द्वारा विकसित उन लोगों के साथ कर रहे हैं http://www.livingsys.com/ ) और (IonOptix http://www.ionoptix.com/ ) बहुत आम जा रहा है. इन अन्य प्रणालियों का प्रयोग, यह एक औंधा के बजाय एक पारंपरिक ईमानदार एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए, हालांकि इस विशिष्ट प्रयोग और उपकरणों की आवश्यकताओं पर निर्भर है आवश्यक हो सकता है. उलटा माइक्रोस्कोप के उपयोग प्रयोगात्मक protoc के लिए बेहतर होगाफ्लोरोसेंट या confocal इमेजिंग की आवश्यकता ols.
  2. एक शारीरिक नमक समाधान (पी एस एस, नीचे उल्लिखित) तैयार है और यह सुनिश्चित करें पीएच विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के (7.38-7.42 ठेठ और शारीरिक सीमा के भीतर गिर जाता है) के लिए उपयुक्त स्तर के लिए सेट कर दिया जाता है. PSS के समाधान पहले से और प्रशीतित तैयार किया जा सकता है, लेकिन पीएच उपयोग पूर्व के लिए उचित तापमान पर जाँच की जानी चाहिए. PSS के albumin शामिल अगर experimenter या विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता है, हालांकि इस सार्वभौमिक अनिवार्य नहीं है.
  3. डिजिटल वीडियो पोत व्यास को मापने के लिए इस्तेमाल किया कैलिपरस एक hemocytometer या मंच खुर्दबीन सुक्ष्ममापी का उपयोग कर calibrated किया जा चाहिए. सही अंशांकन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सुक्ष्ममापी इनफ्लो / पोत कक्ष में बहिर्वाह micropipettes के रूप में एक ही विमान में रखा जाना है.
  4. Pipettes के लिए microvessel संलग्न करने के लिए टाई छोरों तैयार हो सकता है और बाद में उपयोग के लिए आसानी से सुलभ होना चाहिए. ये आसानी से 8-0 या छोटे नेत्र है से तैयार किया जा सकता हैuture. एकल टाई पाश पहले से तैयार किया जा सकता है और एक कवर एक खुर्दबीन स्लाइड के आसपास जब तक की जरूरत है (यह उन्हें खो दिया जा रहा से रखेंगे) उलट टेप की एक छोटी पट्टी पर पेट्री डिश में संग्रहीत. (चित्रा 3).

2. प्रयोग का दिन

  1. सभी का समर्थन उपकरण पर दिया जाना चाहिए और समुचित कार्य के लिए जाँच. सभी दबाव transducers पोत कक्ष नाली पंप (चित्र 1 ए और 1 बी) - यह anti-vibration/floating मेज और परिसंचारी गर्म पानी से स्नान (37 सामान्यतः डिग्री सेल्सियस पोत स्नान में उचित तापमान प्रदान करने के लिए सेट) भी शामिल है. पोत कक्ष में और perfusate और superfusate जलाशयों में गैसों के संतुलन पर बारी.
  2. जलाशयों, ट्यूब, और पी एस एस समाधान के साथ कक्षों के सभी भरें. perfusate इनफ्लो विंदुक के लिए अग्रणी लाइन पूरी तरह से इस लाइन में हवाई बुलबुले की उपस्थिति जो जगह देना और VA के खराब कर सकती हैं से बचने के लिए भरा होना चाहिएscular endothelium (चित्र 1C). यदि आवश्यक हो, एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए धीरे PSS के लिए बीमा है कि यह पूरी तरह से भरा हुआ है विंदुक के माध्यम से और कि perfusate प्रवाह में बाधा सकता है कोई रुकावट के बिना सभी तरह धक्का. दबाव transducers हानिकारक से बचने के इनफ्लो दबाव उचित सीमा के भीतर रखा जाना चाहिए.

3. Microvessel संचयन

  1. पशु microvessel जिसमें से लिया जा रहा है की anesthetizing के बाद प्रश्न में पोत प्रक्रियाओं है कि सबसे अधिक अध्ययन किया जा vasculature को उचित कर रहे हैं के अनुसार अलग किया जाना चाहिए. कुछ मामलों में, यह अंग ही (जैसे, मस्तिष्क या कोरोनरी microvessels) के हटाने की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य लोगों में, वाहिकाओं संवेदनाहृत पशु से सीधे हटाया जा सकता है (जैसे, मांसपेशियों में) हो सकता है. चित्रा 4 में gracilis मांसपेशी भीतर पोत के उन्मुखीकरण का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. Vivo में पोत की लंबाई के लिए के साथ हटाने के लिए पूर्व का अनुमान लगाएँceps या छोटे कैलिपरस. पशु / अंग से पोत को हटाने से पहले, यह बहुत सहायक हो करने के लिए एक अंतिम जांच करने के लिए कुछ है कि पोत कक्ष तैयार है और ठीक से कार्य (जगह में सभी टाई छोरों सहित) बनाना कर सकते हैं.
  2. पशु / अंग से ठीक संदंश के साथ अंत में एक पोत के बाहरी पक्ष और लोभी पोत की लंबाई के साथ काटने जब तक यह मुफ्त है, चरम देखभाल करने के लिए किसी भी tugging की या पोत पर खींच से बचने के द्वारा पोत निकालें. एक बार मुक्त, तुरंत यह एक 1.7 एमएल अपकेंद्रित्र PSS के साथ भरा ट्यूब में डाल दिया लेकिन पोत के चलते नहीं. इस उन्मुखीकरण याद है, स्नान में इस तरह कि perfusate दिशा जानवर में रक्त प्रवाह की दिशा के लिए समान हो जाएगा.

4. पोत Cannulating

  1. भर स्नान में पोत प्लेस और इनफ्लो विंदुक पर प्रॉक्सिमल अंत cannulate हैं. यह सबसे अच्छा प्रवेशनी के माध्यम से एक मामूली छिड़काव दर (~ 50 mmHg दबाव) और के साथ पूरा किया जा सकता हैठीक है संदंश की एक जोड़ी को समीपस्थ पोत लुमेन दीवार (यानी, एक हाथ में एक संदंश की जोड़ी) के प्रत्येक पक्ष पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया. हमारी प्रयोगशाला में, हम ठीक विज्ञान उपकरण (से ठीक संदंश उपयोग http://www.finescience.com/Home.aspx ), हालांकि किसी भी उचित निर्माण संदंश प्रभावी ढंग से काम करेंगे. पर्ची प्रवेशनी सुझावों पर पोत और इस मुद्दे पर जहां दो छोरों के टाई पोत को सुरक्षित कर सकते हैं टिप पर पोत अग्रिम.
  2. ~~ 75 mmHg इनफ्लो दबाव पोत के लिए आगे बढ़ और बाहर विंदुक टिप पर केन्युलेशन की सुविधा उठाएँ. पोत के माध्यम से प्रवाह पोत के बाहर का बहिर्वाह (खुर्दबीन के नीचे) पर superfusate जलाशय में एक विकृति के रूप में देखा जाना चाहिए. बहिर्वाह विंदुक पर पोत के बाहर का अंत Cannulate और यह दो टाई छोरों (इन अंतिम छोरों में केन्युलेशन से पहले होना चाहिए, चित्रा 5) के साथ सुरक्षित है.
  3. Neede के रूप में XYZ निर्देशांक में जब तक प्रवेशनी समायोजितघ जब तक जहाज में कम से कम विरूपण है, और पोत vivo लंबाई में करीब है. इनफ्लो दबाव उठाएँ जब तक यह मतलब धमनी दबाव आम तौर पर कि पोत खंड (हमारी प्रयोगशाला gracilis मांसपेशी के 8 बड़े प्रतिरोध arterioles के लिए मतलब धमनी दबाव के 80% का इस्तेमाल) के द्वारा अनुभव का प्रतिशत करीब है.
  4. एक छोटे से बुदबुदाती स्नान और जगह प्लास्टिक की चादर के या खुर्दबीन लेंस splashing से बचने के लिए कक्ष पर एक गिलास को कवर में उचित गैस मिश्रण देने पत्थर रखें. हम एक बुदबुदाती पत्थर है कि सामान्यतः सभी पालतू / एक्वैरियम दुकानों में उपलब्ध है और व्यास में लगभग 1 सेमी का उपयोग करते हैं, हालांकि एक छोटे आकार के रूप में प्रभावी रूप में अच्छी तरह से काम करेगा. बुदबुदाती पत्थर की उपस्थिति हर समय पोत के लिए उपयुक्त गैस की उपलब्धता सुनिश्चित करता है और पोत व्यवहार्यता का विस्तार होगा. यह पत्थर सभी माप अवधि (या अस्थायी रूप से बाधित पत्थर के माध्यम से हवा का प्रवाह) के विरूपण को रोकने के दौरान हटा दिया हैछवि. बहिर्वाह विंदुक पर दबाना छोड़ दें और 30 मिनट के लिए पोत के माध्यम से प्रवाह की अनुमति. समय समय पर, प्रवाह बहिर्वाह टयूबिंग पर clamped किया जाना चाहिए निर्धारित करने के लिए अगर पोत आराम स्वर के विकसित कर रहा है. सभी जहाजों इस बिंदु पर दबाव लीक के लिए जाँच की जानी चाहिए. लीक पोत में एक ज्ञात दबाव (हम आमतौर पर 100-120 mmHg का उपयोग करें) शुरू करने और बहिर्वाह clamping के, इनफ्लो लाइनों के बाद से स्पष्ट हो जाएगा. यदि intraluminal दबाव स्थिर है, वहाँ कोई प्रत्यक्ष लीक कर रहे हैं. हालांकि, अगर दबाव गिर करने के लिए शुरू होता है, एक महत्वपूर्ण रिसाव मौजूद है और बंद किया जाना चाहिए. या तो इनफ्लो या बहिर्वाह pipettes पर लीक सामान्य रूप से एक अतिरिक्त विंदुक पर पोत के चारों ओर बंधा पाश जोड़कर सुधारा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अगर एक पोत है कि रिसाव की अनुमति है एक छोटा सा पक्ष शाखा है, इस पोत की क्षमता दबाव प्रभावी होते हैं और त्रुटि के लिए एक अतिरिक्त स्रोत लागू कर सकते हैं समझौता होगा. यदि यह रिसाव की पहचान की है, यह सामान्य रूप से डब्ल्यू बंद बंधे किया जा सकता हैith 10-0 ऑप्थाल्मिक सीवन के एक पाश. वैकल्पिक रूप से, एक एकल सीवन 6-0 से छेड़ा टाई पाश बनाने किनारा भी अत्यधिक प्रभावी है. यदि रिसाव या नहीं पहचाना जा बंद नहीं कर सकते हैं प्रभावी ढंग से बंधे (उदाहरण के लिए, वहाँ पक्ष शाखा और बस पोत दीवार में एक छेद के लिए कोई ट्रंक है) कर सकते हैं, इस प्रयोग के एक समयपूर्व समाप्ति में परिणाम और एक वैकल्पिक बन पोत का उपयोग कर सकते हैं आवश्यक (यह आम तौर पर दूसरे पैर में समान पोत है या यदि आवश्यक contralateral ओर पशुओं के).

    पोत के लिए 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोई प्रवाह शर्तों के तहत संतुलित करना करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. सभी प्रयोगों कोई प्रवाह शर्तों के तहत आयोजित की जाती हैं. एक बार पोत संतोषजनक टोन विकसित की है और प्रश्न में प्रयोग के लिए शामिल किए जाने के मापदंड के लिए उत्तरदायी है, पोत बाद के अध्ययन के लिए तैयार है.

    ये शामिल किए जाने के मापदंड के विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और अन्वेषक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित utनिम्नलिखित ilize:
    1. > 30% (/ ΔD डी अधिकतम x 100 है, जहां ΔD संतुलन दबाव में मूल्यों से arteriolar भीतरी दीवार व्यास में 2 Ca पी एस एस + मुक्त और डी अधिकतम करने के लिए जोखिम के जवाब में वृद्धि के रूप में गणना की अधिकतम सक्रिय स्वर व्यास सीए 2 + मुक्त PSS के संतुलन दबाव में) में मापा.
    2. Myogenic सक्रियण एक व्यवहार्य संवहनी चिकनी मांसपेशी परत के एक सूचकांक के रूप में (के रखरखाव, या अधिमानतः में, बढ़ intraluminal दबाव के साथ arteriolar व्यास कमी).
    3. एक व्यवहार्य endothelial अस्तर, के रूप में एक तेज फैलनेवाली पेशी acetylcholine की प्रतिक्रिया (10 में स्नान -6 एम) द्वारा evidenced.
    4. अतिरिक्त शामिल किए जाने के मापदंड के विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में की जरूरत है phenylephrine जैसे एड्रीनर्जिक agonists (10 -7 एम), adenosine के रूप में अतिरिक्त उत्तेजनाओं (-5 10 फैलनेवाली पेशी प्रतिक्रियाओं कंस्ट्रिकटर प्रतिक्रियाओं सहित, सूट करने के लिए जोड़ा जा सकता है (2 हे 0% में संतुलन गैस में कमी).
  5. निम्नलिखित खंड एक "नकली" प्रयोग का एक उदाहरण है. सभी आवश्यक समाधान के रूप में उपयुक्त पोत कक्ष में PSS के कमजोर पड़ने कारक खाते के लिए भुगतान ध्यान के साथ तैयार हैं. एक उदाहरण के रूप में, हमारे उपकरणों में से कुछ के लिए, पोत कक्ष की मात्रा 20 मिलीग्राम है. के रूप में इस तरह के, एक 10 पोत कक्ष स्नान में 10 एम -5 के एक प्रभावी एकाग्रता में -2 एम स्टॉक समाधान परिणाम के 20 μl. पोत को हटाने, केन्युलेशन, संतुलन, और सत्यापन के रूप में ऊपर वर्णित के बाद, प्रयोग शुरू करने के लिए तैयार है. उपचार randomization और प्रभाव के रूप में विशेष प्रयोग विशिष्ट हैं और इस प्रयास के लिए अत्यधिक अंतरिक्ष भस्म हो जाएगा. जैसे, इन विस्तार में शामिल नहीं हैं.

    प्रारंभिक नियंत्रण प्रतिक्रिया निर्धारित कर रहे हैं. Myogenic (कसना दबाव से प्रेरित) सक्रियण, intralumenal जनसंपर्क के रूप में एक उदाहरण शारीरिक उत्तेजना के लिएessure वांछित सीमा पर बेतरतीब ढंग से बदल रहा है, और पोत के समय का एक उचित अवधि की अनुमति दी है का जवाब (इस मामले में, हम एक 5-7 मिनट की अवधि की अनुमति होगी). Acetylcholine साथ चुनौती के रूप में एक उदाहरण औषधीय प्रोत्साहन के लिए, नशीली दवाओं के एक यादृच्छिक क्रम में शेयर समाधान से वापस करने के लिए जोड़ा जाता है. इस मामले में, हम सामान्य रूप से 10 -9 से स्नान में 10 एम -5 सीमा का उपयोग किया जा रहा है संतुलन व्यास की बहाली के रूप में परिभाषित वार्शआउट साथ,. के रूप में acetylcholine की एक तेजी से अभिनय एजेंट है, अधिक से अधिक फैलनेवाली पेशी प्रतिक्रिया आसानी से केवल कुछ ही सेकंड में हासिल किया जा सकता है. अन्य एजेंट (जैसे पेप्टाइड के रूप में) बहुत लंबे समय तक लेने के लिए प्रकाश में लाना कर सकते हैं अधिक से अधिक प्रतिक्रिया और यह बहुत खाता है, के रूप में अच्छी तरह से प्रभावी वार्शआउट के लिए ले लिया समय अवधि में ले लिया. एक बार नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को एकत्र किया गया है, विशिष्ट उपायों सिस्टम पर लगाया जा सकता है जहाज के रिसेप्टर agonists / गरम, विशिष्ट आयन चैनल में अभिनय एजेंटों की शह के साथ ऊष्मायन सहित,बदल intraluminal दबाव, संतुलन गैसों या औषधीय विशिष्ट एंजाइमी सिस्टम पर लक्षित एजेंटों में मतभेद, सबसे आम उपायों के कुछ नाम.

    हस्तक्षेप के लिए एक उचित समय के बाद प्रभावी होने के लिए (जो उचित रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए), डेटा संग्रह के बाद के दौर शुरू किया जा सकता है. विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, बाद में हस्तक्षेप पोत पर लगाया जा सकता है या पहले (या तो वार्शआउट द्वारा जब संभव शारीरिक चुनौती से निपटने के लिए या साधारण हटाने) हटाया जा सकता है. एक बार पोत अपने संतुलन राज्य (जो सत्यापित किया जाना चाहिए) के लिए वापस आ गया है, बाद में हस्तक्षेप के रूप में अतिरिक्त डेटा एकत्र के साथ की जरूरत लागू किया जा सकता है. यह सामान्य प्रक्रिया के प्रयोग की समाप्ति तक जारी रखा जाएगा या जब तक पोत तैयारी की गुणवत्ता नीचे पहले से निर्धारित सीमा मापदंड गिर जाता है (जैसे, एक agonist या पर्याप्त सक्रिय टोन को विकसित करने की क्षमता के जवाब). इस बिंदु पर, प्रयोग, या तो निष्कर्ष निकाला है या अन्वेषक के लिए डेटा है कि अलग पोत (जैसे पोत दीवार के यांत्रिकी, जो myogenic सक्रियण के समान प्रक्रिया का उपयोग किया जा सकता है बस के रूप में की जेट की स्वतंत्र है इकट्ठा करने के लिए इच्छा हो सकती है पोत सभी सक्रिय 14 स्वर) की कमी के साथ.
  6. उपकरणों के सभी नियमित सफाई नमक buildup के हटाने और किसी भी अवांछित जैविक संस्थाओं के विकास की रोकथाम के लिए आवश्यक है. हर प्रयोग दिन के अंत में, एक न्यूनतम पर, सभी लाइनों और कक्षों को पूरी तरह से आसुत या de-ionized पानी की प्रचुर मात्रा के साथ पी एस एस के प्लावित और पूरी तरह से सूखे की अनुमति दी. इस्तेमाल की हर 2-3 दिनों के बाद, एथिल शराब के साथ एक धोने के रूप में अच्छी तरह से किया जाता है और उपकरणों के लिए पूरी तरह से सूखे की अनुमति दी है. लगातार उपयोग की प्रत्येक सप्ताह के अंत में, सभी लाइनें और कक्षों 0.1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ भर रहे हैं, 30 मिनट के लिए सेते हैं 'की अनुमति दी और फिर पानी के साथ पूरी तरह से ऊपर के रूप में धोया. अंत में, परलगातार उपयोग के 2-3 सप्ताह के अंत, टयूबिंग के सभी वर्गों नए के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं और कक्ष और जलाशयों 1.0 एम एचसीएल के साथ साफ कर रहे हैं एक व्यापक आसुत / de-ionized पानी के साथ rinsing के द्वारा पीछा किया. यदि टयूबिंग या कक्ष / जलाशयों, इन या प्रतिस्थापित कर रहे हैं उचित के रूप में अच्छी तरह से साफ की किसी भी तत्व में वृद्धि के टयूबिंग या दृश्य स्थापना के किसी भी मलिनकिरण. नियमित सफाई और सामान्य रखरखाव के साथ, उपकरण एक बहुत लंबे समय पिछले कर सकते हैं. लिखने के समय, हमारे पोत कक्षों अपने 8 वें या नियमित प्रयोग के 9 वें वर्ष में सभी कर रहे हैं और हम उनके साथ कोई महत्वपूर्ण कठिनाई का अनुभव किया है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 ए
चित्रा 1 ए. यह आंकड़ा बुनियादी microvessel स्टेशन सेटअप प्रस्तुत करता है. देखने के पोत के लिए एक = टेलीविजन, बी = डिजिटल नली का व्यास, सी = superfusate thr धकेलने के लिए सिरिंजआवश्यक के रूप में ough इनफ्लो पिपेट, डी = हीड्रास्टाटिक स्तंभ perfusate इनफ्लो दबाव बदलने के लिए, ई माइक्रोस्कोप =; एफ = microvessel, कक्ष, जी है = superfusate जलाशय, एच = दबाव की निगरानी (कई आवश्यक के रूप में जोड़ा जा सकता है), मैं = microvessel कक्ष नाली के लिए पंप superfusate, जम्मू = संतुलन गैस मिश्रण टैंक, कश्मीर = बेकार निहित (superfusate के लिए), एल = परिसंचारी पानी हीटर, एम = anti-vibration/floating तालिका.

चित्रा 1 बी
चित्रा 1 बी. यह आंकड़ा microvessel कक्ष की स्थापना के करीब एक विचार प्रस्तुत करता है. इस आंकड़े में, ई खुर्दबीन = एफ = microvessel कक्ष, एच = दबाव मॉनिटर (जब तक हम सादगी के लिए केवल एक ही दिखाने के लिए, आवश्यक के रूप में अलग अलग साइटों के लिए कई जोड़ा जा सकता है), मैं है = microvessel कक्ष नाली पंप, एन = टयूबिंग से जुड़ी बहुत perfusate इनफ्लो विंदुक (चित्र 1 ए में 'डी' से एक निरंतरता) की शुरुआत, हे = टयूबिंग perfusate बहिर्वाह विंदुक से जुड़ी है.


चित्रा 1C. यह आंकड़ा microvessel कक्ष के करीबी दृश्य प्रस्तुत करता है. इस आंकड़े में, एन = perfusate (यानी, perfusate इनफ्लो विंदुक के लिए सीधे जुड़ी टयूबिंग) लाइन, हे = perfusate बहिर्वाह विंदुक सीधे जुड़ी टयूबिंग, पी = क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर इस इनफ्लो विंदुक के लिए स्थान नियंत्रण, क्यू = superfusate आर = जलाशय से आने वाले पानी स्नान के लिए प्रवाह (चित्र 1 ए में 'जी' से जुड़े); पानी स्नान (आंकड़े 1A और 1B में 'मैं' जुड़ा है) के लिए नाली.

चित्रा 2
चित्रा 2. यह आंकड़ा प्रणाली में तरल पदार्थ और गैसों के प्रवाह की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रस्तुत करता है. यह आंकड़ा एक = पी एस एस superfusate लाइन इनफ्लो, बी = पी एस एस perfusate इनफ्लो विंदुक लाइन, सी स्नान से = पी एस एस superfusate नाली कंटेनर बर्बाद करने के लिए, डी = पी एस एस बहिर्वाह विंदुक से perfusate बहिर्वाह, ई = कक्ष जैकेट में गर्म पानी इनपुट, एफ = कक्ष जैकेट से गर्म पानी का उत्पादन.

चित्रा 3
8-0 से और है कि हमारी तैयारी में उपयोग किया जाता है एकाधिक टाई loops के भंडारण, चित्रा 3 यह आंकड़ा व्यक्तिगत टाई छोरों नेत्र (एक पैनल 10x eyepieces और एक 4.5x समायोज्य ज़ूम बढ़ाई साथ विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा) सिवनी से बने प्रस्तुत और 10-0 उलट टेप पर एक खुर्दबीन स्लाइड जो एक कवर पेट्री डिश में संग्रहीत किया जाता है चारों ओर सीवन (उन्हें खोने से बचने के पैनल बी).

चित्रा 4
चित्रा 4. यह आंकड़ा gracilis मांसपेशी प्रतिरोध धमनिका की एक छवि (एक मानक विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा) से पहले शल्य अलगाव और हटाने लिए उचित स्थानिक उन्मुखीकरण के लिए अनुमति प्रदान करता है.

"ve_content> चित्रा 5
चित्रा 5 यह आंकड़ा एक cannulated microvessel के एक प्रतिनिधि छवि प्रदान करता है. पैनल एक पोत की पूरी दोनों (एक) प्रवाह और बहिर्वाह (बी) के रूप में अच्छी तरह से pipettes टाई छोरों (सी) के साथ, लंबाई से पता चलता है. पैनल बी एक उच्च वृद्धि पर एक छवि प्रस्तुत करता है, स्पष्ट रूप से डिजिटल नली का व्यास (इस मामले में व्यास 112 माइक्रोन है) के साथ arteriolar भीतरी व्यास के दृढ़ संकल्प दिखा.

चित्रा 6
चित्रा 6 यह आंकड़ा एक cannulated microvessel निम्नलिखित संतुलन के प्रतिनिधि चित्र प्रस्तुत करता है. शीर्ष छवि नियंत्रण के तहत एक पोत की है, संतुलन के दबाव की स्थिति पर unstimulated, acetylcholine (स्नान में 10 -6 एम) के साथ चुनौती फैलाव के बाद ही पोत के बीच छवि है, और नीचे छवि के बाद कि पोत की है constrictio(-7 स्नान में 10 एम) phenylephrine साथ चुनौती एन.

7 चित्रा
. 7 चित्रा प्रतिक्रिया में यह आंकड़ा एक पृथक microvessel की प्रतिक्रियाओं को सारांशित करने के लिए के साथ चुनौती: हाइपोक्सिया (पैनल, हमारी प्रणाली में ~ 135 ~~ 40 mmHg के लिए mmHg से perfusate और superfusate पीओ 2 में कमी), acetylcholine की बढ़ती सांद्रता (पैनल बी) के नियंत्रण शर्तों और कैल्शियम मुक्त पी एस एस (पैनल सी) के साथ पोत के निम्नलिखित ऊष्मायन के तहत, intravascular दबाव में परिवर्तन.

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Discussion

प्रस्तुत एक कंकाल की मांसपेशी microvessel के अलगाव को हटाने, और डबल केन्युलेशन के प्रोटोकॉल का वर्णन है, हालांकि यह सामान्य तकनीक आसानी से सबसे ऊतकों को लागू किया जा सकता है. वर्तमान पांडुलिपि शब्द "धमनिका" लेखकों द्वारा किया गया प्रयोग किया गया है एक प्रतिरोध आराम सक्रिय टोन के तहत 70-120 व्यास में माइक्रोन, जो भी छिड़काव प्रतिरोध के एक अंग के विनियमन के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता या के बीच लेकर पोत का वर्णन ऊतक.

कुछ संशोधनों के साथ, इस प्रणाली के विशिष्ट अन्वेषक के लिए कई अनुप्रयोगों के लिए फिट किया जा सकता है और आसानी से अतिरिक्त तकनीक के समावेश के लिए गहराई प्रयोग में (जैसे, transmembrane इलेक्ट्रोड का उपयोग झिल्ली 17 क्षमता के दृढ़ संकल्प के लिए) प्रदान की अनुमति देता है. बुनियादी तैयारी में एक महत्वपूर्ण कदम हमेशा बीमा है कि प्रवाह और बहिर्वाह pipettes है कि पोत cannulate के उपयोग किया जाता है अच्छी तरह से मिलान कर रहे हैं, स्पष्ट रहना, और अनुमतिप्रवाह और दबाव एक सतही तरीके से बनाए रखा. जब pipettes मिनट मलबे के टुकड़े से भरा हुआ हो, यह प्रवाह को बहाल करने के लिए सुझावों की बहुत छोटे टुकड़े को तोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि अन्वेषक सावधान है, pipettes कई बार reused किया जा सकता है जब तक वे एक बिंदु जहाँ वे या तो को unclogged नहीं किया जा सकता है या कि पोत के केन्युलेशन अत्यंत मुश्किल हो जाता है पर्याप्त रूप से बड़े व्यास तक पहुँचने. हालांकि, इस शल्य चिकित्सा और प्रयोगात्मक तैयारी, विस्तार करने के लिए सावधान ध्यान, और विशिष्ट परिस्थितियों और आवश्यकताओं के अनुरूप उचित संशोधनों की महारत के साथ, जांचकर्ताओं को आसानी से शारीरिक और औषधीय चुनौतियों की एक सूची के जवाब में संवहनी जेट का निर्धारण रास्ते का मूल्यांकन कर सकते हैं. यह तैयारी भी अन्वेषक परिवर्तन पर बुनियादी विश्लेषण संवहनी दीवार यांत्रिकी के लिए कोई सक्रिय 14 स्वर की शर्तों के तहत प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देगा. यह वास्तव में एक बहुत शक्तिशाली और अनुकूलनीय तकनीक है और यह एक है किअनुप्रयोगों और अधिक बुनियादी प्रतिक्रियाओं का उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए विस्तृत यंत्रवत अध्ययन की सीमा में फैले के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (0740129N ईआईए) और NIH HL90610 T32 के द्वारा समर्थित किया गया था.

References

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