的的膀胱测压小老鼠:A膀胱Chemosensation研究的使用

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Summary

膀胱测压是一种有效的技术来测量小动物的膀胱功能

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Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., Voets, T., Nilius, B., Talavera, K., De Ridder, D. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

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Abstract

Protocol

1。实验动物

  1. 动物(小鼠,大鼠)被安置在一个专门的动物设施,12个小时光暗周期和自由采食获得水和食物颗粒标准。这两种动物的年龄和性别,是重要的参数,根据需要,应该标准化。我们通常进行膀胱内压在10 - 12周龄雌性动物5,6。
  2. 所有的动物进行了实验,根据与欧洲联盟共同体理事会准则和当地的伦理委员会的批准。

2。麻醉

  1. 异氟醚麻醉用于执行小的外科手术,因为它很容易的剂量,由于其短的半衰期。适当的废气清除,必要时使用异氟醚。
    1. 动物被放置在一个封闭的盒子,用异氟烷在纯氧气中的5%(1升/分钟)毒气。
    2. 诱导后,麻醉在适当的升埃维尔是由一个小的掩模(切口10毫升注射器)由0.8 - 1升/分钟氧气与1 - 1.5%的异氟烷​​维持。
  2. 对于小鼠,氨基甲酸乙酯麻醉过程中使用功能的录音(见“红外线)。乌拉坦麻醉期间使用的功能的录音,因为,在大多数其他麻醉药相反,排尿反射不抑制该麻醉剂4。氨基甲酸乙酯1.2克/公斤体重,皮下给药(SC)的前60分钟开始的录音。如果有必要,以获得适当的麻醉所需的剂量的氨基甲酸乙酯可通过施用额外的剂量(0.1克/公斤)皮下滴定。然而,应当指出,该额外的麻醉可能会改变排尿效率,进而排尿频率7,8。因此,应密切监测膀胱录音和观察到显着偏离的控制行为便会放弃。麻醉药不应该被管理,而测试化合物应用的数据,以避免误解。

3。外科手术 - 膀胱导管植入术

  1. 外科器械在使用前在高压釜中灭菌。剃须动物的腹部,用70%乙醇消毒,并执行低中线剖腹手术以暴露膀胱。
  2. 在手术显微镜下,放置在膀胱圆顶使用非吸收性的,单纤维缝合线(尺寸6-0)的荷包缝合。
  3. 执行钱袋内的一个小膀胱造瘘(我们优先使用一个地下18针)和PE 50聚乙烯导管插入,用一个小袖结束时(通过仔细加热管),通过此孔。在我们的手中,更薄管(PE)有一个更高,更可变电阻。管子可以通过将其在乙醇中70%的溶液中,或在高压釜中灭菌消毒。在注入之前,管子应用生理盐水冲洗。
  4. 保护钱包海峡的安全ING管周围的外科医生的结。拉出导管轻轻向外直到钟形尖端的定位下缝合。按对缝合了一块18 G导管,以防止泄漏。
  5. 一个小体积的生理盐水(100 - 200μL)注入轻轻地检查是​​否有泄漏。如果存在泄漏,额外的缝合线应放置的位置。
  6. 关闭腹肌使用单丝缝合线,离开的通道的导管的上部中的切口。
  7. 隧道的肩胛间的区域使用的中空的金属棒的管,从而防止动物咬在实验过程中的管。
  8. 在皮肤上使用非吸收性,单丝缝线关闭。植入的导管,用生理盐水冲洗,以检查其透气性。
  9. 在动物唤醒,止痛的皮下注射(丁丙诺啡,0.05毫克/千克)。

4。安装和膀胱测压

  1. 根据实验questi(种),膀胱内压(在清醒的约束或放纵)或氨基甲酸乙酯麻醉的动物。而,往往一种内敛的环境中保持冷静清醒大鼠膀胱测压是完全可行的,我们通常进行性膀胱测压时,在乌拉坦麻醉(1.2毫克/公斤),皮下利用老鼠3,5,6,9。
  2. 在麻醉的小鼠中,不断地监测和体温保持在36.5℃,±0.2°C的温度探针和加热灯通过。
  3. 每次实验前根据制造商的说明进行校准设置。
  4. 植入的导管连接的路厄氏存根了3路抽头的一侧上和其他(哈佛器具)的输液泵,其被连接到所述压力传感器(Edwards Lifesciences公司)。通过一个放大器(78534c显示器,惠普)的数据采集系统(DI-730-USB,DATAQ文书)和一个共同的压力换能器被连接柴红斌。 Windaq /精简版软件可用于记录。
  5. 开始的输液泵,使在例如生理盐水或PBS输注,以100μl/分钟(大鼠)或20μl/ min的(小鼠)。作为这种膀胱将被填充以恒定的速率,而记录膀胱内压。
  6. 图5示出了典型的压迹:输液过程中,有在膀胱是一个缓慢的压力累积,直到达到一定的体积/压力,排尿阈值。一旦达到这个阈值,膀胱会收缩,随后尿道括约肌会打开,允许通过尿液通过尿道。因此,被清空,膀胱收缩将停止和压力将再次下降的“基底”电平。
  7. 由于大鼠置于代谢笼及以上的数字平衡,可以同时测量排尿量,提供空隙体积有关下列内容的信息。由于小排尿量英里CE,它可以是非常具有挑战性的使用该系统。因此,排尿量用小滤纸称重前,排尿后确定。
  8. 通常情况下,我们让系统平衡30分钟,然后30分钟内由记录。然后,药物可以全身给药或膀胱内注射和另一个30分钟记录。
  9. 记录的数据可以导出为csv文件,可以导入到一个专门的软件进行定量分析。我们通常使用地(OriginLab公司,MA,USA)。
  10. 实验结束后,处死动物通过颈椎脱臼(小鼠)或CO 2的中毒(大鼠)。

5。代表性的成果

图1
图1。剖腹探查术概述。 A)将大鼠仰卧位。 B)刮胡子,防腐准备手术部位。 C)切开皮肤。 D)切口Øf的腹部肌肉,膀胱曝光。

图2
图2:荷包缝合。

图3
图3。导管植入术。

图4
图4的隧道的导管。

在有意识的大鼠和麻醉的小鼠的膀胱内灌注生理盐水期间获得的压力测量值的实施例示于图5。多个参数可以从压力信号( 例如,在intercontractile的时间间隔,基准压力和临界压力)萃取。对于这些参数的完整描述,请参阅安德森等人。(参考文献4)和吉山等人。(文献10)。

最近,我们已使用大鼠膀胱内压,以确定的分子靶标,芥子油(MO),高活性的化合物,已经长期使用在实验模型中的炎症和痛觉过敏的内脏器官,如膀胱11,12。膀胱内输注的10mM MO诱导强烈增加在排尿频率(减少在intercontractile间隔)在野生型小鼠( 图6A,B)和空隙体积6减少。有趣的是,MO诱导小鼠的MO受体TRPA1类似的变化。与此相反,MO诱发弱得多TRPV1基因敲除小鼠较野生型小鼠膀胱参数的变化,并在Trpa1/Trpv1基因敲除小鼠没有任何影响。降钙素基因相关肽(CGRP)释放的测量,这些数据表明表明,TRPV1在内脏刺激引起的MO可能发挥了关键的作用。

ve_content“> 图5
图5代表记录在有意识的雌性大鼠(A)和在麻醉的雌性小鼠(B)的膀胱内压的痕迹。被定义为“基线压力”(红色箭头)的最低压力。填充阶段的结尾处的压力被标记为与蓝色箭头。这些点之间的压力差除以注入流体的体积就可以计算出遵守的膀胱壁(合规=注入量/(阈值压力 - 基准压力)。的“intercontractile的间隔”(ICI)之间的时间两个排尿收缩。

图6
图6。膀胱内应用的芥子油的膀胱内压在野生型和基因敲除小鼠TRPA1,TRPV1受体Trpa1/Trpv1模式。(A)记录在WT,TRPA1 KO,TRPV1 KO和Trpa1/Trpv1的的基因敲除小鼠在输注生理盐水和10毫米MO膀胱内压力变化的代表性的例子。 (B)的时间过程和膀胱内输注MO期间前的平均瞬时排尿频率。对于所有的小鼠中,数据被归一化到盐水输注期间获得的平均频率。这些数据是适应从Everaerts 等。(参考文献6),爱思唯尔的许可。

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Discussion

这里介绍的允许性膀胱测压技术在动物模型体内测量膀胱功能执行。老鼠可能是最常用的动物模型。的小鼠更难以处理,但提供的优势,利用基因操纵的动物。由于技术难度使用意识的小鼠,这往往是非常活跃的松动植入导管在腹腔内的压力,可能会影响膀胱内压力的变化导致的,我们建议在全膀胱压力,让他们用氨基甲酸乙酯麻醉协议。当然,有镇静小鼠的好处,对麻醉药的影响进行权衡。因此,聚氨酯可以有一个显着的影响排尿后的残留量7,8。因此,我们等待,直到我们有一个稳定的麻醉程度,才开始我们的录音和干预。

研究人员应该考虑吨他差异雄性和雌性啮齿动物排尿13。此外,动物的年龄是非常重要的。我们进行的动物膀胱内压在10 - 12周龄。所有的实验应该在一个平静的环境,尤其是在使用有意识的动物。为我们的动物模型中已经描述了一些输注速率。我们通常使用20μl/ min的小鼠和100μl/ min的鼠只输注速率。

如上所述,人类和啮齿类动物的排尿功能的差异显着。例如,ATP在小鼠和大鼠逼尿肌收缩的主要贡献者,而在人类中,在生理条件下的膀胱收缩,主要是介导的乙酰胆碱4。然而,执行侵入性测量,一般在临床上的上下文和转基因动物的使用望而却步的可能性,允许探索当前边界膀胱病理生理学ð药理学。在这方面,最近被显着的进步中得到的澄清作用的毒蕈碱14,前列腺素15和肾上腺素能受体16,神经肽17的Ca 2 +活化的K +通道18和TRP通道3,5,6。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这项工作是由比利时联邦政府(IUAP P6/28),研究基金会,富兰德(FWO)(G.0565.07和G.0686.09),安斯泰来欧洲基金会奖2009年和鲁汶大学研究理事会的拨款,支持(,EF/95/010 GOA 2009/07和PFV/10/006)。 PU,我们正在研究基金会龙龙(FWO)的博士后研究员。 MB是居里夫人研究员。 DDR的基本临床研究员的FWO。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

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References

  1. Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
  2. Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
  3. Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
  4. Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
  5. Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
  6. Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
  7. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
  8. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
  9. Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. (2011).
  10. Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
  11. McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
  12. Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
  13. Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
  14. Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
  15. Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
  16. Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
  17. May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
  18. Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).

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