'सिंगल वायरस जीनोमिक्स' का उपयोग कर एकल virions के अलगाव और जीनोम विश्लेषण

Immunology and Infection

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Summary

सिंगल वायरस जीनोमिक्स (एसवीजी) एकल virons के जीनोम को अलग करने और बढ़ाना करने के लिए एक विधि है. एक मिश्रित संयोजन के वायरल निलंबन जिससे विरिअन पर कब्जा करने और बहाव के प्रसंस्करण के दौरान जीनोम कर्तन को कम करने, agarose युक्त असतत कुओं के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर प्रवाह का उपयोग कर हल कर रहे हैं. पूरे जीनोम प्रवर्धन अनुक्रमण के लिए उपयुक्त है कि जीनोमिक सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) का उपयोग कर हासिल की है.

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Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).

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Abstract

एक माइक्रोबियल कोशिकाओं के पूरे जीनोम प्रवर्धन और अनुक्रमण खेती 1-3 की आवश्यकता के बिना जीनोमिक लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है. सर्वव्यापक और हमारे ग्रह 4 पर सबसे अनेक संस्थाओं और सभी प्रकार के वातावरण 5 में महत्वपूर्ण हैं जो वायरस, समान दृष्टिकोण के माध्यम से पता चला जाना अभी बाकी है. यहाँ हम 'सिंगल वायरस जीनोमिक्स' (एसवीजी) नामक एक virions की जीनोम अलग और निस्र्पक के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन है. एसवीजी बाद अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है कि उच्च आणविक वजन जीनोमिक डीएनए (gDNA) प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत वायरस और पूरे जीनोम प्रवर्धन अलग करने के लिए प्रवाह cytometry का इस्तेमाल करता है.

Protocol

1. वायरल निलंबन की तैयारी

प्रवाह के माध्यम से एकल virions की अलगाव से पहले, unfixed वायरल निलंबन तैयार करते हैं.

  1. यकीन है कि अंतिम वायरल निलंबन बनाने के पहले से स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग वायरल कणों को अलग से 0.1 में निहित है माइक्रोन फ़िल्टर्ड ते (Tris-EDTA, पीएच 8). अन्य तरीकों का उपयोग करें कि रासायनिक flocculation 7 विकसित किया गया है, हालांकि हम दृष्टिकोण स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (TFF) का उपयोग 6 सलाह देते हैं.
  2. जैसे epifluorescence के 8-10 या प्रवाह cytometry 11,12 उपयोग कर स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग कर वायरल कणों की गणना करें.
  3. दो Eppendorf ट्यूबों (अंतिम मात्रा 1,000 μl होने की सिफारिश की है) में विभाज्य वायरल निलंबन.

2. फ्लो

  1. एक कस्टम आगे तितर बितर पीएमटी (एफएससी पीएमटी) के साथ सुसज्जित बी.डी. FACSAria द्वितीय प्रवाह cytometer का उपयोग कर वायरस सॉर्ट करने के लिए, 0.1 में वायरल कणों पतला ते, पीएच 8 माइक्रोन फ़िल्टर्ड.0 200 घटनाओं सेकंड -1 की एक घटना दर के लिए एक उपयुक्त अनुमापांक को.
  2. संकेत करने वाली शोर राशन अधिकतम करने के लिए थ्रेसहोल्ड, जैसे सेट करें. टी -4 और लैम्ब्डा फेज कणों निम्नलिखित युक्त एक मिश्रित संयोजन के लिए सिफारिश कर रहे हैं: एफएससी पी एम टी 1000 और एसएससी में 200 में.
  3. केवल 1 युक्त "खाली" नमूने) 0.1 माइक्रोन फ़िल्टर्ड ते और 2) 1e-4 में 0.1 माइक्रोन फ़िल्टर्ड ते और SybrGreen1 शेयर के कमजोर पड़ने (10,000 एक्स) के 100 μl चलाएँ.
  4. दाग वायरल निलंबन (शेयर के 1e-4 कमजोर पड़ने पर SybrGreen1), 5000 की घटनाओं के प्रत्येक के एक कुल को वायरल कणों द्वारा पीछा पृष्ठभूमि का आकलन करने के लिए बेदाग वायरल निलंबन के एक छोटे से विभाज्य (100 μl की सिफारिश की है), भागो. इस तरह से पहले, यदि आवश्यक हो, एकाग्रता की जांच और छँटाई फाटकों को समायोजित करने के लिए है. हम वायरल कणों के बीच में एक तंग गेट की सलाह देते हैं. इसके अलावा, द्वार पैदा करने के लिए हम SYBR ग्रीन और FSC पीएमटी साजिश का उपयोग करें.
  5. 1% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) के 5 μl जोड़ें agarose (TBE बफर में) प्रत्येक को 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडाअच्छी तरह से एक polytetrafluoroethylene (PTFE) खुर्दबीन स्लाइड पर (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान).
  6. क्रमबद्ध वायरल कणों पर कब्जा करने के लिए प्रवाह cytometer में PTFE खुर्दबीन स्लाइड लोड.
  7. सीधे एलएमपी agarose के साथ PTFE स्लाइड पर SYBR हरी दाग ​​वायरल कणों की तरह शुरू करो. हम लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CSLM) के दौरान वायरस की गहराई का पता लगाने में सहायता करने के लिए कुछ कुओं में 10 या अधिक घटनाओं (वायरल कणों) छँटाई की सलाह देते हैं.
  8. छंटाई के पूरा होने पर, प्रवाह cytometer से स्लाइड हटाने और जोड़ने के 5 μl अधिक एलएमपी agarose इस प्रकार वायरल कण (ओं) को एम्बेड, एक अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया.

3. Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एकल virions Visualizing

एक भी विरिअन वांछित है प्रत्येक अच्छी तरह से एक व्यक्ति के वायरस होते हैं, तब का निर्धारण आवश्यक है और CLSM केवल एक कण मौजूद है और कि यह पुष्टि करने के लिए 3 डी में एम्बेडेड विरिअन (ओं) कल्पना करने के लिए जरूरी है कि कई वायरसएक दूसरे के ऊपर खड़ी नहीं कर रहे हैं.

  1. तरंग दैर्ध्य 488 एनएम उत्तेजना को माइक्रोस्कोप लेजर सेट करें.
  2. एक 63X लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य का उपयोग एम्बेडेड वायरल कणों छवि.

4. पूरे जीनोम प्रवर्धन

  1. एक वायरस के साथ कुओं CLSM के साथ की पहचान कर रहे हैं, एक बार agarose (सीटू) के भीतर एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) का उपयोग करते हुए पूरे जीनोम प्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं.
  2. डीएनए संदूषण शुरू करने की संभावना कम करने के लिए, स्लाइड से वांछित agarose 'मोती' को हटाने और एक बाँझ पीसीआर ट्यूब में रखा. बाँझ चिमटी और / या इस कदम के लिए धार की एक जोड़ी का उपयोग करें.
  3. सीटू एक thermocycler की गर्मी ब्लॉक में 3 मिनट के लिए (94 डिग्री सेल्सियस) गर्मी का उपयोग करने में वायरल कण lyse.
  4. निम्नलिखित संशोधनों के साथ एमडीए प्रतिक्रिया निम्नलिखित निर्माता की सिफारिशों (GenomiPhi हरियाणा किट, जीई हेल्थकेयर) करें
    1. नमूना और प्रतिक्रिया buf की मात्रा कम करें30 में 11.25 μl और सेते फर्स ° अविशिष्ट प्रवर्धन कम करने के लिए 2 घंटे की एक अधिकतम के लिए सी.
  5. एक 1.7 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब जीनोमिक डीएनए (gDNA) के हस्तांतरण से परिलक्षित जीनोमिक सामग्री को शुद्ध और 1/10 मात्रा TBE बफर में 3 एम सोडियम एसीटेट (NaOAc) (एक ही बफर एलएमपी agarose तैयार करने में प्रयोग किया जाता है) में जोड़ें.
  6. 55 में जगह नमूना (ओं) डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए agarose भंग करने के लिए.
  7. 42 ट्यूब (ओं) हटो डिग्री सेल्सियस एंजाइम जोड़ने से पहले तापमान को कम करने के लिए.
  8. प्रत्येक ट्यूब और 2 घंटे के लिए सेते β-agarase 2 इकाइयों में जोड़ें.
  9. ट्यूब के लिए एक बफर संतृप्त फिनोल समाधान के 1 मात्रा जोड़ें, सख्ती मिश्रण और 15 मिनट के लिए 3500 XG पर अपकेंद्रित्र. एक नया 1.7 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब सतह पर तैरनेवाला युक्त डीएनए स्थानांतरण.
  10. Glycoblue की 100% isopropanol और 1μl के एक मात्रा में जोड़ें. Inverting ट्यूब द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  11. 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 28,000 XG पर अपकेंद्रित्र. छानना isopropanol गोली परेशान नहीं सुनिश्चित कर रही है. 70% etha के 150 μl जोड़ेंप्रत्येक ट्यूब nol. 10 मिनट के लिए 28,000 XG और आरटी पर स्पिन. इथेनॉल छानना, हवा डीएनए गोली सूखी और ते बफर का एक उचित मात्रा में डीएनए resuspend.
  12. हम निम्नलिखित संशोधनों के साथ कदम 4.4-4.9 दोहरा सलाह देते हैं. 3-5 दोहराने एमडीए प्रतिक्रियाओं सेट अप और 1 घंटे के लिए 30 में ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस कम. वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 95-100% इथेनॉल का उपयोग शुद्धि और वेग का पालन पूल नमूनों.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 एसवीजी प्रक्रिया का सार. इन विधियों अनुक्रमण के लिए पर्याप्त हैं कि gDNA की मात्रा प्राप्त करने के लिए एमडीए द्वारा पीछा एक मिश्रित संयोजन से एक virions अलग करने के लिए agarose युक्त PTFE खुर्दबीन स्लाइड पर वायरल कणों को सॉर्ट करने के लिए प्रवाह का उपयोग करें.

एक सबूत की अवधारणा के रूप में, जीवाणुभोजी लैम्ब्डा और टी -4 मिलाया गया और एसवीजी प्रक्रिया 11 के अधीन है. Virions agarose, CLSM वा में कब्जा कर लिया और एम्बेडेड थे एक बारएस कल्पना और एक भी विरिअन प्राप्त हुई थी कि पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया;. परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है एक बार एक virions साथ कुओं की पहचान की गई है, वे gDNA की एमडीए के लिए चयन किया गया था. हम तो टी -4 और पृथक विरिअन, चित्रा 3. की पहचान करने के लिए लैम्ब्डा एक अलग फेज लैम्ब्डा जीनोम अनुक्रमण के लिए चुना गया था के लिए मल्टीप्लेक्स पीसीआर विशिष्ट प्रयोग किया जाता है.

जीनोम अनुक्रमण एसवीजी का उपयोग कर प्राप्त कवरेज के स्तर की पहचान करने के लिए मानचित्रण संदर्भ के लिए किए गए 454-टाइटेनियम प्रौद्योगिकी और अनुक्रमण पढ़ता उपयोग किया गया था. चित्रा 4 से पता चलता है कि लगभग पूरे लैम्ब्डा जीनोम (पहले 5 बीपी के अपवाद के साथ) बरामद किया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक मिश्रित संयोजन युक्त एसवीजी कार्यप्रणाली. वायरल निलंबन तो एस रहे हैं कि प्रवाह के माध्यम से एक वायरस कणों को कम कर रहे हैंव्यक्तिगत agarose "मोती" पर orted. वायरस agarose पोस्ट प्रवाह cytometric छँटाई के एक अतिरिक्त परत के साथ overlaying द्वारा agarose मनका के भीतर एम्बेडेड है. अन्त में, पूरे जीनोम प्रवर्धन बगल में किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. लेजर confocal एक agarose मनका में एम्बेडेड एक क्रमबद्ध वायरल कण की माइक्रोग्राफ स्कैनिंग. एक agarose मनका के भीतर एक Sybr ग्रीन मैं से सना हुआ वायरल कण का एक तीन) आयामी पुनर्निर्माण. इनसेट: पृथक वायरल कण की उच्च वृद्धि एक agarose मनका भीतर दाग एक वायरल कण के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति की बी) प्रोफ़ाइल साजिश..

चित्रा 3
चित्रा 3. पीसीआर का उपयोग जीवाणुभोजी पहचान. ए) </ मजबूत> मल्टीप्लेक्स पीसीआर जीनोटाइप, लेन करने के लिए टी -4 और लैम्ब्डा विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग: 1. TrackIt 1 केबी प्लस सीढ़ी (Invitrogen), 2. लैम्ब्डा इंटिग्रेस (750 बीपी), 3. टी -4 प्रमुख capsid प्रोटीन (1,050 बीपी), 4. . 1: लैम्ब्डा इंटिग्रेस और टी -4 प्रमुख capsid प्रोटीन का मिक्स बी) के अतिरिक्त स्थलों के साथ बाद में लैम्ब्डा विशिष्ट पीसीआर आगे फेज जीनोम अलगाव, लेन पुष्टि करने के लिए. लैम्ब्डा इंटिग्रेस (750 बीपी), 2. लैम्ब्डा repressor (356 बीपी) 3. लैम्ब्डा sie (superinfection बहिष्कार) (456 बीपी) 4. TrackIt 1 केबी प्लस सीढ़ी (Invitrogen) के.

चित्रा 4
4 चित्रा. लैम्ब्डा जीनोम विशेषताओं और कवरेज. ए) जीसी साजिश, बी) लैम्ब्डा के जीनोम मानचित्र (से अनुकूलित http://img.jgi.doe.gov ), और सी) एसवीजी की मैपिंग संदर्भ जीवाणुभोजी लैम्ब्डा को पढ़ता है, x-अक्ष है जीनोम की स्थिति, फिरxis% कवरेज है.

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Discussion

एसवीजी दृष्टिकोण जब आवेदन महत्वपूर्ण कारकों की एक संख्या को ध्यान में रखा जाना चाहिए. जीनोटाइपिंग, सबूत की अवधारणा प्रयोग 13 के दौरान प्रदर्शन किया गया था, के रूप में संरक्षित प्राइमरों सभी वायरल समूहों में उपलब्ध नहीं हैं, के रूप में पर्यावरण या अज्ञात आइसोलेट्स के लिए एक मान्य विकल्प नहीं है. इसके अलावा, पृष्ठभूमि डीएनए संश्लेषण या अविशिष्ट प्रवर्धन सामान्यतः एमडीए प्रतिक्रिया 14 का उपयोग कर प्रवर्धन दौरान सूचना दी है. अविशिष्ट प्रवर्धन प्रतिक्रिया अभिकर्मकों और / या प्रतिक्रिया मिश्रण के भीतर यादृच्छिक hexamers से प्रवर्धन सक्षम बनाता है एक तंत्र के माध्यम से उभरते डीएनए दूषित करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है. वायरल संयोजन के साथ काम करते हैं, को प्राथमिकता (कारण कण में महत्वपूर्ण अंतर (सेल) का आकार और जीनोमिक डीएनए सामग्री का एक परिणाम के रूप में एक बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए विरोध के रूप में टेम्पलेट वायरल डीएनए की कम मात्रा को परिलक्षित अविशिष्ट DNAs के एक उच्च संभावना शायद वहाँ है 25-100 एनएम, वायरस के लिए ~ 1.5 fg, के रूप में0.2-1.5 उम करने का विरोध किया, बैक्टीरिया के लिए ~ 14 FG). DNase मैं, CLSM का उपयोग कर agarose मोती युक्त वायरस की परीक्षा, एमडीए ऊष्मायन समय की कमी के साथ वायरल assemblages के उपचार और (यानी के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के साथ सक्षम है अनुक्रमण गहराई बढ़ा: निम्न विधियों अविशिष्ट प्रवर्धन के स्तर को कम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं 454-टाइटेनियम और Illumina की तरह).

पर्यावरण के नमूने पर एसवीजी प्रदर्शन, अनुकूलित डी नोवो विधानसभा पूर्ण या लगभग पूरा जीनोम अनुक्रम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. हम अनावश्यक कम करने से पहले विधानसभा के लिए अधिक से अधिक कवरेज 13 प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि पुस्तकें मिल गया है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान अपनी अंतर्दृष्टि और सलाह के लिए केन Nealson धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X TE buffer Invitrogen 12090-015
Buffer-saturated Phenol Invitrogen 15513-039
GenomiPhi HY kit GE Healthcare 25-6600-22
Glycoblue Invitrogen AM9516 15 mg/ml
LMP agarose Invitrogen 16520100
PTFE microscope slide Electron Microscopy Sciences 63430-04 24 well, 4 mm Diameter
SybrGreen Invitrogen S7585 10,000X
β-agarase New England Biolabs M0392S

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References

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