Использование Цистометрия в мелких грызунов: исследование мочевого пузыря Chemosensation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Цистометрия является эффективным методом для оценки функции мочевого пузыря мелких животных

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., Voets, T., Nilius, B., Talavera, K., De Ridder, D. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Лабораторных животных

  1. Животных (мышей, крыс) размещаются в специализированном лечебном учреждении животных с 12-час цикле свет-темнота и вволю доступ к воде и стандартных гранул пищи. Оба пола и возраста животных являются важными параметрами, которые должны быть стандартизированы в соответствии с потребностями. Мы обычно выполняют цистометрии в 10 - 12 недельных самок 5,6.
  2. Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с Европейским Союзом принципы сообщества совета и одобрен местным комитетом по этике.

2. Анестезия

  1. Isoflurane анестезии используется для выполнения небольших хирургических процедур, так как он легко дозы в связи с его коротким периодом полураспада. Соответствующие очистки отходящих газов необходимо при использовании изофлурана.
    1. Животных помещают в фургон, газом изофлураном 5% в чистом кислороде (1 л / мин).
    2. После индукции анестезии при соответствующем лEvel поддерживается небольшой маски (разрез 10 мл шприц) на 0,8 - 1 л / мин кислорода с 1 - 1,5% изофлурана.
  2. Для мышей, уретановые анестезия применяется при функциональных записи (ср. ниже). Уретановые анестезия применяется при функциональных записей, потому что, в отличие от большинства других анестетиков, рефлекс мочеиспускания не подавляется этого анестетика 4. Уретановые 1,2 г / кг массы тела вводят подкожно (п) 60 мин до начала записи. При необходимости дозу уретана, необходимых для получения надлежащей анестезии можно титровать путем введения дополнительных доз (0,1 г / кг) подкожно. Следует отметить, однако, что дополнительная анестезия может изменить мочеиспускания эффективности и, следовательно, частоты мочеиспускания 7,8. Таким образом, цистометрической записи необходимо внимательно следить и отбрасываются, когда значительные отклонения от контроля поведения не наблюдается. Анестезия не следует назначать в то время как тестсоединения применяются, чтобы избежать неправильного толкования данных.

3. Хирургическая процедура - мочевой пузырь катетер Имплантация

  1. Хирургические инструменты стерилизуются в автоклаве перед использованием. Бритье живота животных, дезинфицируют спиртом 70% и выполняют лапаротомию низкой средней линии, чтобы разоблачить мочевого пузыря.
  2. Под операционным микроскопом, поместить кисетный шов в мочевой пузырь купола используется не рассасывающиеся, мононить шва (размер 6-0).
  3. Выполните небольшое цистостомии (мы преимущественно использовать иглу 18 G) внутри кошелька строку и вставьте PE 50 полиэтиленовый катетер, с небольшим манжеты на конце (получено тщательно нагрева трубы) через это отверстие. В наши руки, тонкие трубы (ПЭ 10) имеют более высокие и переменного сопротивления. Трубка может быть вылечен, поместив ее в этанол 70% раствора или стерилизовать в автоклаве. Перед имплантацией, трубы следует промыть раствором.
  4. Закрепите кошелек улING вокруг трубы с узлом хирурга. Вытяните катетер осторожно наружу, пока колоколообразной конец находится прямо под шов. Нажмите кусок катетера 18 G к швом, чтобы предотвратить утечку.
  5. Настаивать небольшой объем физиологического раствора (100 - 200 мкл) осторожно, чтобы проверить на герметичность. Если утечка присутствует, дополнительный шов должен быть помещен.
  6. Закрыть мышцы живота использовании мононити швы, оставляя проход для катетера в верхней части разреза.
  7. Туннель трубку к межлопаточной области использования полых металлический стержень, тем самым предотвращая животные кусают трубки во время эксперимента.
  8. Кожа закрывается с помощью нерассасывающийся, швы мононити. Имплантирован катетер промывается физиологическим раствором, чтобы проверить его проницаемость.
  9. Перед животные пробуждаются, анальгетики подкожно (бупренорфин, 0,05 мг / кг).

4. Установка и Цистометрия

  1. В зависимости от экспериментальной Questiна (и видов, используемых) цистометрии выполняется в бодрствования (ограничения или необузданность) или уретана анестезии животных. В то время как цистометрии вполне возможно в сознании крыс, которые имеют тенденцию оставаться спокойным в сдержанной окружающей среды, мы обычно выполняют цистометрии под уретана анестезии (1,2 мг / кг, подкожно) при использовании мыши 3,5,6,9.
  2. В наркозом мышей, температура тела постоянно контролируется и поддерживается на 36,5 ° C ± 0,2 ° C с помощью датчиков температуры и нагрева лампы.
  3. Настройки калибруется перед каждым экспериментом в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Имплантирован катетер связано с тем, Luer заглушки для 3-х ходовой кран, который подключается к датчику давления (Edwards Lifesciences) с одной стороны и инфузионного насоса на другой (Harvard Apparatus). Датчик давления подключен через усилитель (78534c монитор, Hewlett Packard) к системе сбора данных (DI-730-USB, Dataq инструментов) и сотрудничествоmputer. Windaq / Lite программное обеспечение можно использовать для записи.
  5. Настой насос, что позволит вливание физиологического раствора или в PBS, например, 100 мкл / мин (у крыс) или 20 мкл / мин (у мышей). В таких мочевого пузыря будет заполнена с постоянной скоростью, в то время внутрипузырного давления записывается.
  6. На рисунке 5 показаны типичные следы давления: во время инфузии жидкости, происходит медленное наращивание давления в мочевом пузыре, пока определенный объем / давление будет достигнуто, мочеиспускание порог. Как только этот порог будет достигнут, мочевого пузыря, будет сжиматься, а затем сфинктера откроется, позволяя прохождение мочи через мочеиспускательный канал. Таким образом, мочевой пузырь опорожняется, сокращение остановится, и давление упадет еще раз, чтобы "базальных" уровне.
  7. Как крыс помещали в метаболические клетки и выше цифровые баланса, объема мочеиспускания могут быть измерены одновременно, давая информацию о объема мочеиспускания. Из-за небольших объемов аннулирована в мисе, она может быть очень сложным использованием этой системы. Таким образом, объема мочеиспускания определяется с помощью небольшого фильтровальной бумаги взвешиваться до и после мочеиспускания.
  8. Как правило, мы позволяем системе равновесия в течение 30 мин, после чего запись в течение 30 мин. Тогда, наркотики можно вводить системно или внутрипузырно и еще 30 мин записываются.
  9. Записанные данные могут быть экспортированы в. CSV-файлов, которые можно импортировать в специализированное программное обеспечение для количественного анализа. Обычно мы используем происхождения (OriginLab корпорации, штат Массачусетс, США).
  10. После экспериментов животных умерщвляют путем смещения шейных позвонков (мышей) или CO 2 интоксикации (крысы).

5. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Лапаротомия обзор. А) Поместите крысу в положении лежа на спине. B) бритья и стерильно готовить хирургическое сайта. C) разрез кожи. D) Разрез оF мышцы живота и мочевого пузыря экспозиции.

Рисунок 2
Рисунок 2. Кисетный шов.

Рисунок 3
Рисунок 3. Катетер имплантации.

Рисунок 4
Рисунок 4. Туннелирование катетер.

Примеры измерения давления, полученные в ходе внутрипузырного перфузии физиологического раствора в сознательном крыс и мышей под наркозом показано на рисунке 5. Несколько параметров можно извлечь из сигнала давления (например, intercontractile интервал, базовый давления и порог давления). Для всестороннего описания этих параметров см. Andersson и соавт. (Ссылка 4) и Yoshiyama и соавт. ( Ref 10).

Недавно мы использовали цистометрии для идентификации молекулярных мишеней горчичное масло (MO), высокой реакционной способностью соединения, которое уже давно используется в экспериментальных моделей воспаления и гипералгезии внутренних органов, таких как мочевой пузырь 11,12. Внутрипузырная инфузии 10 ммоль MO вызывали сильное увеличение частоты мочеиспускания (снижение intercontractile интервала) у мышей дикого типа (рис. 6а, б) и уменьшение объема мочеиспускания 6. Интересно, MO индуцированных подобных изменений у мышей, дефицитных по рецептору MO TRPA1. В отличие, MO индуцированных гораздо слабее изменений в цистометрической параметров в TRPV1 мышей KO, чем в WT мышей и был без эффекта в Trpa1/Trpv1 мышей KO. Вместе с измерениями выпуска геном кальцитонина пептид, связанный с (CGRP) 6, эти данные показывают, показывают, что TRPV1 может играть ключевую роль в висцеральной раздражение индуцированных МО.

ve_content "> Рисунок 5
Рисунок 5. Представитель следы внутрипузырного давления, записанные в сознательном самок крыс (А) и в анестезии женщина мыши (B). Самое низкое давление определяется как "базовый давления" (красные стрелки). Давление в конце фазы заполнения отмечены синими стрелками. Объем введенной жидкости между этими точками, деленной на разность давлений, позволяет рассчитать соответствие стенки мочевого пузыря (соблюдение = придают объем / (пороговое давление -. Базового давления) "intercontractile интервал" (ICI) это время между два мочеиспускания сокращений.

Рисунок 6
Рисунок 6. Эффекты внутрипузырного применения горчичного масла на цистометрии картины в дикого типа и мышей TRPA1, TRPV1 и Trpa1/Trpv1 нокаутом.(A) Характерные примеры внутрипузырного изменения давления, записанные в WT, TRPA1 KO, KO TRPV1 и Trpa1/Trpv1 KO мышей в ответ на вливание физиологического раствора и 10 мМ МО. (B) Время курса средней мгновенной частоты мочеиспускания до и во время внутрипузырного вливания МО. Для всех мышей, данные были нормированы на средней частоты, полученные в ходе вливание физиологического раствора. Эти данные адаптированы из Everaerts и соавт. (Ссылка 6), с разрешения Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цистометрии техники, представленные здесь позволяет проводить в естественных условиях измерения функции мочевого пузыря на животных моделях. Крысы являются, вероятно, наиболее часто используемые модели на животных. Мыши сложнее в использовании, но имеют преимущество использования генетически модифицированных животных. Из-за технических трудностей использования сознательного мышей, которые, как правило, очень активны в результате ослабления имплантировали катетер и изменения в внутрибрюшное давление, что может повлиять на внутрипузырного давления, мы рекомендуем, чтобы держать их под наркозом с уретановой в течение всего цистометрии протокол. Конечно, преимущества наличия седативных мышей, должны быть взвешены против воздействия анестетиков. Таким образом, уретана может оказать существенное влияние на пост-мочеиспускания остаточный объем 7,8. Поэтому мы ждать, пока у нас есть стабильный уровень наркоза, прежде чем мы начнем нашу записях и выступлениях.

Исследователи должны рассмотреть тОн различий между мужским и женским грызунов мочеиспускание 13. Кроме того, возраст животных имеет большое значение. Мы выполняем цистометрии у животных, которые в 10 - 12 недель. Все эксперименты следует проводить в спокойной обстановке, особенно при использовании сознательного животных. Число инфузии были описаны для наших животных моделях. Обычно мы используем инфузии 20 мкл / мин для мышей и 100 мкл / мин для крыс.

Как упоминалось выше, мочеиспускания у человека и грызунов существенно различаются. Например, АТФ является одной из основных причин детрузора у мышей и крыс, в то время как у людей, мочевого пузыря сокращения, в физиологических условиях в основном опосредован ацетилхолина 4. Однако возможности для выполнения инвазивных измерений, которые, как правило, запретительные в клинических условиях и использовании генетически модифицированных животных, позволяют изучать текущие границы мочевого пузыря патофизиологииг фармакологии. В связи с этим, значительные успехи были недавно получены в выяснении роли мускариновых 14, 15 и простагландина адренорецепторов 16, нейропептиды 17, Ca 2 +-активированных K + каналы 18 и TRP каналы 3,5,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от бельгийского федерального правительства (IUAP P6/28), Научно-исследовательский фонд Фландрии (FWO) (G.0565.07 и G.0686.09), Astellas Европейский фонд Award 2009 и Научно-исследовательского совета KU Leuven (GOA 2009/07, EF/95/010 и PFV/10/006). PU и мы научных сотрудников научно-исследовательского фонда Фландрии (FWO). MB является членом Марии Кюри. DDR фундаментальных клинических сотрудник FWO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
  2. Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
  3. Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
  4. Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
  5. Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
  6. Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
  7. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
  8. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
  9. Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. (2011).
  10. Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
  11. McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
  12. Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
  13. Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
  14. Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
  15. Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
  16. Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
  17. May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
  18. Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics