Die Verwendung von Zystometrie in kleine Nagetiere: A Study of Bladder Chemosensorik

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Summary

Zystometrie ist eine hocheffiziente Technik zur Funktion der Blase von kleinen Tieren zu messen

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Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., et al. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

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Abstract

Protocol

Ein. Laboratory Animals

  1. Tiere (Mäuse, Ratten) in einem spezialisierten Tier-Anlage mit einer 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Wasser und Standard Futterpellets untergebracht. Sowohl Alter und Geschlecht der Tiere sind wichtige Parameter, die standardisiert sein sollte entsprechend den Bedürfnissen. Wir führen typischerweise Zystometrie in 10 - 12 Wochen alten weiblichen Tieren 5,6.
  2. Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Union Community Council Richtlinien durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission.

2. Anästhesie

  1. Isofluran-Narkose ist für die Durchführung kleiner chirurgischer Eingriffe verwendet, da es einfach zu dosieren aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit ist. Entsprechende Abgas Aufräumen ist notwendig, wenn mit Isofluran.
    1. Die Tiere werden in einer geschlossenen Box, mit Isofluran 5% in reinem Sauerstoff (1 l / min) begast platziert.
    2. Nach Induktion, Anästhesie an der entsprechenden l1 l / min Sauerstoff mit - 1 - 1,5% Isofluran evel wird durch eine kleine Maske (ein Schnitt 10 ml Spritze) um 0,8 gehalten wird.
  2. Bei Mäusen ist Urethannarkose während der funktionellen Aufnahmen (vgl. Infra) verwendet. Urethannarkose wird während der funktionellen Aufnahmen verwendet werden, da im Gegensatz zu den meisten anderen Anästhetika, die Mikturations Reflex wird durch diese Narkosemittel 4 unterdrückt. Urethan 1,2 g / kg Körpergewicht subkutan (sc) 60 min vor Beginn der Aufnahmen verabreicht. Gegebenenfalls kann die Dosis des Urethan für eine einwandfreie Anästhesie erhalten durch Verabreichen weitere Dosen (0,1 g / kg) subkutan titriert werden. Es sollte angemerkt werden, jedoch kann, dass zusätzliche Anästhesie verändern die Hohlraumbildung und damit die Effizienz Miktionsfrequenz 7,8. Daher sollten die zystometrischen Aufnahmen engmaschig überwacht werden und verworfen, wenn signifikante Abweichungen von der Steuerung Verhalten beobachtet werden. Anästhetika sollte nicht verabreicht, während sein TestVerbindungen angewendet werden, um Fehlinterpretationen der Daten zu vermeiden.

3. Chirurgische Verfahren - Blasenkatheter Implantation

  1. Chirurgische Instrumente werden in einem Autoklav vor Gebrauch sterilisiert. Shave den Bauch des Tieres, desinfizieren mit Ethanol 70% und eine Low Mittellinie Laparotomie, um die Blase freizulegen.
  2. Unter einem Operationsmikroskop, setzen Sie ein Tabaksbeutelnaht in der Blase Kuppel mit einem nicht-resorbierbaren, Monofilamentnahtmaterial (Größe 6-0).
  3. Durchführen einer kleinen Zystostomie (wir verwenden eine bevorzugt 18 G Nadel) innerhalb des Tabaksbeutelnaht und Einfügen eines PE 50 Katheters Polyethylen, mit einer kleinen Manschette am Ende (erhalten durch vorsichtiges Erhitzen des Schlauchs) durch dieses Loch. In unseren Händen haben dünnere Rohre (PE 10) eine höhere und variable Widerstand. Der Schlauch kann, indem es in einem Ethanol-Lösung 70% oder im Autoklaven sterilisiert desinfiziert werden. Vor der Implantation muss der Schlauch mit Kochsalzlösung gespült werden.
  4. Sichern Sie die Geldbörse strING um das Rohr mit einem Chirurgen Knoten. Ziehen des Katheters leicht nach außen, bis der glockenförmigen Spitze direkt unter dem Faden positioniert wird. Schieben Sie ein Stück 18 G-Katheter in Richtung der Naht zu verhindern undicht.
  5. Infuse ein kleines Volumen von Kochsalzlösung (100 - 200 ul) vorsichtig auf Lecks überprüfen. Wenn Undichtigkeiten vorhanden sind, sollte eine zusätzliche Naht gelegt werden.
  6. Schließen der Bauchmuskulatur mit monofilen Fäden, so dass ein Durchgang für den Katheter in den oberen Teil des Schnittes.
  7. Tunnel das Rohr zum interskapularen Bereich unter Verwendung einer hohlen Metallstange, wodurch verhindert wird, die Tiere, um das Rohr während des Experiments zu beißen.
  8. Die Haut wird geschlossen mit nicht-resorbierbaren, monofilen Fäden. Die implantierten Katheter mit Kochsalzlösung gespült, um die Durchlässigkeit zu überprüfen.
  9. Bevor die Tiere erwachen, sind Analgetika subkutan (Buprenorphin, 0,05 mg / kg) angegeben.

4. Setup und Zystometrie

  1. Abhängig von der experimentellen questiauf (und die Arten verwendet) Zystometrie in wach (Zurückhaltung oder Ungebundenheit) oder Urethan-narkotisierten Tieren durchgeführt. Während Zystometrie ist durchaus möglich in wachen Ratten, die bleiben in einem verhaltenen Umfeld ruhig neigen, wir führen in der Regel Zystometrie unter Urethannarkose (1,2 mg / kg, subkutan) bei der Verwendung von Mäusen 3,5,6,9.
  2. An narkotisierten Mäusen, Körpertemperatur wird ständig überwacht und bei 36,5 ° C ± 0,2 ° C mit Hilfe eines Temperaturfühlers und einer Wärmelampe.
  3. Das Set-up wird vor jedem Versuch nach den Anweisungen des Herstellers kalibriert.
  4. Die implantierte Katheter wird durch einen Luer-Stichleitung zu einem 3-Wege-Hahn, der mit dem Druckwandler (Edwards Lifesciences) auf einer Seite und einer Infusionspumpe auf der anderen (Harvard Apparatus) verbunden ist. Der Druckwandler über einen Verstärker (78534c Monitor, Hewlett Packard) mit dem Datenerfassungssystem (DI-730-USB, DATAQ Instrumente) und eines Co verbundenmputer. WinDaq / Lite-Software können für die Aufnahme verwendet werden.
  5. Infusionspumpe gestartet, so dass die Infusion von Kochsalzlösung oder PBS bei beispielsweise 100 pl / min (bei Ratten) oder 20 ul / min (an Mäusen). Als solche ist die Blase wird bei einer konstanten Rate gefüllt werden, während die intravesikale Druck aufgezeichnet ist.
  6. Abbildung 5 zeigt eine typische Druck Spur: Während Flüssigkeitsinfusion, gibt es einen langsamen Druckaufbau in der Blase, bis ein bestimmtes Volumen / Druck erreicht ist, der Miktion Schwelle. Sobald dies erreicht ist, wird die Blase Kontrahierungszwang und anschließend das Urinsphinkter öffnet, um den Durchtritt von Urin durch die Harnröhre. Als solche, die Blase entleert ist, wird die Kontraktion zu stoppen, und der Druck wird wieder fallen zum "basal"-Pegel.
  7. Da die Ratte in einem metabolischen Käfig und über einer digitalen Waage platziert ist, kann das Volumen ungültig gleichzeitig gemessen werden, die Informationen über die vakuolenhaltige Volumen. Aufgrund der geringen ungültig Bände mice, kann es sehr schwierig sein unter Verwendung dieses Systems. Deshalb erlischt Volumen bestimmt mit kleinen Filterpapiere vor und nach Miktion gewogen.
  8. Typischerweise lassen wir das System für 30 Minuten, gefolgt von einer Aufnahme von 30 min gefolgt äquilibrieren. Dann können Medikamente systemisch oder intravesikal verabreicht werden und weitere 30 min aufgezeichnet.
  9. Die aufgezeichneten Daten können als. Csv-Dateien, die in eine spezielle Software für die quantitative Analyse importiert werden können exportiert werden. Wir verwenden in der Regel Origin (OriginLab Corporation, MA, USA).
  10. Nach Experimenten werden die Tiere durch Genickbruch (Mäuse) oder CO 2 Intoxikation (Ratten) geopfert.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1
Abbildung 1. Laparotomie Überblick. A) Setzen Sie die Ratte in der Rückenlage. B) Rasur und antiseptisch Vorbereitung der OP-Gebiet. C) Inzision der Haut. D) Incision of die Bauchmuskeln und Blase Exposition.

Abbildung 2
Abbildung 2. A Tabaksbeutelnaht.

Abbildung 3
Abbildung 3. Catheter Implantation.

Abbildung 4
Abbildung 4. Tunnelling des Katheters.

Beispiele für Druckmessungen während intravesikale Perfusion von Salzlösung in einer bewussten Ratte und einer narkotisierten Maus sind in Abbildung 5 dargestellt. Mehrere Parameter können aus dem Drucksignal (zB die intercontractile Intervall, das Basisdruck und dem Schwellendruck) extrahiert werden. Für eine umfassende Beschreibung dieser Parameter finden Sie Andersson et al. (Ref 4) und Yoshiyama et al. ( ref 10).

Wir haben vor kurzem Zystometrie verwendet, um die molekularen Targets von Senföl (MO), eine sehr reaktive Verbindung, die schon lange in experimentellen Modellen der Entzündung und Hyperalgesie der viszeralen Organe wie Harnblase 11,12 identifizieren. Intravesikale Infusion von 10 mM MO induziert einen starken Anstieg in der Blasenentleerung Frequenz (Abnahme der intercontractile Intervall) in Wildtyp-Mäusen (6A, B) und eine Abnahme der für nichtig erklärten Band 6. Interessanterweise induzierte MO ähnliche Veränderungen in defizienten Mäusen der MO-Rezeptor TRPA1. Im Gegensatz dazu induzierte MO viel schwächer Veränderungen in cystometrischen Parameter in TRPV1 KO Mäusen als in WT Mäusen und war ohne Wirkung Trpa1/Trpv1 KO-Mäusen. Zusammen mit Messungen der Freisetzung des Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP) 6 zeigen diese Daten zeigen, dass TRPV1 kann eine wichtige Rolle bei viszeralen Reizung durch MO induzierte spielen.

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Abbildung 5. Repräsentative Spuren intravesikale Druck in einem bewussten weiblichen Ratte (A) und in einem narkotisierten weiblichen Maus (B) aufgezeichnet. Der niedrigste Druck wird als "Baseline Druck" (rote Pfeile) definiert. Der Druck am Ende der Füllphase ist mit blauen Pfeilen markiert. Das Volumen der Flüssigkeit zwischen diesen Punkten, durch die Druckdifferenz geteilt, infundiert ermöglicht die Berechnung der Einhaltung der Blasenwand (Compliance = infundierten Volumens / (Druckschwelle -. Basisdruck) Die "intercontractile Intervall" (ICI) ist die Zeit zwischen zwei voiding Kontraktionen.

Abbildung 6
Abbildung 6. Auswirkungen von intravesikale Anwendung von Senföl auf dem Zystometrie Muster in Wildtyp und TRPA1, TRPV1 und Trpa1/Trpv1 Knockout-Mäusen.(A) Repräsentative Beispiele für intravesikale Druckänderungen in WT, TRPA1 KO, TRPV1 KO und Trpa1/Trpv1 KO-Mäuse in Reaktion auf Infusion von Kochsalzlösung und 10 mM MO aufgezeichnet. (B) Zeitlicher Verlauf der durchschnittlichen sofortige Entleerung Frequenz vor und während intravesikale Infusion von MO. Bei allen Mäusen, wurden die Daten auf die durchschnittliche Frequenz während Kochsalzlösungsinfusion erhaltenen normalisiert. Diese Daten werden von Everaerts et al. (Ref 6) angepasst, mit Genehmigung von Elsevier.

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Discussion

Die Zystometrie hier vorgestellte Technik ermöglicht die Durchführung in vivo Messungen der Blasenfunktion in Tiermodellen. Ratten sind wahrscheinlich die am häufigsten verwendete Tiermodell. Mäuse sind schwieriger zu handhaben, bieten aber den Vorteil der Verwendung genmanipulierter Tiere. Wegen der technischen Schwierigkeiten bei der Verwendung bewusste Mäuse, die sehr aktiv zu sein, was zu Lockerung der implantierten Katheter und Veränderungen in den intra-abdominalen Druck, die intravesikale Druck beeinflussen können dazu neigen, empfehlen wir, um sie betäubt mit Urethan während der gesamten Zystometrie Protokoll. Natürlich sind die Vorteile von sedierten Mäusen, sollte gegen die Auswirkungen der Anästhetika abgewogen werden. Als solche können Urethan haben einen signifikanten Einfluss auf Post-Entleerung Restvolumen 7,8. Wir haben daher warten, bis wir ein stabiles Maß an Anästhesie, bevor wir unsere Aufnahmen und Interventionen beginnen.

Forscher sollten ter Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Nagetieren Miktion 13. Außerdem ist das Alter der Tiere von großer Bedeutung. Wir führen Zystometrie bei Tieren, die 10 sind - 12 Wochen alt. Alle Versuche sollten in einer ruhigen Umgebung durchgeführt werden, insbesondere bei Verwendung wachen Tieren. Eine Reihe von Infusionsraten für unsere Tiermodellen beschrieben worden. Wir verwenden in der Regel Infusionsraten von 20 ul / min für Mäuse und 100 ul / min für Ratten.

Wie oben erwähnt, unterscheiden Miktion bei Menschen und Nagetieren deutlich. Zum Beispiel ist ATP ein wesentlicher Faktor für die Detrusorkontraktion bei Mäusen und Ratten, während bei Menschen, die die Kontraktion der Blase, die unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich durch Acetylcholin 4 vermittelt. Allerdings sind die Möglichkeiten zur invasiven Messungen, die in der Regel unerschwinglich im klinischen Kontext und der Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren durchführen, ermöglichen die Erkundung der aktuellen Grenzen der Blase Pathophysiologie eind Pharmakologie. In dieser Hinsicht haben bedeutende Fortschritte wurden kürzlich in der Aufklärung der Rolle von muskarinischen 14, 15 und Prostaglandin Adrenorezeptoren 16, Neuropeptiden 17, Ca 2 +-aktivierten K +-Kanälen 18 und TRP-Kanäle 3,5,6 erhalten.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der belgischen Bundesregierung (IUAP P6/28), der Research Foundation-Flandern (FWO) (G.0565.07 und G.0686.09), der Astellas European Foundation Award 2009 und dem Research Council der KU Leuven unterstützt (GOA 2009/07, EF/95/010 und PFV/10/006). PU und wir sind Doktoranden der Research Foundation-Flanders (FWO). MB ist ein Marie-Curie-Stipendiat. DDR eine grundlegende-klinischen Stipendiat der FWO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

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References

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