छोटे rodents में Cystometry का प्रयोग: मूत्राशय Chemosensation की एक अध्ययन

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Summary

Cystometry छोटे जानवरों की मूत्राशय समारोह को मापने के लिए एक कुशल तकनीक है

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Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., et al. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

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Abstract

Protocol

1. प्रयोगशाला पशु

  1. पशु (चूहों, चूहों) 12-घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र और यथेच्छ पानी और मानक भोजन छर्रों उपयोग के साथ एक विशेष जानवर सुविधा में रखे जाते हैं. और जानवरों दोनों की उम्र, लिंग महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि जरूरतों के हिसाब से तय की जानी चाहिए. 12 सप्ताह पुरानी मादा पशुओं 5,6 - हम आम तौर पर 10 में cystometry प्रदर्शन.
  2. सभी पशु प्रयोगों बाहर यूरोपीय संघ समुदाय परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है और स्थानीय आचार समिति ने मंजूरी दे दी है.

2. संज्ञाहरण

  1. Isoflurane संज्ञाहरण छोटे शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है, के बाद से यह आधा जीवन कम करने के लिए कारण खुराक के लिए आसान है. जब isoflurane का उपयोग कर उचित अपशिष्ट गैस सफाई आवश्यक है.
    1. पशु एक बंद बॉक्स, शुद्ध ऑक्सीजन में isoflurane 5% (1 एल / मिनट) के साथ मार डाला में रखा जाता है.
    2. उपयुक्त एल में शामिल संज्ञाहरण, के बाद1 एल / 1 के साथ न्यूनतम ऑक्सीजन isoflurane के 1.5% Evel 0.8 द्वारा एक छोटा सा मास्क (एक कटौती 10 मिलीलीटर सिरिंज) द्वारा बनाए रखा है.
  2. चूहों के लिए, urethane संज्ञाहरण कार्यात्मक रिकॉर्डिंग (इंफ्रा cfr.) के दौरान किया जाता है. Urethane संज्ञाहरण कार्यात्मक रिकॉर्डिंग के दौरान प्रयोग किया जाता है, क्योंकि, सबसे अन्य anesthetics के विपरीत में, बारंबार पेशाब करने की इच्छा पलटा इस चतनाशून्य करनेवाली औषधि 4 एजेंट द्वारा दबा दिया जाता है. Urethane 1.2 ग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन subcutaneously रिकॉर्डिंग के शुरू होने से पहले (अनुसूचित जाति) 60 मिनट में किया जाता है. यदि आवश्यक हो, उचित संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए आवश्यक urethane की खुराक अतिरिक्त खुराक (0.1 ग्राम / किलो) subcutaneously प्रशासन द्वारा titrated जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि अतिरिक्त संज्ञाहरण voiding दक्षता और फलस्वरूप बारंबार पेशाब करने की इच्छा 7,8 आवृत्ति को बदल सकता है. इस प्रकार, cystometric रिकॉर्डिंग बारीकी और निगरानी करनी चाहिए त्याग नियंत्रण व्यवहार से महत्वपूर्ण विचलन जब भी मनाया जाता है. Anesthetics जबकि नहीं प्रशासित चाहिए परीक्षणयौगिकों डेटा के अशुद्ध अर्थ से बचने के लिए लागू कर रहे हैं.

3. सर्जिकल प्रक्रिया मूत्राशय कैथेटर आरोपण

  1. सर्जिकल उपकरणों के उपयोग करने के लिए पूर्व आटोक्लेव में निष्फल रहे हैं. जानवर के पेट दाढ़ी, इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित 70% और एक कम midline laparotomy प्रदर्शन से मूत्राशय बेनकाब.
  2. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, मूत्राशय गुंबद में एक गैर absorbable, monofilament सीवन (6-0 आकार) का उपयोग करते हुए एक पर्स स्ट्रिंग सीवन जगह है.
  3. प्रदर्शन पर्स स्ट्रिंग के अंदर एक छोटा सा cystostomy (हम preferentially एक 18 जी सुई का उपयोग) और अंत में एक छोटे से इस छेद के माध्यम से ध्यान टयूबिंग हीटिंग द्वारा प्राप्त कफ के साथ एक पीई 50 polyethylene कैथेटर, सम्मिलित. हमारे हाथ में, पतली ट्यूब (10 पीई) के एक उच्च और अधिक चर प्रतिरोध किया है. ट्यूबिंग यह एक इथेनॉल 70% समाधान में डाल या एक autoclave में निष्फल कीटाणुरहित किया जा सकता है. आरोपण से पहले, टयूबिंग खारा के साथ प्लावित किया जाना चाहिए.
  4. पर्स str सुरक्षितसर्जन गाँठ के साथ ट्यूब के आसपास रही है. खींचो कैथेटर टिप घंटी के आकार तक धीरे बाहर सीवन के अंतर्गत तैनात है. पुश को लीक को रोकने के सिवनी की ओर 18 जी कैथेटर का एक टुकड़ा.
  5. खारा (100 μl 200) की एक छोटी मात्रा दिखे धीरे लीक के लिए जाँच करने के लिए. यदि लीक मौजूद हैं, एक अतिरिक्त सीवन रखा जाना चाहिए.
  6. पेट की मांसपेशियों को monofilament sutures का उपयोग बंद करने के लिए, चीरा के ऊपरी भाग में कैथेटर के लिए एक मार्ग छोड़ने.
  7. Interscapular एक खोखले धातु की छड़ का उपयोग क्षेत्र के लिए ट्यूब सुरंग, जिससे जानवरों को रोकने के लिए प्रयोग के दौरान ट्यूब काटने.
  8. त्वचा गैर absorbable, monofilament sutures का उपयोग बंद कर दिया है. अपनी पारगम्यता की जाँच करने के लिए प्रत्यारोपित कैथेटर नमक के साथ प्लावित है.
  9. इससे पहले जानवरों को जगाने, दर्दनाशक दवाओं subcutaneously (buprenorphine, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा) दिया जाता है.

4. सेटअप और Cystometry

  1. प्रयोगात्मक questi पर निर्भर करता है(और प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया) cystometry में जाग (संयम या बेसब्री) या urethane anesthetized जानवरों किया जाता है. जबकि cystometry के प्रति जागरूक चूहों, जो एक स्र्द्ध वातावरण में शांत रह जाते हैं में पूरी तरह से संभव है, हम आम तौर पर urethane संज्ञाहरण (1.2 मिलीग्राम / किलो, subcutaneously) के तहत cystometry प्रदर्शन जब 3,5,6,9 चूहों का उपयोग.
  2. Anesthetized चूहों में, शरीर का तापमान लगातार निगरानी रखी जाती है और 36.5 पर रखा ° C ± 0.2 डिग्री सेल्सियस तापमान जांच और एक हीटिंग दीपक के माध्यम से.
  3. सेट अप 'निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार हर प्रयोग से पहले calibrated है.
  4. प्रत्यारोपित कैथेटर एक luer ठूंठ द्वारा एक नल तीन तरह, जो एक तरफ और अन्य (हार्वर्ड तंत्र) पर एक जलसेक पंप पर दबाव transducer (एडवर्ड्स लाइफसाइंसेस) से जुड़ा है से जुड़ा है. दबाव transducer डाटा अधिग्रहण प्रणाली (डी-730-USB, Dataq उपकरणों) (78534c मॉनिटर, हेवलेट पैकार्ड) एम्पलीफायर और एक सह के माध्यम से जुड़ा हुआ हैmputer. / Windaq लाइट सॉफ्टवेयर रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. जलसेक पम्प शुरू कर दिया है, उदाहरण के लिए खारा या पीबीएस के अर्क, सक्रिय करने, 100 / μl मिनट (चूहों में) या 20 / μl मिनट (चूहों में). के रूप में इस तरह के मूत्राशय एक स्थिर दर पर भरा जाएगा, जबकि intravesical दबाव में दर्ज की गई है.
  6. चित्रा 5 एक ठेठ दबाव का पता लगाने को दर्शाया गया है: द्रव जलसेक के दौरान मूत्राशय में एक धीमी गति से दबाव buildup है, जब तक एक निश्चित मात्रा / दबाव तक पहुँच जाता है, बारंबार पेशाब करने की इच्छा सीमा. एक बार इस सीमा तक पहुँच है, मूत्राशय अनुबंध जाएगा है और बाद में मूत्र दबानेवाला यंत्र खुल जाएगा, मूत्रमार्ग के माध्यम से मूत्र के पारित होने की अनुमति देता है. जैसे, मूत्राशय खाली कर दिया है, संकुचन रोकने के लिए और दबाव फिर "बेसल" स्तर तक छोड़ देंगे.
  7. के रूप में चूहे एक चयापचय पिंजरे में और एक डिजिटल संतुलन के ऊपर रखा जाता है, voided मात्रा में एक साथ मापा जा सकता है, voided मात्रा के बारे में जानकारी दे रही है. मील में छोटे voided संस्करणों के कारणCE, यह बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है इस प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं. इसलिए, voided मात्रा छोटे फिल्टर के पहले और बाद में voiding तौला कागजात का उपयोग निर्धारित किया जाता है.
  8. आमतौर पर, हम प्रणाली को 30 मिनट, 30 मिनट की अवधि के एक रिकॉर्डिंग के द्वारा पीछा के लिए संतुलन में लाना. फिर, दवाओं प्रणालीबद्ध या intravesically प्रशासित किया जा सकता है और एक और 30 मिनट दर्ज कर रहे हैं.
  9. रिकॉर्ड डेटा. Csv फ़ाइलें है कि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विशेष सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है के रूप में निर्यात किया जा सकता है. हम आम तौर पर उत्पत्ति का उपयोग करें (OriginLab निगम, एमए, संयुक्त राज्य अमरीका).
  10. प्रयोगों के बाद, जानवरों गर्भाशय ग्रीवा (चूहों) अव्यवस्था या सीओ 2 नशा (चूहों) द्वारा बलिदान कर रहे हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 Laparotomy सिंहावलोकन. ए) लापरवाह स्थिति में चूहे रखें. बी) दाढ़ी और विकार - निवारक के रूप में शल्य साइट तैयार. त्वचा की चीरा). डी) चीरा ओच पेट की मांसपेशियों, और मूत्राशय जोखिम.

चित्रा 2
चित्रा 2 एक बटुआ स्ट्रिंग सीवन.

चित्रा 3
चित्रा 3. कैथेटर आरोपण.

चित्रा 4
चित्रा 4 कैथेटर की सुरंग.

दबाव एक सचेत चूहा और एक माउस anesthetized खारा की intravesical छिड़काव के दौरान प्राप्त माप के उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया जाता है. कई मापदंडों दबाव संकेत (intercontractile अंतराल, आधारभूत दबाव और सीमा के दबाव जैसे) से निकाला जा सकता है. इन मापदंडों के व्यापक विवरण के लिए, कृपया Andersson एट अल. (4 रेफरी) और Yoshiyama एट अल ( 10 रेफरी).

हमने हाल ही में सरसों के तेल की आणविक लक्ष्य (MO), एक उच्च प्रतिक्रियाशील यौगिक है कि लंबे समय से किया गया है सूजन और मूत्र 11,12 मूत्राशय के रूप में आंत अंगों के hyperalgesia की प्रयोगात्मक मॉडल में इस्तेमाल की पहचान cystometry इस्तेमाल किया है. 10 मिमी MO intravesical जलसेक voiding आवृत्ति में एक मजबूत वृद्धि (intercontractile अंतराल में कमी) जंगली प्रकार चूहों में (6A चित्रा, बी) और voided मात्रा 6 की एक कमी प्रेरित. दिलचस्प बात यह है कि, MO MO TRPA1 रिसेप्टर की कमी चूहों में समान परिवर्तन प्रेरित किया. इसके विपरीत, MO WT चूहों की तुलना में बहुत कमजोर TRPV1 KO चूहों में cystometric मापदंडों में बदलाव को प्रेरित किया और KO चूहों में Trpa1/Trpv1 किसी भी प्रभाव के बिना किया गया था. कैल्सीटोनिन जीन संबंधित पेप्टाइड (CGRP) 6 के रिलीज के मापन के साथ मिलकर, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है दिखाना है कि TRPV1 आंत एमओ द्वारा प्रेरित जलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं.

"ve_content> चित्रा 5
चित्रा 5 intravesical एक सचेत महिला चूहे (A) में और एक anesthetized महिला माउस (बी) में दर्ज दबाव के प्रतिनिधि निशान. सबसे कम दबाव "आधारभूत दबाव" (लाल तीर) के रूप में परिभाषित किया गया है. भरने चरण के अंत में दबाव नीले तीर के साथ चिह्नित है. तरल पदार्थ की मात्रा इन बिंदुओं, दबाव अंतर से विभाजित है, के बीच संचार की अनुमति देता है मूत्राशय की दीवार के अनुपालन की गणना (अनुपालन = संचार / मात्रा (सीमा दबाव आधारभूत दबाव) "intercontractile अंतराल" (आईसीआई) के बीच का समय है दो voiding संकुचन.

चित्रा 6
जंगली प्रकार और TRPV1 TRPA1, और Trpa1/Trpv1 पीटा चूहों में cystometry पैटर्न पर चित्रा 6 सरसों के तेल की intravesical आवेदन के प्रभाव.(ए) intravesical दबाव खारा और 10 मिमी एमओ के अर्क के जवाब में WT, TRPA1 KO, TRPV1 KO और Trpa1/Trpv1 KO चूहों में दर्ज परिवर्तन के प्रतिनिधि उदाहरण. (बी) के औसत तात्कालिक voiding आवृत्ति के पहले और मो के intravesical जलसेक के दौरान समय बेशक. सभी चूहों के लिए, डेटा औसत खारा जलसेक के दौरान प्राप्त आवृत्ति normalized थे. ये डेटा Everaerts एट अल. (6 रेफरी) से अनुकूलित है Elsevier से अनुमति के साथ.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत cystometry तकनीक पशु मॉडल में मूत्राशय समारोह के vivo माप में प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. चूहे शायद सबसे अधिक इस्तेमाल किया पशु मॉडल हैं. चूहे अधिक संभालना मुश्किल कर रहे हैं, लेकिन आनुवंशिक रूप से चालाकी से जानवरों का उपयोग करने का लाभ प्रदान करते हैं. के प्रति जागरूक चूहों, जो बहुत सक्रिय हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप प्रत्यारोपित कैथेटर और अंतर पेट दबाव है कि intravesical दबाव को प्रभावित कर सकते हैं में परिवर्तन के ढीला करते हैं का उपयोग कर के तकनीकी कठिनाई की वजह से, हम करने के लिए उन्हें पूर्ण cystometry दौरान urethane साथ anesthetized रखने की सलाह प्रोटोकॉल. बेशक, बेहोश चूहों होने के लाभ, anesthetics के प्रभाव के खिलाफ तौला जाना चाहिए. जैसे, urethane के बाद voiding अवशिष्ट मात्रा 7,8 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. इसलिए हम जब तक हम प्रतीक्षा संज्ञाहरण के एक स्थिर डिग्री है, इससे पहले कि हम हमारे रिकॉर्डिंग और हस्तक्षेप शुरू.

शोधकर्ताओं ने टी पर विचार करना चाहिएवह पुरुष और महिला कृंतक 13 बारंबार पेशाब करने की इच्छा के बीच मतभेद है. इसके अलावा, जानवरों की उम्र काफी महत्व की है. पुराने 12 सप्ताह - हम जानवरों है कि 10 में cystometry प्रदर्शन करते हैं. सभी प्रयोगों एक शांत वातावरण में किया जाना चाहिए, खासकर जब चेतन जानवरों का उपयोग कर. जलसेक दरों की संख्या हमारे पशु मॉडल के लिए वर्णित किया गया है. हम आम तौर पर 20 / μl चूहों के लिए न्यूनतम और चूहों के लिए 100 μl / मिनट के अर्क दरों का उपयोग करें.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, मानव और rodents में बारंबार पेशाब करने की इच्छा काफी अलग हैं. उदाहरण के लिए, एटीपी चूहों और चूहों में निस्सारिका संकुचन के लिए एक प्रमुख योगदान है, जबकि मानव में मूत्राशय संकुचन, शारीरिक शर्तों के तहत मुख्य रूप से 4 acetylcholine द्वारा मध्यस्थता है. हालांकि, संभावनाओं इनवेसिव माप है कि आम तौर पर नैदानिक ​​और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के उपयोग के संदर्भ में बैठती है करने के लिए, मूत्राशय pathophysiology के मौजूदा सीमाओं तलाश की अनुमतिघ औषध. इस संबंध में, महत्वपूर्ण अग्रिम हाल ही में किया गया है मुस्कारिनिक 14, 15 प्रोस्टाग्लैंडीन और एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स 16, 17 neuropeptides, Ca 2 + K सक्रिय + 18 चैनलों और टीआरपी 3,5,6 चैनलों की भूमिका elucidating में प्राप्त की.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

यह काम बेल्जियम संघीय सरकार (P6/28 IUAP), रिसर्च (FWO) फाउंडेशन फ़्लैंडर्स (G.0565.07 और G.0686.09), Astellas यूरोपीय फाउंडेशन अवार्ड 2009 और यू लोवेन के अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (GOA 2009/07, EF/95/010 और PFV/10/006). हम पु और रिसर्च फाउंडेशन फ़्लैंडर्स (FWO) के डॉक्टरेट साथियों हैं. MB क्यूरी मेरी एक साथी है. DDR FWO के एक साथी मौलिक नैदानिक.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

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References

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